Введение к работе
Актуальность темы диссертации. В генетических и в селекционных исследованиях важнейших сельскохозяйственных культур растений существует ряд проблем, которые не могут быть решены традиционными методами, а требуют внедрения новых технологий, в основе которых лежат методы культуры клеток, органов и тканей in vitro.
Так, клеточная инженерия, основанная на слиянии изолированных протопластов, создала принципиально новый способ гибридизации растений - соматическую гибридизацию. Вовлечение в гибридизацию соматических клеток вместо половых позволило эффективно использовать генофонд вида, рода,- семейства, устранив ограничения традиционной половой гибридизации: нескрещиваемость отдаленных видов; стерильность ряда селекционных образцов, мутантов и гибридных линий; одиородительскос наследование цитоплазмагических детерминант в половом потомстве (Глеба, Сытник.1984; Kumar, Cocking,1987; Waara, Glimelius.1995). На основе соматических гибридов, синтезированы новые формы культурных растений, в селекционные программы вовлечены гибриды, обладающие ценными характеристиками (Helgeson и др., 1993;- Sjodin, Glimelius,1989; MolJers,-Wenzel,1992; Chen и др., 1999). Наряду с соматической гибридизацией, использование методов культуры in vitro изолированных зародышей, семяпочек, пыльников, позволяет получать уникальные формы растений. Помимо практического использования велико значение новых подходов для развития фундаментальных вопросов биотехнологии, генетики, физиология растений.
Возможности использования новых биотехнологий для широкого применения- еще далеко не реализованы. И прежде всего это связано с нерешенностью ряда проблем, к важнейшим из которых относится изменчивость растений-регенерантов, полученных из культуры клеток, и в :вязи с этим непредсказуемый характер экспрессии генетического материала
родительских видов у соматических гибридов. Для важнейших представителей семейства пасленовых - картофеля и томата-следующие направления не получили должного развития: (а).Ограниченность знаний об особенностях передачи генетического материала родительских видов соматическим гибридам и их потомству.' (б).Единичны примеры геномного анализа отдаленных соматических гибридов (Garriga Caldere и др., 1998 Parokonny и др.,1997). (в).Развитие клеточной и хромосомной инженерии видов родов Solarium и Lycopersicon ограничено слабой разработкой. и значительными методическими трудностями цитогенетического анализа гибридов, что обусловлено небольшим размером хромосом и низким уровнем кариотипической дифференциации данных видов, (г).Остаются далеко нереализованными возможности генетических и селекционных исследований культурного картофеля - высокогетерозиготной, тетраплоидной культуры. Наличие ди- и Моногаплоидных клонов культурного картофеля, обладающих более высоким уровнем гомоэиготности И более низким уровнем плоидности, не решает проблем внутривидовой гибридизации, так как большинство таких клонов стерильны.
Целью данной работы являлось изучение возможностей применения различных методов биотехнологии для эффективного использования генофонда видов родов Solatium и Lycopersicon; создание и всестороннее изучение гибридных форм различного уровня филогенетического родства; получение гибридов, перспективных для генетических и селекционных исследований, в том числе, обладающих устойчивостью к патогенам и важными агрономическими характеристиками. Исходя из поставленной цели, определены следующие задачи исследования:
1. Исследовать межвидовую и внутривидовую изменчивость по регенерационНой способности видов' картофеля и томата в системе изолированных протопластов. Отобрать генотипы с высоким корфогенетическим потенциалом для проведения экспериментов по соматической гибридизации.
-
Изучить возможности использования различных методов in vitro для получения модельных и селекционно-важных комбинаций соматических и половых гибридов картофеля и томатов. Исследовать возможности использования Методов соматической гибридизации, культуры изолированных зародышей, семяпочек и пыльников для изменения уровня плоидности и геномного состава, и получения фертильних форм гибридов.
-
Исследовать генетическую изменчивость растений, полученных с использованием методов in vitro на геномном и хромосомном уровнях; изучить характер связи между генетической и фенотипкческой изменчивостью созданных форм растений.
-
Получить фертильные формы и потомство соматических гибридов разного уровня филогенетического родства, в том числе гибриды.устойчнвые к патогенам. .
5. Изучить перспективы ннтрогрессии .чужеродного генетического
материала и характер взаимодействия геномов отдаленных, нескрещиваемых
видов у амфидиплоидов, полученных с помощью методов соматической
гибридизации видов: tuberosum, S. etuberosum, S. nigrum, L esculentum, и у
диплоидных половых гибридов томата и диких видов: 51 lycopersicoldes, L.
chilense, полученных через эмбрнокультуру и культуру семяпочек.
-
Определить возможность использования методов in situ гибридизации для: (а) идентификации Л, Е геномов картофеля, дикого вида S. nigrum, генома томата у отдаленных гибридов, (б) проведения геномного анализа гибридов и (в) идентификации хромосомных перестроек.
-
Изучить возможности применения методов клеточной инженерии для вовлечения во внутривидовую гибридизацию и в селекционный процесс стерильных дигаплоидных клонов культурного картофеля, обладающих хозяйственно-ценным признаками.
Научная новизна и практическая ценность полученных результатов. Впервые проведены исследования взаимодействия геномов отдаленных нескрегцяваемых видов родов Solanum н Lycopersicon на основе
комплексного анализа конъюгации хромосом, цитогенетической
стабильности, фертильности И скрещиваемости отдаленных соматических
гибридов. Впервые получены сведения о характере взаимодействия геномов
Е картофеля и томата; А и Е геномов видов картофеля. Проведен анализ
конъюгации гомеологичных хромосом гибридов. На основе методов-
геномной in situ гибридизации хромосом разработаны методические подходы
для идентификации геномного состава межвидовых и межродовых гибридов
родов Solatium и Lycopersicon, что имеет значение для дальнейшего развития
исследований по хромосомной инженерии этих видов.
Впервые синтезированы межродовые гибриды томата и дикорастущих
неклубненосных видов картофеля серии Elutferosq. гибриды S. tuberosum и S.
eluberosum; впервые получено половое потомство таких гибридов. Впервые
показана возможность получения диплоидных форм соматических гибридов
і томата. Впервые показано, что методы слияния' протопластов позволяют
преодолевать стерильность гибридных растений.
Показано, что методы соматической гибридизации индуцируют изменения на молекулярном, геномном, хромосомном уровнях (включая межвидовые транслокации), существенно расширяя генетическую изменчивость гибридного материала, что дает возможность отбирать ценные гибридные генотипы. Межвидовые соматические гибриды картофеля могут быть использованы для селекции на устойчивость к патогенам.
Продемонстрированы новые возможности соматической гибридизации для вовлечения в селекционный процесс стерильных дигашюидных клонов культурного картофеля. Впервые показано, что на основе соматической гибридизации стерильных дигаллоидов могут быть получены фертильные тетраплоидные внутривидовые соматические гибриды, в том числе Перспективные для селекции. Выявлен эффект гетерозиса по признаку урожайности у тетраплоидных (2n = 48) внутривидовых соматических гибридов картофеля. Прямую практическую значимость имеет разработка методических подходов по внутривидовой соматической гибридизации.
Выделены линии: дикого вида томата L chilense с высокой степенью скрещиваемости с культурным томатом; генотипы диких видов Solatium, обладающие высоким уровнем регенерационной способности в системе изолированных протопластов.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и представлены на различных научных конференциях, включая: III Всес. Конференцию "Экологическая генетика растений и животных" (Кишинев, 1987); съезде ВОГиС (Минск, 1992); Межд. Съезд-; по физиологии и биохимии растений (Ст.-Петербург, 1993); XII Intern. Congress on Sexual Plant Reproduction. Ohio, U.S.A. 1992; XV Intern. Botanical Congress, Japan, 1993; IV Intern. Solanaceae Conference, Australia, 1994; Intern. Symp. "Crop Protection", Belgium, 1995; German-Russian Cooperation in Biotechnology. Workshop IV, St.-Petersburg, Russia, І996; XIV EUCARPIA Congress, Finland, 1995; 13th (The Netherlands, 1996) и 14th (Italy, 1999) Triennial Conference of the. European Association for Potato Research - EAPR'98, 99;.VIIIth (Italy, 1994) и IX (Israel, 1998) Intern. Congress on Plant Tissue and Cell Culture - IAPTC; 1st (1994) и 2nd (1998) Intern. Symposium on PJant Biotechnology, Kyiv, Ukraine; Intern. Symposium "Current Topics.of Cytogenetics", Austria, 1997; Intern. Symposium "Breeding Research on Potatoes", Germany, 1998; "East-West Potato'99 Congress", Finland, 1999 и др.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. На основе использования комплекса методов биотехнологии (слияния протопластов, эмбриокультуры, культуры семяпочек и культуры изолированных пыльников гибридов) возможность создания новых форм растений - гибридов картофеля, томата различного уровня филогенетического родства, в том числе генетически стабильных, фертильних форм, обладающих селекционно-ценными характеристиками. ' 2. Соматическая гибридизация растений позволяет не только преодолевать барьеры нескрещиваемости, но ,и одновременно является эффективным методом индуцирования изменений на геномном, хромосомном,
молекулярном уровнях. Среди различных генетических изменений отдаленных гибридов практический интерес для интрогрессивной гибридизации могут представлять межгеномные транслокации. Данный механизм интеграции чужеродного генетического материала в геном культурных растений перспективен для гибридов между отдаленными, видами растений с отсутствием, либо очень низким уровнем конъюгации гомеологичных хромосом. Генетическая изменчивость гибридного материала позволяет отбирать перспективные генотипы с ценными свойствами.
З.СоматиЧеская гибридизация обуславливает возможность проведения геномного анализа, изучения степени совместимости и особенностей взаимодействия геномов отдаленных, нескрещиваемых видов растений.
4.С помощью методов слияния протопластов возможно вовлечение в гибридизационный процесс стерильных растений {дигаплоидов культурного картофеля; отдаленных гибридов) и получение на их основе фертильных форм, в том числе обладающих селекционно-ценными характеристиками.
Объем и структура работы. Работа изложена на^% страницах и состоит из введения, общего обзора литературы, 5-ти глав экспериментальной части, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 26 рисунками. Список-литературы насчитывает 380 наименований.