Введение к работе
Актуальность теми. В решении проблемы повышения урокайности сельскохозяйственных культур вазшую роль играет создание высококачественных сортов, устойчивых к патогенный микроорганизмам и экстремальный условиям окруаающей среды, В связи с этим особую актуальность приобретает разработка принципиально новых, высокоэффективных методов селекции с использованием достижений современной генетики и биотехнологии, в частности методов генетической трансформации.
Разработку методов введения экзогенной ДНК желательно 'вести
с использованием легко тестируемых признаков, позволяющих отби
рать трансформанты. Этому критерию отвечает признак, кодируемый
локусом waxy (wx ). Это - один из ферментов, участвующих в син
тезе крахмала, а, именно, уридинднфосфатглюкозилтрансфераза
(УДФГ трансфераза). УДФГ трансфераза является ключевым ферментом
в биосинтезе амилозы, откладываемой в клетках эндосперма и пыль
цевых зернах (Nelson, 1968,1978; Tsai , 1974; Bewley et.al,I985),
Нарушение биосинтеза амилозы в результате мутации по локусу wx
легко тестировать с помощью окраски молекулярным йодом. Удобст
во данной модели состоит также в том, что анализ моает бить про
изведен не только на эндосперме семян, но и на пыльцевых зернах.
Кроме того, в настоящее время локус wx клонирован (Shure et.al.,
1983; Kioegen et.al, I9B6; Ананьев и,др.,1986; Eohde et.al,1988),
что позволяет использовать в качества донорной ДНК рекомбинант-
ную плазииду, несущую полноразиерную последовательность этого
гена ячменя. '"' .
К настоящему времени в области генетической трансформации растений достигнуты впечатляющие результаты, разработан ряд высо-.коэффективных методов введения экзогенной ДНК. Однако, большинство однодольных растений, включая и важные в практическом отношении виды семейства злаковых в большинстве случаев трудно трансформировать с поыоцыо традиционных методов (невозможно, эа редкий исключением, инфицировать их агробактернями, пока еще не решены проблемы регенерации протопластов злакозых). Поэтому для введения чужеродных последовательностей в геном злаков часто используют два следующих метода: инъекция Д11К в ткани (Картелюй, др.,1У86;ое la Репа, 1986J и обработки пыльцы растворами вкзоген--ной ДНК (otha., I986;uertin et.al. , 1992; Чеоиоко», 1992). в"~
наших опытах по генетической трансформации ячменя мы применяли эти два метода.
При проведении экспериментов по введению экзогенной ДНК особое внимание следует уделить подбору сорта реципиента. Используя мутанты по локусу тех в качестве реципиентов, необходимо учитывать, что но данным ряда авторов ( Мс Clintock, 1948,1958; Nelson 1968; Eriksson , 1969) этот локус в некоторых сортах кукурузы генетически нестабилен, кроме того является излюбленной мишенью мобильных генетических элементов. Поэтому при подборе.сорта-реципиента необходимо убедиться, что уровень спонтанных реверсий по локусу wx к норме относительно низок. В противной случае, при идентификации трансгениых растений можно ошибочно принять за транс-форнантов реверсию к норме.
При проведении опытов по генетической трансформации необходимо иметь представление о судьбе экзогенной ДИК, попадающей в растительные ткани и клетки, и, учитывая наличие сильной нуклеаз-ной активности, найти способ защиты вводимой ДНК.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в создании на основе локуса wx модельной системы трансформации ячменя. В связи с этим, были поставлены следующие задачи:
"'I. Оценить имеющиеся в нашем распоряжении ряд сортов ячменя мутантних по локусу wx по признаку стабильности этой мутации и подобрать сорт реципиент.
-
Разработать способ отбора трансформантов при введении в кутамныо сорта клонированного гена *га ячменя. Введение ДНК провести методом инвзкцяи и методом нанесения пыльцы, замоченной в растворах ДНК в момент опыления.
-
Проследить судьбу экзогенной ДНК при введении в растение (т.е.быстроту и степень разрушения ее под действием растительных иуклеаз;. Определить способы ее защиты.
Научная новизна и практическая значимость работы. Кодифицированные нами существующие методики идентификации мутантов по wx с помощью окраски йодом пыльцевых зерен и разработанные методики окраски эндосперма позволяют использовать локус wx пак простой и удобный паркер в опытах по генетической трансформации. Предложено в качестве реципиента использовать сорт violaceum мутантний по, wx . і'азрао'отан способ введения экзогенной ДН.с в ячмень с номоцьо ліііьцсзнх трубок. Предложена искусственная питательная
среда для проращивания пыльцы ячменя. При использовании метода нанесения пыльци с ДИК на рыльце пестика наблюдалось увеличение нормальных по wx зерен с частотой 1,1$.
Впервые у ячменя обнаружена високая степень нестабильности по wx локусу. в изученных сортах японского происхождения частота реверсий составляла 10 - 10 . В Fg от скрещивания мутантов с нормой обнаружены мозаичные семена. На основе этих данных и данных рестршшюго анализа, выявившего иешзортовце различия в структуре лоїсуса, высказано предположение о наличии в области лоїсуса \& мобильных генетических элементов, усиление нестабильности по локусу WX наблюдалось при воздействии различными видами экзогенной ДНК. Вероятно, перемещения мобильных элементов,предположительно находящихся внутри или в окружении локуса, приводящее к усилению нестабильности может бить индуцирование экзогенным генетический материалом. Показано, что локус wx шано использовать как моле-кулярно-генетический маркер при гибридизации геномной ДНК различных сортов ячменя с клонированным геном wx как зондом.
Изучена нуклеазная активность ячменя с использованием оригинального метода - инкубации растительных тканей в растворе ДНК, Показано, что экзогенная ДНК при соприкосновении с растительным материалом разрушается в течении нескольких минут. Впервые предложен универсальный агент, позволяющий защитить экзогенную ДНК от воздействия растительных нуклеав - протеиназа К.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на 121 странице машинописного текста, включая 20 рисунков и 7 таблиц, Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, экспериментальной части, заключения, выводов и' списка литературы (12? литературных источников).
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на УІ Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва,1987); Всесоюзной конференция по биотехнологии злаковых культур (Алма-Ата, 1983), на семинарах в лаборатории молекулярной генетики и генетической инненерии ИОГеи РАН, на рвсши-> ренноы межлабораторноы семинаре ИОГек РАН (Москва,1994).