Введение к работе
Актуальность темы.
Изучение генома человека в силу его большого практического значения становится одной из важнейших задач современной биологии. Значительный вклад в мировые достижения по геному человека внесли работы, выполненные в рамках Российской национальной программы "Геном человека". Программа ставит задачи картирования и секвенирования генома человека, концентрируя основные усилия в этой области на 3, 13 и 19 хромосомах. Среди других важнейших задач - структурно-функциональное изучение генома, генотерагам и генодиагностика, компьютерный анализ секвенированных последовательностей генома.
Решение практически всех этих задач требует в качестве обязательного промежуточного этапа клонирование фрагментов геномной ДНК человека. Хотя различные вектора для создания геномных библиотек применяются уже давно и в них получены достаточно представительные библиотеки, задача создания библиотек геномной ДНК человека, полно и без искажений представляющих весь геном, продолжает оставаться актуальной. Постепенно накапливаются данные, свидетельствующие о непредставленноети отдельных последовательностей в широко распространненных геномных библиотеках. Проблемы, связанные с неклонируемостью или нестабильностью отдельных последовательностей геномной ДНК при клонировании, возникают также при реализации крупномасштабных сиквенсных проектов.
Одной из важнейших причин, препятствующих нормальному клонированию отдельных фрагментов геномной ДНК, считают наличие в них инвертированных повторов (Литтл, 1989). Трудности при клонировании таких последовательностей в обычных кольцевых векторах связаны с образованием ими аномальных вторичных структур в условиях сверхспирализовации (Slnden, 1994).
В связи с этим представляется перспективным создание линейного плазмидного вектора E.coll, не имеющего кольцевой еверхспи-рализованной формы и его применение для клонирования геномной ДНК эукариот. В качестве основы для создания такого вектора может быть использована единственная известная в настоящее время линейная плазмида E.coll - профаг умеренного бактериофага N15.
Данная работа выполнялась в рамках Российской программы "Геном человека".
- л.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы является изучение возможностей использования линейных плазмидных векторов E.coll для клонирования ДНК с инвертированными повторами (палиндромами) и геномной ДНК эукариот. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:
получение мини-плазмид на основе репликона бактериофага N15. Отбор линейной мини-плазмиды минимального размера.
конструирование вектора из выбранной мини-плазмиды и его характеристика: определение максимальной емкости, числа копий, зависимости эффективности трансформации от размера вставки и др.
клонирование исскуственных и природных палиндромов в линейном и в кольцевом векторе.
клонирование геномной ДНК человека в линейном и в кольцевом векторе.
анализ последовательностей геномной ДНК человека клонируемых только в линейном векторе, если таковые будут обнаружены.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В результате выполнения диссертационной работы создан линейный плазмидный вектор E.coli. Полученный вектор pN15L имеет ряд значительных преимуществ по сравнению с существующими векторами для клонирования относительно крупных фрагментов ДНК. Показано, что емкость вектора составляет по меньшей мере 50 тпн.
Важным достоинством вектора pN15L является. высокое число копий, около 250 на хромосому, причем при включении в него вставки общее количество плазмидной ДНК сохраняеея. Так, при размере вставки 48 тпн число копий составляет около 50 на хромосому, что значительно выше, чем в случае космидных векторов. Высокое число копий облегчает получение больших количеств рекомбинантнои ДНК и скрининг колоний методом гибридизации. Вектор pN15L может быть также использован для проведения крупномасштабного секвенирования вместо pUC или. Ы13.
В результате исследования клонирования различных искусственных и природных палиндромов в векторе pN15L и, для сравнения, в кольцевом векторе pUC19 сделан вывод, что линейный вектор позволяет успешно клонировать палиндромы, в различной степени подавляющие репликацию кольцевого вектора.
Один из важнейших результатов, имеющих наибольшее практичес-
- з -кое значение, получен при исследовании клонирования геномной ДНК человека. Было установлено, что около 5% фрагментов геномной ДНК человека могут быть успешно клонированы в линейном, но не в кольцевом векторе. Этот результат согласуется с известными данными о том, что около 1-5% космидных клонов, содержащих геномную ДНК человека, нестабильны. Таким образом, представляется перспективным применение вектора pN15L для клонирования последовательностей геномной ДНК, нестабильных или неклонируемых в космидных векторах.
Апробация работы.
материалы исследований по теме диссертации доложены на следующих российских и международных конференциях: "Геном челове-ка-96" (Москва, 1996), школе молодых ученых "Молекулярная биология и биоинженерия: новое поколение" (Черноголовка, 1997), конференции Центра "Биоинженерия" РАН (Москва, 1997), "Геном человека - 98" (Москва, 1998), шестой международной конференции "Р2, Р4 и родственные бактериофаги" (ФРГ, Берлин, 1998).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано шесть печатных работ.
Структура и объем работы.