Введение к работе
Актуальность темы. Белки семян культурных растений, используемые в питну человеком и животными непосредственно, а также после технологической обработки, составляют от 10% (злаки) до 40% (масличные культуры) сухого неса, причем около половины общего белка приходится на долю запасных белков. В большинстве случаев запасные белки имеют несбалансированный аминокислотный еогтав. Пролнмины, запасные белки злаков, бедны незаменимой аминокислотой - лизином. Введение дополнительных кодонов лизина в индивидуальные гены проламинов привело бы к синтезу белков, обогащенных лизином и улучшило бы кормовое и питательное качество зерна. Например, на сегодняшний день клонированы семь генов запасных белков ячменя, гордеицов. Метод олпгонуклеотиднаправлетшого мутагенеза позволяет производить точечные нуклеотидные замены и вводить добавочные кодоггы лизина ь кодирующуто последовательность гена. Так как изменение гена in vitro может сказаться на уровне экспрессии, биологических и химических свойствах кодируемого белка, система быстрой гетеролоппшой экспрессии генов гордсинов может выявить специфику синтеза модифицированного белка.
Разработка современных методов трансформации и регенерации растений злаков и бобовых позволят осуществлять перенос генетических конструкции в геном растения и целенаправленно изменять свойства растений уже в ближайшем будущем. Однако успешное манипулирование составом и композицией запасных белков невозможно без глубокого понимания механизмов регуляции генной экспрессии и клеточной биологии белка. Одним из способов решения этот) задачи является изучение экспрессии химерных генов. Использование химерных генов, созданных на основе генов гордеина и легумнна, позволит более детально изучать особенности процессов синтеза и запасания проламинов и глобулинов.
Цель работы.
-
Создание векторов для экспрессии гена гордеина В1 в Escherichia coli и клетках цианобактерии Synechocystis sp. РСС6803.
-
Изучение экспрессии гена гордеина В1 в бактериальных клетках.
-
Создание химерных генов на основе генов запасных белкои ячменя Hordeum vulgare L. и бобов Vicia faba L. - гордеина Bl и легумина В4.
-
Создание конструкций для изучения экспрессии химерных генов в растениях.
Научная ' новизна и практическая значимость работы. Сконструированы векторы для экспрессии гена гордеина В) в клетках бактерий под контролем /ас-промотора. Показан синтез гордеина в Escherichia coli и клетках цианобактерии Synechocystis sp. РСС6803. С помощью олигоігуклеотиднаправлешюго мутагенеза сконструированы химерные гены на основе генов гордеина В1 и легумина В4. Показана интеграция в геном табака химерного гена с кодирующей областью гена гордеина под контролем регуляторных последовательностей гена легумина.
Представленные в работе данные могут быть использованы для решения задачи улучшения питательной ценности запасных белков ячменя путем целенаправленного изменения их аминокислотного состава, а также путем экспрессии в траисгенных растениях ячменя генов запасных белков других растений с достаточным количеством лизина. Запасные белки ячменя H.vulgarc L. и бобов Vicia faba L. различаются по аминокислотному составу, в частности, гордеин В заметно богаче серу содержащими аминокислотами, легумин - лизином. Поэтому экспрессия химерных конструкций, состоящих из участков этих генов, в злаках и бобовых может повлиять па состав запасных белков семян.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Она изложена на 123 страницах, содержит 18 рисунков и одну таблицу.
Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1990; на Юбилейном симпозиуме "Genetic Research
and Education; current trends and the next fifty years", New Delhy, 1991; на IT Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений, Путино, 1993 и на проблемном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов", И О Ген РАН, Москва, 1996.