Введение к работе
Актуальность проблемы. Цианобактерии являются перспективными модельными объектам для изучения различных биологических процессов. По структуре клеточной оболочки и организации генома цианобактерии относятся к грамотрицателъным бактериям, тогда как строение фотосинтетического аппарата и способность к оксигенному фотосинтезу приближают их к высшим растениям. Швнобактерик являются, в перспективе, наиболее выгодными для биотехнологии продуцентами белка и ценных биологически активных соединений, поскольку не требуют органических источников питания и синтезируют все необходимые для жизнедеятельности вещества за счет фотосинтеза. Цианобактерии широко используются в исследованиях механизмов и генетического контроля азогфиксаыии, клеточной дифференцировки, радиоустойчивости, а также проблем, связанных с регуляцией действия генов, однако особый интерес к цианобактериям связан с изучением фотосинтеза. У растений и зукариотических водорослей генетическое изучение фотосинтеза затруднено из-за отсутствия эффективных систем генетического переноса, а также из-за сложных взаимодействий между хлоропластным и ядерным геномом в процессе формирования фэгосинтетического аппарата. Разработка простой модельной системы, позволяющей изучать фотосинтез и ряд связанных с ним процессов (например, развитие устойчивости к гербицидам - ингибиторам фотосинтеза) на прокариотических объектах, могла бы значительно повысить эффективность генетических исследований в этой области.
Возможности использования цианобактерии для расшифровки механизмов фундаментальных биологических процессов и создания шташов-продуцвнтов могут быть значительно расширены за счет методов генетической инженерии. К началу наших исследований (1980 г.) были разработаны методы генетической трансформации некоторых штаммов одноклеточных цианобактерии (SnestaKov, . Khuyen, 1970; Grlgorleva, Shestakov, 1976,1982) и обнаружены критические плазмиды цианобактерии (Van den Hcndel et al., 1979; Lau, Doolittle 1979; Frledberg. Seitffers. 1979). Эти работа открывали возможности для создания систем клонирования генов в-клетках цианобактерии и позволили нам приступить к разработке векторных систем для двух видов одноклеточных
цианобактерий: облигатно фотоавтотрофной цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 (Anacystls nidulans R2) и фзтогетеротрофной цианобактерий Synechocystls sp. РСС 6803.
Цель х задачи исследования. Целью работы было создание систем клонирования генов для цианобактерий A. nidulans R2 и Synechocystls эр. 6803 и использование этих систем для изучения генетического контроля фотосинтеза, устойчивости к гербицидам и экспрессии гетерологичных генов в клетках цианобактерий. В работе были поставлены следующие задачи:
-
Конструирование различных типов векторных плазмид для- А. nidulans R2 и Synechocystls sp. 6803 и анализ возможностей их использования для клонирования генов в клетках цианобактерий.
-
Клонирование гетерологичных генов (включая гены грамгологи-тельных бактерий я растений) в клетках цианобактерий и изучение их экспрессии.
-
Клонирование и молекулярный анализ генов, контролирупцих фотосинтез, с помощью коллекции дефектных по фотосинтезу мутантов цианобактерий;. идентификация мутаций, нарушающих способность клеток цианобактерий к фотосинтезу.
-
Клонирование и молекулярный анализ генов, определяющих устойчивость к нитрофэнольннм гербицидам и ингибитору фотосинтеза метронвдазолу; выяснение механизмов развития устойчивости к указанным ингибиторам.
-
Построение физической карты генома Synechocystls sp. 6803 и локализация на ней генов, контролирующих фотосинтез. ,
Научная новизна. Разработано новое направление генетики одноклеточных цианобактерий, связанное с использованием методологии генетической инженерии. Созданные в работе системы клонирования и анализа генов позволяют использозать циЕНобактерии как модельный объект для генетического изучения фотосинтеза, механизмов развития устойчивости к гербицидам и других фундаментальных биологических процессов, свойственных высшим растениям.
Впервые в клетках цианобактерий . клонированы гена а-амилазы из Bacillus amyloliqueraclens, эндоглшзиазы из целлюлолитнческого комплекса Clostridium thermocellum и В1 -гордеина из ячменя (Hordeum vulgare L.). и показана их экспрессия
Показано, что белки СР47, СР43 и цитохром Ь55Э, кодируемые генами рзЬВ, psbC и рзЬЕ/Г игравт важную роль в определении структуры и функции фотосистемы II. Установлена молекулярная природа ряда мутаций в генах psbB, psbC, рзЬЕ/Г, нарушающих функций фотосистемы II. Выявлен неизвестный ранее ген рзХ, кодирущий белок с молекулярной массой 46,7 кДа и необходимый для функционирования фотосистемы II. Показано, что ген psX имеет гомологии с ядерной ДНК растений.
Клонирован неизвестный ранее ген drgA, контролирухпий множественную устойчивость клеток Synechocystis sp. 68Q3 к метронкдазолу и нитрофенольным гербицидам. Устойчивость клеток цианобактерии к указанным ингибиторам связана с инактивацией продукта гена drgA - белка с молекулярной кассой 23,7 кДа. Ген drgA имеет гомологию с ядерной ДНК растений.
Впервые построена физическая карта и установлен размер хромосомы Synechocystis sp. 6803. На физической карте локализовано несколько генов, кодирующих белки фотосистемы II и фотосистемы I.
Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе новые данные о генетическом контроле фотосинтеза и устойчивости к ингибиторам способствуют более глубокому пониманию механизмов фотосинтеза и структурно-функциональной организации фотосинтетичвского аппарата, вносят существенный вклад в изучение проблемы развития устойчивости к гербицидам. Сконструированные в работе векторные плазмиды для A. nidulans R2 и Synechocystis sp. 6803, коллекции дефектных по фотосинтезу и устойчивых к ингибиторам мутантов переданы в ряд отечественных и зарубежных лабораторий, где ови используются в научно-исследовательских работах.
Полученные в настоящей работе рекомОинантные штаммы цианобактерии, несущие гетерологичные гены а-ачилазы, эндоглюканазы и В1 -гордеина могут служить хорошей основой для создания экономически выгодных штаммзв-продуцентов запасных белков и биологически актирных соединений.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуддены на V и VI Всесоюзном симпозиуме Молекулярные механизма генетических процессов (Москва, 1983, 1987 гг.), Всесоюзной конфзрєнцки Тене'Лілз и физиология микроорганизмов
-перспективных объектов биотехнологии (Пущино, 1984), IX и X Всесоюзном совещании по программе "Плазмида" (Москва, 1984, 1985 гг.), VII Съезда Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985 г.), Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1984, 1986), XIV Мевдународном микробиологическом конгрессе (Манчестер, Англия, 1986), Всесоюзной конференции "Физико-химическая биология и биотехнология фото-трофных микроорганизмов (Москва, 1987), 7 Съезде ВОГИС им. Н. И. Вавилова (Москва, 1987), Ломоносовских чтениях МГУ (1989 г.), Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино, 1991 г.), V, VI и VII Международном симпозиуме по фототрофныы прокариотам (Гриндельвальд, Швейцария, 1985 г.; Нордвикерхаут, Нидерланды, 1988 г.; Амерст, CffiA, 1991 г.), Российско-германском рабочем совещании по молекулярной биологии и биотехнологии растений (Москва, 1992 г.), II Российском симпозиуме "Ноше метода биотехнологии растений" (Пущино, 1
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, раздела "Материалы и метода", пяти глав экспериментальной части, заключения, основных выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 237 стр. машинописного текста, включают 58 рисунков и 29 таблиц. В списке литературы приведены ссылки на 285 работ.