Введение к работе
Актуальность проблемы. В связи с широким применением в сельском хозяйстве гербицидов - химических средств защита растений от сорняков - большое значение приобретают работы, направленные на исследование молекулярных механизмов их действия. Клонирование и молекулярный анализ генов, контролирующих устойчивость к гербицидам, является эффективным подходом для решения целого ряда прикладных и фундаментальных научных задач, таких как: изучение клеточных мишеней, на которые действуют гербициды; оценка экологической безопасности применяемых препаратов; целенаправленное создание гербицидов с заданным типом биологической активности, получение трансгенных с/х культур, устойчивых к гербицидам и др.
Исследование этих проблем на высших растениях затруднительно из-за сложности молекулярно-генетического анализа этих объектов. Удобной моделью для изучения генетического контроля устойчивости к гербицидам могут служить одноклеточные цианобактерии. Их фотосинтетический аппарат, многие метаболические системы и, как следствие, мишени действия гербицидов в значительной степени сходны с таковыми у высших растений. Прокариотический тип строения клетки цианобактерии, их способность к генетической трансформации, относительная простота получения мутантов позволяют клонировать и изучать гены устойчивости к гербицидам.
Из клеток цианобактерии клонированы гены устойчивости к триа-зиновым гербицидам (Golden, Haselkorn 1985; Gingrich et al., 1988); к нитрофенольшм гербицидам - иоксинилу и диносебу (Ajlani et al., 1989; Чеснавичене и др. 1994); к обесцвечивающим гербицидам -норфлуразону и дифунону (Chamovitz et al., 1990, 1991; Барцевич, Иестаков 1993).
В последние годы особое внимание уделяется изучению гербицидов - индукторов окислительного стресса, таких как паракват, ами-грол и т.п. Окислительный стресс возникает в результате образования активных форм кислорода вследствие "незаконного" переноса электро-юв от электрон-транспортных цепей на кислород. Активные формы отслорода разрушают клеточные мембраны, ДНК и белки, что приводит с гибели клеток. В защите клетки участвуют различные ферменты, шактивирующие токсичные радикалы, в том числе, супероксид дис-яутаза, аскорбат пероксидаза, глутатион редуктаза и др. (Bowler it al.,1992). Под действием параквата в клетках E.coli синтезируйся более восьмидесяти различных белков, функции которых в боль-шнстве случаев неизвестны (Jean et al., 1990). Обнаружены гены юхН, oxyR и др., принимащие участие в регуляции этого процесса
(Fahl et ai., 1994; Koh et al., 1996). Гербицид паракватингиби-
рует транспорт электронов на уровне фотосистемы I (Trebst 1987),
однако, о механизмах развития резистентности 'к.этому гербициду
известно еще очень мало. ,.; .. -. ,-,"
Цель работы. Данная работа посвящена клонированию и молекулярному анализу генов устойчивости к гербициду параквату у цианобакте-рии Synechocystis ер. рсс 6803. Основные задачи исследования:-
-
Получение паракват-резистентных. мутантов Synechocystis 6803.
-
Клонирование и идентификация генов, контролирующих устойчивость к параквату.
-
Определение молекулярной природы мутации, обуславливающей устойчивость к параквату.
Научная новизна и практическая ценность работы. Клонирован ген prqR, определяющий устойчивость к параквату у цианобакте-рий. Ген prqR кодирует белок, гомологичный регуляторам .транскрипции tetR-семейства. Идентифицирована миссенс-мутация, 'отвечающая за устойчивость к параквату и показано, что инсерционная инактивация гена prqR приводит к паракват-резистентности. Исследование систем, регулируемых геном prqR, открывает новые перспективы для создания сельскохозяйственных культур, устойчивых к окислительному стрессу.
Идентифицирован новый ген - ctpB, кодирующий неизвестную ранее протеазу, принадлежащую к семейству карбоксил-терминальных процес-сирующих протеаз. Показано, что функция белка ctpB тличается от функций"других протеаз этого семейства. Инсерционные мутанты по гену ctpB устойчивы к параквату и ингибитору сериновых протеаз -фенилметилсульфонил фториду, чувствительны к мембранотропным агентам - диметилсульфоксиду и новокаину, а также к глицерину. Полученные данные указывают на возможную роль ctpB-белка в функционировании клеточных мембран.
Результаты данной работы доложены на III Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1995г., а также на конференции "Автотрофные микроорганизмы". Москеэ, 1996г.
Структура и объем диссертации. Диссертация содержит семь разделов: 1) введение. 2) обзор литературы, посвященный главным образом молекулярным механизмам действия гербицидов, з) материалы и методы, 4) результаты и обсуждение. 5) заключение, 6) выводы. 7) список литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц. Список литературы включает наименований, в т.ч. на иностранных языках.