Введение к работе
Актуальность темы.
Актиномицеты рода Streptomyces являются микроорганизмами с четко дифференцированным жизненным циклом, включающим стадии полигеномного мицелия и гаплоидных спор. Осуществление программы жизненного цикла у стрептомицетов предполагает активирование и использование групп генов,, детерминирующих процессы первичного и вторичного метаболизма. Фенотипическими проявлениями вторичного метаболизма являются дифференциация коло.ний этих микроорганизмов и синтез биологически активных веществ.
Одна из групп биологически активных веществ - антибиотики, широко используется в хозяйственной деятельности человека.
В настоящее время особую актуальность в молекулярной генетике Streptomyces приобретает исследование механизмов, обеспечивающих дифференциальную" экспрессию генов первичного и вторичного метаболизма, а также- компонентов системы регуляции, принимающих участие в их переключении.
Штамм Streptomyces hyfjroscopicus АТСС 21705,- продуцент анти
биотика гербицида биалафоса является хорошей моделью для исследо
вания структурно-функциональной организации системы первичной
инициации и регуляции генов антибиотикообразования у'стрептомице
тов. . ' ' . , .
Цель работы и задачи исследования. ' .
Целью настоящей работы являлось исследование -механизмов специфической регуляции экспрессии генов биосинтеза антибиотика гербицида биалафоса в' штамме продуценте Streptomyces hygroscopicus АТСС 21705.
В соответствии с этой целью поставлены следующие задачи:
клонирование хромосомных детерминантов, обеспечивающих позитивную регуляцию генов биосинтеза биалафоса;
анализ функционирования'клонированных генов в гетерологич-ном штамме S.' lividans ТК54;
- разработка системы введения клонированных генов в штамм
S. hygroscopicus АТСС21705;
- изучение влияния клонированных генов на уровень устойчивости и биосинтеза биалафоса в штамме продуценте.
Научная новизна результатов.
- клонирован фрагмент размером 1.45 т. п. н. Хромосомной ДНК
S. hygroscopicus с геном ЬгрВ, осуществляющим позитивную регуляцию
гена устойчивости к биалафосу bar в модельном штамме S. lividans
ТК64;' ' . , .
- сконструирована челночная конъюгативная плазмида pVGTB24 и
осуществлен перенос пдаэмидных копий гена ЬгрВ в штамм продуцент
биалафоса S. hygroscopicus; показано, что в результате интеграции
этой плазмиды по гомологии с клонированным фрагментом происходит
снижение устойчивости эксконъюгангов S. hygroscopicus (pV8TB24) и
их антибиотической и продуктивности; теоретически рассмотрены ме
ханизмы функционирования ЬгрВ как регулятора кластера генов био
синтеза' антибиотика биалафоса;
- адаптирована методика межродовой . конъюгации Е. сої і -'
Streptomyces для передачи конъюгативных плазмид в промышленные
штаммы продуценты биалафоса (S/ hygroscopicus) и хлрртетгациклина
(S. aureofaciens);. / .'' .
- показана возможность конъюгативной передачи из Е. сої і ко
нъюгативных плазмид и.фагов Streptomyces в промышленно' важный
"штамм Rhodocoocus rhodochrous ИЗ, образующий основной фермент би
оконверсии акрилового нитрила в акриламид - нитрилазу;
- радаботан биологический метод качественного и количест
венного определения биалафоса и других веществ, 'обладаюшиХчтлута- :
минсинтетазной активностью, в т.ч. в культуральной жидкости мик-
роорганизмов! продуцентов; показано, что более низкая, биологичес-
кая активность мономерных аналогов глутаииновой. кислоты обуслов-.
лена специфичностью системы трансмембранного переноса этих соеди^
нений. ", '.
Научно-практическая значимость работы и использование полученных результатов.
Результаты, полученные в ходе настоящей работы, могут быть использованы для:
-
Изучения молекулярных механизмов взаимодействия продукта клонированного гена ЬгрВ с ДНК-мишеныа и инициации транскрипции регулона, ответственного за биосинтез биалафоса.
-
Конструирования векторов, способных интегрировать в хромосому, штаммов-реципиентов путем' гомологичной рекомбинации.
-
Межродового переноса конъюгативных плазмид из Е. сої і в промышленные штаммы Streptornyces и другие микроорганизмы семейства актиномицетов.
-
Качественного и количественного анализа соединений, обладающих антигдутаминсинтетазной активностью.
Апробация работы и публикации по теме исследований: Основные результаты работы были представлены к защите на заседании межлабораторного семинара подсекции "Генетика актиномицетов" института БНИИгенетикз от 24 июня 1993 г. Отдельные материалы докладывались на шести научных конференциях, в т. ч. трех международных. В общей сложности подготовлено к публикации ІЗ печатных работ (список представлен на 20 стр. автореферата).
Структура и объем работы.
Диссертация построена по традиционному' плану и содержит раз
делы: .введение, обзор литературы, материалы.и методы, результаты
экспериментов, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы
( наименований). ' -
Диссертация. содержит рисунков и таблиц.
Полный объем работы страниц.