Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время при создана» новых горбицидных препаратов, применяемых в сельском хозяйстве, большое внимание уделяется вопросам токсикологической и экологической безопасности. В связи с эта;,!, особое значение приобретают исследования, направленные па выяснение природы мишеней действия гербицидов з растительной клетке, на расшифровку молекулярных и генетических механизмов устойчивости к горбицидам, на "конструирование" гербицидов с заданным типом биологического действия. С другой стороны, гербициды, которые действуют в растительной клетке па определенную молекулярную мшень - важный шструмзнт при изучении механизма обмена веществ и гормональной регуляции метаболизма в растении. Поэтому, понимание молекулярного механизма действия гербицидов может быть чрезвычайно полезным при прогнозировании их биологической активности, а также при направленном ' создании резистентных к гербицидам сельскохозяйственных растений методами генной инженерии. Существенный вклад и разработку этих проблем вносит использование подходов и методов молекулярной генетики, с помощью которых можно наделять п спалисировать гены, отвотстввшше за рази^вптность к различным гербицидам, в том числе действующим и на аппарат фотосинтеза. Одпако, клонирование таїсих генов из растений яв-^ется трудной задачей, требующей длительных и сложных экспериментов. Удобными в генетическом отношении объектами для решения таких задач могут служить цианобактории, обладающие, как и растения, оксигшшш фотосинтезом. Более того, большинство" гербицидов, ннгибирупцих процессы и пути, свойственные только растениям (фотосинтез, биосинтез хлорофилла, биосинтез незаменимых аминокислот), являются летальными соединрниями и для цианобактерпй.
В работах, проведенных с цианобактериями, была изучена природа резистентности к диурону - гербициду класса зш. -щенных фенилмочевин, ингибирующему активность фотосистемы II. Было установлено, что резистентность к диурону определяется мутациями в гене рзЪА, приводящими к утрате способности белка D1 фотосистема II связывать гербицид (nolden, Навеїкогп, 1985; Robinson et al., 1987; Gleiter et al., 1990).
К числу гербицидов - "неклассических" ингибиторов фотосинтеза относятся диносеб (6-(сек-бутил)-2,4-дикитвофенол) и ДНОК (4.6-динитро-орто- крьзол), нитрофенолы соедипеш.:, блокирующие-
транспорт электронов и фотсфосфорилирование. Сведения о природа мишеней действия фэнольных гербицидов противоречивы» а механизмы развития резистентности растений к этим агентам не изучены.
У цианобактерии SyneohooyotiB 6803 были получены мутанты, устойчивые к диносебу и показана возможность передачи отого признака путем генетической трансформации (Кокшарова, Шестаков, 1990). Это. открывает возмоаности для клонирования гена, определяющего устойчивость цианобактерии к данному классу гербицидов. Изучение этого гена и его продукта позволит получить важную информацию о механизмах фитотоксического действия диносеба и расширит перспективы генно-инженерных работ по созданию трансгенных сельскохозяйственных растений, устойчивых к гербицидам.
Цель работы. Работа посвящеп клонированию и изучению гена, определяющего устойчивость цианобактерии Syneohooystis 6803 к фенолышм гербицидам - диносебу и ДНОК. В задачу исследования входило:
-
Выделение гена, контролирующего устойчивость к фенолышм гербицидам из геномного банка резистентных мутантов цианобактерии.
-
Определение нуклеотидной последовательности этого гена.
3. Нолекулярно-генетический анализ гена; локализация и
идентификация мутаций, приводящих к развитию устойчивости к
диносебу и ДНОК.
. 4. Изучение генетических и биохимических механизмов, обуславливающих устойчивость к фенолышм гербицидам у цианобактерии. >
Научная новизна и практическая ценность работы. Выделен новый, ранее неизвестный ген Org, кснтролирущий. устойчивость цианобактерии Syneohooystis 6803 к диносебу и ДНОК -. гербицидам класса нитрофенолов. Определена нуклеотидная последовательность гена и его мутантних копий; установлено, что ген drg кодирует белок с молекулярной массой 23.7 кДа. Устойчивость мутантов цианобактерии к диносебу и ДНОК обусловлена отсутствием активности этого белка. Таким образом, развитие резистентности к этим гербицидам отличается по своему молекулярному механизму от резистентности к гербицидам типа диурона, которые взаимодействуют с D1 белком фотосистемы II. Цолучешше результаты го-новому освещают проблему действия на фотосинтезируицие организмы гербицидов - ингибиторов фотосинтеза.
Клонированный ген может быть использован как зо,,д для выявления гомологичных генов у растеши, в качестве генетического маркера в векторах для цианобактерий и растений, а также для создания ганно-инжецерных конструкций с целью получения трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, применяемым в сельском хозяйстве.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного молекулярным механизмам действия гербицидов, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и'списка цитируемой литературы. Работа изложена на'108 стр. машинописного текста и содержит 18 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 211 наименований.