Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Повторяющиеся
последовательности ДНК представлены в геноме растений в количестве от нескольких десятков до нескольких тысяч копий. Они составляют до 70% генома ячменя и 75 % генома ржи и пшеницы [138, 240]. По структуре их разделяют на тандемные и диспергированные. Диспергированные повторы представляют гетерогенную, сложно организованную фракцию ДНК. В нее входят транскрибируемые и нетранскрибируемые последовательности, последовательности, содержащие различные открытые рамки считывания, а также ретротранспозон-подобные элементы, такие как BIS 1, BARE-1, WIS 2-1А, RIOvcop [75, 199,212,194].
Более детальное изучение повторяющихся элементов показало, что им отводится важная роль в структуре генома и в процессах видообразования. Они содержат множество регуляторных элементов [34, 47]. Благодаря высокой копийности диспергированных повторов многие участки генома, включая структурные гены, могут находиться в зоне их влияния. Однако значение их для генома во многом остается неясным. В геноме высших растений на молекулярном уровне исследована только небольшая часть диспергированных повторов. Всестороннее изучение этой фракции ДНК янлеется одним кз приоритетных направлений современном \юле::\'л:-:ріюГ; генетики.
Программы исследования повторяющихся элементов зіслючшої в себя такие задачи, как выделение и идентификация лойторо:;, аколкз им перг.ачной структуры, изучение способов организации е гег-хме, филогенетических связей и эволюции. Важной задачей янляеюя использование этих последовательностей в практических селекционно-генетических работах, в частности в качестве молекулярно-генетическнх маркеров генома. Появилась также возможность использования их для построения генетических карт [143].
Выделение и анализ новых повторяющихся последовательностей ДНК из генома ячменя, ржи и пшеницы позволит расширить представления о структурной организации геномов этих видов.
Связь работы с крупными научными программами, темами.
Диссертационная работа выполнена в Институте генетики и цитологии НАН
Беларуси в рамках комплексной республиканской программы
фундаментальных исследований "Продуктивность растений" по теме: "Изучение молекулярной структуры геномов злаковых культур на основе молекулярно-генетических маркеров" (1989-1994 гг. № регистрации 01900010212); и теме "Молекулярно-генетичесхое изучение организации и экспрессии геномов сельскохозяйственных растений с помощью ДНК зондов и генетической трансформации" (1995-1999 гг. № регистрации 1995858).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы были выделение и молекулярно-генетическая характеристика новых
повторяющихся последовательностей ДНК из геномов ячменя, ржи и пшеницы. Непосредственными задачами исследования являлись:
-
Получение и анализ клонотеки повторяющихся последовательностей ДНК ячменя, ржи и пшеницы, отбор диспергированных повторяющихся последовательностей. Определение количества копий последовательностей BRS 1, pEWM, pERV в геноме ячменя, ржи и пшеницы.
-
Анализ первичной структуры последовательностей BRS 1, pEWM, pERV.
-
Исследование уровня генетического полиморфизма BRS 1, pEWM, pERV среди видов Triticeae.
-
Определение мест локализации на хромосомах BRS 1.
5) Исследование транскрипционной активности BRS 1.
Объект и предмет исследования. Основными объектами
исследования служили ячмень Hordeum vulgare L., линия Waxy, рожь Secale sereale L. сорт Восход 1, мягкая пшеница Triticura aestivum сорт Мироновская. В работе так же использовали другие сорта ячменя, ржи к пшеницы, 10 видов рода Hordeum,., 6 видов и подвидов рода Secale, 11 видов и подвидов рода Triticum. Выбор объектов исследования обусловлен важностью их для сельского хозяйства. Предметом исследования являлась повторяющиеся последовательности ДНК.
Методологии и методы проведенного исследований. Методологий основана на проведении комплексных экспериментальных исследований с применением современных молекулярно-генетических методов. Для создания рекомбинантных илазмид были использованы методы клонирования. С помощью блот-гибридизацни определялось количество копий повторяющейся последовательности ДНК в геномах ячменя, ржи и пшеницы. ПДРФ-анализ был применен для изучения организации клонированных последовательностей в геноме ячменя и других представителей семейства злаковых и определения уровня полиморфизма. Метод полимеразной цепной реакции был использован для изучения структуры части последовательности BRS 1 в геномах сортов и видов ячменя. Первичная структура BRS 1, pEWM, pERV определена методом Максама-Гилберта. Для определения локализации на хромосомах последовательности BRS 1 был применен метод гибридизации in situ. Для того чтобы проверить возможность транскрипции BRS 1 в геноме ячменя, была проведена Northern-гибридизация этой последовательности с суммарным препаратом РНК.
Научная новизна и значимость полученных результатов. Последовательности BRS 1, pEWM, pERV из геномов ячменя, пшеницы и ржи впервые клонированы и исследованы на молекулярном уровне в данной работе.
Выявлены особенности организации и структуры последовательностей BRS 1, pEWM, pERV. Показано, что они имеют консервативную внутреннюю структуру в рамках вида.
Впервые определена первичная структура повторяющейся последовательности ячменя BRS 1, на долю которой приходится 5% генома этого вида и 1% геномов ржи и пшеницы. Установлено, что BRS 1 диспергирована по всем хромосомам ячменя. Последовательность зарегистрирована в GenBank, где ей присвоен номер BRS-1 U76261.
В составе BRS 1 обнаружена открытая рамка считывания для 337 аминокислот. Показана возможность ее транскрипции в геноме ячменя. Выявлена гомология по аминокислотному составу к ретроэлементу арабидопсиса Athila.
Впервые показано, что повторяющиеся последовательности pEWM и pERV являются членами нового семейства повторов, на долю которых приходится 0.5% генома. Дивергенция их в геноме ржи и пшеницы обусловлена единичными нуклеотидными заменами.
Практическая значимость полученных результатов. Показана возможность использования BRS 1, pEWM, pERV в качестве молекулярных маркеров для идентификации геномов и уточнения филогенетических отношений внутри трибы Triticeae.
Создана библиотека клонов, обогашенная повторяющимися последовательностями ДНК ржи и пшеницы.
Определена первичная последовательность повтора ячменя, на долю которого приходится 5% генома этого вида. Полученuwe р^зулыны зарегистрированы в GenBank и могут широко использоейтьс? пе;: сравнительном анализе геномов, а также для построения генетических карт.
Экономическая значимость полученных результатов. Работа относится к фундаментальным исследованиям, что не позволяет на данном этапе оценить непосредственный экономический эффект.
Основные положення диссертации, выносимые на защиту.
1. Последовательности BRS 1, pEWM, pERV являются новыми
семействами повторов геномов ячменя, пшеницы и ржи.
2. Повтор BRS 1 диспергирован по всей длине всех хромосом ячменя.
На его долю приходится около 5% генома ячменя и 1% геномов ржи и
пшеницы.
-
В составе BRS 1 имеется блок, состоящий из 11 прямых и 7 инвертированных повторов консенсусной последовательности длиной 16 п.н., и открытая рамка считывания длиной 1011 п.н. для 337 аминокислот. BRS 1 транскрибируется в геноме ячменя.
-
Последовательности BRS 1, pEWM, pERV широко представлены в геноме видов Hordeum, Secale, Triticum. Они показывают консерватизм внутренней структуры в рамках вида и проявляют полиморфизм на межвидовом уровне. BRS 1, pEWM и pERV могут служить маркерами для установления родственных связей между видами Triticeae.
-
Повторы pEWM и pERV являются членами одного семейства, общего для пшеницы и ржи. Дивергенция этих последовательностей в геномах ржи и пшеницы обусловлена единичными нуклеотидными заменами.
Личный вклад соискателя. Основные результаты исследований, представленные в диссертации, получены автором работы самостоятельно в лаборатории молекулярной генетики Института генетики и цитологии НАН Беларуси. Результаты гибридизации in situ были получены совместно с J. Fuchs на базе IPK, Германия. Секвенирование Hind Ш-фрагментов BRS1 длиной 0.7 и 1.1 т.п.н. было осуществлено автором в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси. Часть BRS1 длиной 3.5 т.п.н., включая перекрывающиеся области, была секвенирована в НИИ МБ, НПО «Вектор», Кольцово, Новосибирская область.
Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации были представлены на: IV всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Минск, 1990); республиканской конференции «Современные проблемы генетики и селекции» (Минск, 1995); международной конференции, посвященной памяти акад. А.А.Баева (Москва, 1996); VI международной конференции по овсу и VII международном генетическом симпозиуме по ячменю (Канада, 1996); VII съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров (Горки, 1997); международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» (Минск, 1998).
Опублшсозанность результатов. Основные результаты
диссертационной работы были изложены в 6 статьях и 4 тезисах докладов. Общее количество страниц опубликованных материалов - 27.
Струїлура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, перечня условных обозначений, введения, общей характеристики работы, 6 глав, заключения, перечня использованных литературных источников и двух приложений. Полный объем работы - 159 страниц, иллюстраций - 49, таблиц - 3, список использованных источников состоит из 302 наименований.