Введение к работе
Актуальность теш. Становление -бобово-ризобиального симбиоза -сложный многостадийный процесс, который контролируется генетическими системами как макро-, так и микросимбионта. Известно, что ризобии в значительной степени отличаются друг от друга по своим симбиотическим свойствам и, в частности, по симбиотической эффективности. В настоящее время под симбиотической эффективностью клубеньковых бактерий понимают их способность увеличивать зеленую массу растений и накопление в них азота по сравнению с неи-нокулированными растениями (Симаров и др., 1990). Получение высокоэффективных штаммов ризобии представляет собой большой интерес как с научной, так и с практической точки зрения. Во многих лабораториях проводится работа по выделению и предпринимаются попытки по конструированию таких штаммов с использованием генно-инженерных методов (Plazinski., 1981; Birkenhead et al., 1988; Snarypova et.al., 1992; Sharypova et al., 1994; Romero et al., 1995).
Один из подходов к изучению симбиотической эффективности заключается в том, чтобы с помощью мутагенеза получить высокоэффективные штаммы, а уже затем исследовать гены, вовлеченные в процесс "тонкой настройки" симбиотического аппарата. В лаборатории генетики и селекции микроорганизмов ВНИИСХМ в течение ряда лет пр.оводится изучение генетического контроля симбиотической эффективности клубеньковых бактерий Rhlzobium mellloti. В лаборатории имеется коллекция мутантов с повышенной симбиотической эффективностью (Eff++ -мутантов), полученных с использованием транспозонового мутагенеза. Эти мутанты обладают способностью увеличивать массу инокулированных ими растений на 20-30% по сравнению с родительскими штаммами СХМ1-105 и СХМ1-188 : (Шарыпова и др., 1994).
Целью настоящей работы являлось выявление генетических детерминант, вовлеченных в контроль симбиотической-эффективности у Eff++-MyTaHTOB R.mellloti.
Нам практически ничего не было известно о последовательностях ДНК, в которые произошла инсерция транспозона у Elf""""-мутантов. Такие последовательности ДНК, условно были названы генами "эффективности" или eff-генами. Поэтому было необходимо провес-
ти анализ последовательностей ДНК, смежных с транспозоном, то есть секвенирование этих последовательностей "от транспозона". .Такой анализ позволяет локализовать сайты инсерции транспозона и, при сравнении просеквенированных последовательностей с последовательностями ДНК из генетического банка данных, выявить гены, имеющие гомологию с изучаемыми последовательностями ДНК. Для определения структуры eff-генов первоначально следовало отобрать мутантные штаммы, пригодные для молекулярного клонирования у них eff-генов, и проклонировать эти гены. Таким образом, в соответствие с целью исследования, нами были поставлены следующие задачи;
-
проанализировать семь Ef ^-мутантов штамма СХМ1-188 R.raeli-loti на наличие в их геноме последовательности транспозона и последовательности векторной плазмиды для того, чтобы отобрать мутанты, у которых произошла истинная инсерция транспозона и которые можно использовать для молекулярного клонирования фрагментов ДНК, смежных с транспозоном Тп5;
-
проклонировать из тотальной ДНК Eff^-мутантов последовательности ДНК. смежные с транспозоном Тп5, и разработать способ клонирования немутантных генов "эффективности" (копий генов дикого типа);
-
определить первичную нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК. смежных с транспозоном. и сравнить просеквенированные последовательности с последовательностями ДНК из банка генов.
Научная новизна работы. Показано, что мутации, вызывающие повышение эффективности симбиоза у клубеньковых бактерий Rhizo-blum melilotl с люцерной Medicago satlva, обусловлены: инсерцией транспозона в последовательность гена phbA(phaA), кодирующему фермент кетотиолазу. вовлеченную в биосинтез и деградацию поли-бета-оксимасляной кислоты; в последовательность ДНК, гомологичную гену fadB, кодирующему фермент 3-гидроксиацил-КоА дегидро-геназу, вовлеченную в бета-окисление жирных кислот; в последовательность ДНК, гомологичную гену oppD, кодирующему один из белков олигопептидной пермеазы, осуществляющей транспорт олигопеп-тидов в клетку.
Практическая ценность. Выявлены и проклонированы гены R.те-
liloti, мутации в которых приводят к повышению симбиотической эффективности. Проклонированные гены могут быть использованы для изучения их функций и регуляции и, в дальнейшем, для конструирования высокоактивных штаммов ризобий с применением генно-инженерных методов.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных семинарах лаборатории генетики и селекции ВНИИСХМ, общеинститутских семинарах ВНИИСХМ, на X Международном конгрессе по биологической фиксации азота (С. -Петербург, 1995).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 30 рисунков. Список литературы насчитывает 212 источников.