Введение к работе
Актуальность темы Для лучшего понимания принципов организации и функционирования эукариотического генома необходимо не только иметь представление о молекулярной структуре конкретных последовательностей ДНК, но и знать их внутрихромосомное расположение. Подобную информацию . дают генетические карты. Эти карты являются показателем генетической изучености вида и, в тоже время, служат основой для его дальнейшего генетического изучения и рационального практического использования. Понятно, что для практических целей необходимы карты высокой- степени насыщенности и высокого уровня разрешения.
В геноме высших эукариот содержится около 50-100 тыс. генов. В настоящее время существует относительно подробная генетическая карта человека, включающая более 2 тыс. картированных генов, все хромосомы вида имеют генетические маркеры (Stephens et al. , 1990; Goodfellow, Sefton, 1991). Значительно хуже обстоит дело с картированием геномов сельскохозяйственных животных (Gillois, 1.991; Chowdhary, 1991). Так генетическая карта крупного рогатого скота ( Bos taurus L.),наиболее генетически изученного вида сельскохозяйственных животных, содержит 220 картированных генов, маркировано 12 хромосом набора (Chowdhary, 1991; Fries et al., 1991). Ясно, что карта такой степени насыщенности не может эффективно использоваться для изучения организации генома этого вида, а также для практической селекционной работы. .
Среди методов, используемых для построения генетических карт, самым универсальным и наиболее пригодным для' внутрихромосомного картирования является гибридидизация in situ. Этот методический подход позволяет установить внутрихромосомное положение любого клонированного гена и фрагмента ДНК (Lichter et al., 1991; McNeil et al. , 1991). В последнее время все большую популярность приобретают неизотопные варианты гибридизации. С помощью этих методов удается быстро и с высоким уровнем разрешения картировать короткие
уникальные последовательности ДНК, проводить локализацию нескольких.последовательностей ДНК одновременно, избавляться от необходимости статистической обработки (Cherif et al. , 1989; Viegas-Pequignot et al. . 1989, 1991; Trask et al. , 1991; McNeil et al. , 1991). В настоящий момент неизотопные варианты гибридизации in situ используются в основном' для картирования генома человека.
Применение гибридизации in situ-для картирования геномов сельскохозяйственных животных только начинается. Так у Bos taurus L. с помощью изотопного варианта гибридизации картировано около 30 генов и 10 фрагментов ДНК (Chowdhary, 1991). Неизотопиые варианты гибридизации пока практически не используются для картирования .геномов сельскохозяйственных животных.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось картирование на митотических хромосомах Bos taurus L. повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК с помощью изотопного и неизотопного вариантов гибридизации in situ. В связи с этим были сформулированы следующие конкретные задачи:
1. Подобрать условия для внутрихромосомной локализации
клонированных, последовательностей ДНК на хромосомах Bos
taurus L. с помощью неизотопного варианта гибридизации in
situ.
2. Провести локализацию клонированного фрагмента
сателлитной ДНК IV 11,709 г/куб. см ) на митотических хро
мосомах Bos taurus L.
-
Провести локализацию клонированного фрагмента сателлитной ДНК II (1,723 г/куб. см ) на митотических хромосомах Bos taurus L.
-
Оценить хромосомоспецифнчноеть.распределения сател- , дитных ДНК Л и IV по хромосомам Bos taurus L.
б. Пр вести внутрихромосомную локализацию клонированного фрагмента I1PRT -гена человека на митотических хромосомах Bos taurus L
6. Провести внутрихромосомную локализацию клонированного Фрагмента ZFY -гена человека на митотических хромосомах Ьоз taurus L.
?. Цроьеотн сравнение «фиктивности и чуьствителыюсти
- з -изотопного и неизотопного вариантов гибридизации in situ.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые с помощью неизотопного варианта гибридизации in situ была проведена локализация повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК на митотических хромосомах крупного рогатого скота.
Впервые установлено, что в кариотипе Bos 'taurus L. отсутствуют аутосомы, не содержащие в прицентромерном гетерохроматине последовательностей сателлитной ДНК II.
Впервые обнаружено, что Y-хромосома крупного рогатого скота содержит небольшое количество сателлитной ДНК IV.в ГЦ-обогащенном участке короткого плеча.
. Впервые проведена внутрих'ромосомная локализация гена HPRT на митотических хромосомах Bos taurus L.
Впервые проведена внутрихромосомная локализация гена ZFY на митотических хромосомах Bos taurus L.
Результаты работы могут быть использованы для построения генетической карты вида и изучения структурнофункцио-налыгой организации генома Bos taurus L. , а так же в исследованиях по изучению молекулярно-генетнческой детерминации пола млекопитающих.
Апробация работы. Основные результаты работы обсуждались на аспирантских сессиях ВНИИРГЖ (1990, 1991 гг.), а также были представлены на Ш-школе-семинаре по генетике животных (Алтай, 1989), 9- ом Европейском коллоквиуме по ци-тогенетике животных (Тулуза, Франция, 1990), VII Всесоюзной-конференции "Структура и функции хромосом" (Пущино, 1991).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Объем и структура работы диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, лите-, ратурного обзора, изложения методов и результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предлиже-ннй, списка литературы. Иллюстративный материал содержит 15 рисунков и 22 таблицы. Список литературы содержит 194 источника, из них 133 на иностранном языке.