Введение к работе
Актуальность
Картирование хромосом является одной из наиболее_актуальных и ~ сложных задач_современной молекулярной биологии и генетики человека. Детальное картирование повторяющихся последовательностей ДНК, Формирующих районы прииентромерного гетерохроматина хромосом человека, юэволит, вероятно, более детально описать их молекулярную структуру, исследовать особенность эволюпии и приблизиться к понинанию Функций, до сих пор не известных.
АльФа-сателлитная ДНК представлена иерархически организованными ювторами с элементарной повторяющейся единицей длиной 171 н. п. Вторым структурным уровнем организации альФоидной ДНК являются, так называемые "предковые повторы", которые различаются по нуклеотидной юследовательности и характеру чередования входящих в.них мономеров. : настоящему времени описано три способа организации элементарных ільфоидннх мономеров (Табл.1). Первые два представлены регулярно чередующимися мономерами по типу -J1-J2- и -D1-D2-. третий имеет ;ентамерную организацию по типу -W1-V2-V3-W4-W5- (Millard, waye, 987; Alexandrov et al. , 1989). Родственные хромосомо-спеииФичные арианты объединяются, соответственно, в три надхромосомные семей-тва. Каждое семейство локализовано только на группе хромосом Alexandrov et al. , 1989).
аблипа 1. Организация надхромосомных семейств альФоидной ДНК человека
По классификации Waye and willard (1987а), Alexandrov et al.,
(1988. 1991).
Третьим уровнем организации альФоидных повторов является пов торяюшаяся единица высокого порядка, которая представляет собой с мент предковой альфа-сателлитной последовательности, подвергшейся последней амплификации в ходе эволюции данного альФоидного домена Специфичность семейств альфа-сателлитной ДНК определяется уникалы структурой повторявшейся единицы высокого порядка.
Исследования последовательностей альфа-сателлитных ДНК. формі рушшх принентромерный гетерохроматин хромосомы 21. показали, что данном районе генома имеется, по-крайней мере, два альФоидных доме на. различных по молекулярной организации входящих в них альФа-сателлитных ДНК (Devilee et al. . 19бб; юров и др. , 1987; Qioo et al., 1990). Однако исследование данного гетерохроматинового участк основывалось на изучении небольших, клонированных в плазнидных век торах. Фрагментов альфоидной ДНК человека. К сожалению, такие мето не позволяют составить достаточно полное представление об организа ции данного района.
Методы клонирования ДНК в космидных и дрожжевых (YACs) векторах, разработанные в последние годы, позволяют выделить и исследовать гигантские Фрагненты ДНК размером от 40 до 400 т. н. п. Один'из таких подходов был использован в данной работе для анализа альфа-сателлитных последовательностей ДНК хромосомы 21 человека.
Цель и задачи исследования
Цель диссертационного исследования состояла в картировании, а также в анализе первичной структуры клонированных в космидном векторе альФа-сателлитных ДНК из прииентромерного района хромосомы 21 человека.
для достижения этой дели решались следующие экспериментальные задачи:
-
Из специфичной'для хромосомы 21 человека космидной библиотеки выявить клоны, содержащие наряду с альФа-сателлитными ДНК повторяющиеся последовательности неальфоидной природы.
-
Определить последовательность нуклеотидов различных последовательностей ДНК. входящих в состав клонированного в космидном векторе геномного Фрагмента. Построить рєстриктную карту фрагмента, содержащего область контакта альФоидных и неальФоидных последовательностей ДНК.
-
Картировать клонированные последовательности ДНК на хромосомах человека с использованием панели соматических гибридов.
4. Провести анализ первичной структуры.альфоидных последова-ельностей ДНК космианого клона и установить их принадлежность к Ромосомо-спеииФичным и налхроносомным альФоидным семействам.
-Научная новизна и практическое значение работы
В данной работе впервые выявлен и охарактеризован клониро-анный в космидном векторе геномный Фрагмент ДНК, размером 40 . н. п. , содержащий наряду с последовательностями альФоидной ДНК дис-эргированные повторы Alu- и Крп-сенейств. Указанный геномный Фраг-гнт также содержит не описанные ранее повторяющиеся последователь-эсти ДНК, присутствующие только в акроцентрических хромосомах чело-гка.
Показано, что выявленные в данной работе альФа-сателлйтные пос-гдовательности отличны от ранее описанных по первичной структуре и юсобу организации альФоидных мономеров.
В результате настоящей работы были охарактеризованы два новых юсоба организации последовательностей альФоияной ДНК. что позволи-) существенно расширить представления о структуре альФа-сателлитиых Ж. Клонированные последовательности альФоидной ДНК могут быть ис->льзованы в качестве молекулярных маркеров при картировании хромо-ж человека и в медико-генетической диагностике.
В работе показано, что все разнообразие альФа-сателлитных пос-;довательностей хромосом человека можно объяснить комбинацией двух гаов мономеров, содержащих и не содержащих сайты связывания с иен-юмерным ядерным белком CENP-B, принимающим участие в Функциониро-інии центромеры. Последовательности каждого надхромосомного семей--ва имеют определенное распределение сайтов связывания с данным
'ЛКОМ.
Апробапия Результаты работы были представлены на 11 конференции "Генетика ловека и патология" (Томск. 1993), на VI съезде ОГИС им. Н. И. Ва-ілова (Минск. 199а), на 4-ой конференции "Геном человека-93", (Чер-головка, 1993), на научном семинаре лаборатории цитогенетики НШІЗ . ЛН (1992), а также на межлабораторном семинаре ВНГНЛ РАИН (1993).
ПУбЛИКЭПИИ
По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.
структура и объем работы диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включашей описание материалов и методов, а так* результатов с обсуждением. Список литературы состоит из 99 работ, в том числе в отечественных.