Введение к работе
Актуальность проблемы
Фиксация молекулярного азота воздуха, осуществляемая бобовыми растениями в симбиозе с бактериями семейства Rhizobiaceae, вносит основной вклад в биологический баланс азота биосферы. Одним из важных направлений изучения симбиотической фиксации азота являются генетические исследования. Данные о генетическом контроле взаимодействий между еысшими растениями и бактериями на разных стадиях развития бобово-ризобиалыюго симбиоза необходимы для успешного решения многих фундаментальных и пргаспадных проблем.
Горох Pisum sativum является традициоішьік объектом генетических исследований и представляет собой идеальную модель для изучения молекулярно-генетических основ процесса симбиотической азотфиксации. За последние десять лет у данного вэда путем искусственного мутагенеза было получено большое число мутаций, которые вызывают нарушение разных стадий развития и функционирования клубенька. В результате генетического анализа этих мутаций у гороха было идентифицировано около тридцати симбиотических генов (Duc.Messager, 1989; LaRue, Weeden, 1992; Сидорова, Ужинцева, 1992; Kneen et al., 1994). Другой подход к изучению роли бобового растения в данном процессе состоггг в идентификации так называемых нодулиновых * генов, которые зкспрессиругатся преимущественно в тканях клубенька (Nap, Bisseling, 1990). У гороха к настоящему времени клонировано около десятка нодулиновых генов. Некоторые из них полностью или частично секвинированы, однако в большинстве случаев функции этих генов до конца не выяснены.
Одним из способоз определения функций симбиотических генов и
идентификации их продуктов может быть генетическое картирование
клонированных генов нодуликов наряду с симбиотическими мутациями и
поиск возможных пар путем генетического анализа (LaRue, Weeden, 1992;
Lu et al., 1994). Перспективным является также поиск тесно сцепленных
ДНКовых маркеров, которые могут использоваться для последующего
тонкого анализа генов, ответственных за мутантный фенотип.
< К настоящему времени на генетической карте гороха локализовано
около двадцати симбиотических и нодулиновых генов (Weeden et al., 1990; Men et al., 1993; Kneen et al., 1994). Необычное скопление генов, контролирующих разные стадии развития и функционирования клубеньков, было обнаружено в районе генов d (антоциановое кольцо в основании прилистников) и Idh (изоцитратдегидрогеназа) группы сцепления I. На
основашш сцепления с данными маркерами здесь были локализованы гены sym-2 (Young, 1985) sym-5, sym-18, sym-19, а также малое семейство генов леггемоглобина (Weeden et al., 1990), однако расположение симбиотических генов относительно друг друга и генетические растояния между ними не были определены.
Цель и задачи исследования
Цель данного исследования заключалась в более точном картировании симбиотических генов, сцепленных с маркерными локусами d и Idh и образующих скопление в данном районе генетической карты гороха. В работе были поставлены следующие задачи:
-
Построение подробной генетической карты в районе генов d и Idh с использованием RAPD маркеров и локализация на ней симбиотических генов, сцепленных с данными маркерами
-
Хромосомная локализация суперклубеньковой мутации nod-3.
-
Картирование гена sym-1, контролирующего температуро-зависимую устойчивость дикорастущей формы гороха из Ирана к европейским штаммам клубеньковых бактерий.
-
Уточнение локализации гена sym-18.
-
Определение цитогенетическим методом путем использования реципрокных транслокаций хромосомной локализации сегмента генетической карты гороха, в котором находятся сцепленные с маркерами d и Idh симбиотические гены sym-1, sym-2, sym-5, sym-19, nod-3.
Научная новизна
В данной работе впервые:
картированы гены sym-1 и nod-З. Было показано, что данные гены сцеплены с маркерами d и Idh и находятся в группе сцепления I;
с помощью метода полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров были найдены тесно сцепленные RAPD маркеры для симбиотических генов sym-1, sym-2, sym-5, sym-19, nod-3 и определено их положение относительно друг друга. Рассматриваемые гены образуют два кластера тесно сцепленных генов, расположенных по разные стороны от локуса Idh;
идентифицированы две новые транслокации у гороха. Уникальной особенностью одной из них является тесная ассоциация точки разрыва с доминантной морфологической мутацией Twt;
цитогенетическим методом проведена хромосомная локализация
сегмента сцепления sym-5—d—Idh—sym-2. Показано, что он находится в хромосоме 6 и является частью соответствующей группы сцепления VI.
Практическая значимость
Полученные в настоящем исследовании результаты вносят определенный вклад в изучение генетических основ симбиотических взаимоотношений между бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями. Информация о локализации нескольких симбиотических генов и тесно сцепленных с ними RAPD маркеров может быть использована для дальнейшего более тонкого анализа данных генов, контролирующих разные стадии процесса симбиотической азотфиксации у гороха. Созданные на основе скрещивания Sparkle х Л 73 рекомбинантные инбредные линии в настоящее время используются для глобального картирования генома гороха и локализации симбиотических мутаций, полученных на фоне исходного сорта Sparkle. Идентификация и применение новой транслокации Twt позволило осуществить хромосомную локализацию сегмента сцепления sym-5—Idh—nod-З. Две новые транслокации, обнаруженные в ходе данной работы, могут быть использованы для дальнейших исследований в области цитогенетики гороха.
Апробация работы
Основные результаты данной работы были представлены на I и II Международных конференциях по геному растений (Сан-Диего, США, 1992, 1994); на IV Международной конференции по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994) и I Европейской конференции по фиксации азота (Сегед, 1994).
Структура и объем работы