Введение к работе
Актуальность проблемы.
Значительный прогресс в области картирования геномов млекопитающих в последние два десятилетия достигнут благодаря успешному использованию современного арсенала методов цитологии, молекулярной и клеточной биологии.
Построение подробных геномных карт различных видов млекопитающих создает основу для изучения действия генов в разнообразных биологических процессах: развитии организма, старения, нейрофизиологии, при выяснении природы наследственных болезней, рака, иммунологии, выяснении основ поведения, генетической природы количественных и экономически важных для сельского хозяйства признаков, позволяет изучать закономерности эволюции геномов млекопитающих посредством сравнения сцепления гомологичных генов.
Подходы, использованные при картировании генома человека, применяются также при построении геномных карт других видов млекопитающих. В настоящее время имеются сведения по локализации и сцеплению генов у 28 видов, представителей 8 из 19 отрядов млекопитающих. 12 из изученных видов представлены приматами, 4 вида грызунов (мышь, крыса, китайский и сирийский хомячок), 4 вида хищных (кошка, норка, лисица, собака) и 5 важных для сельского хозяйства вида: корова, свинья, овца, коза, лошадь.
Однако, прогресс в области картирования геномов млекопитающих касается прежде всего человека и мыши -традиционного объекта генетических исследований. У человека в настоящее время картировано около 14000 генов и анонимных последовательностей, что позволило создать генную карту с разрешением в 1 сМ. Построены библиотеки перекрывающихся протяженных клонов (контигов) для 3, 12, 16, 21, 22 и Y хромосом человека. У мыши картировано более 4000 маркеров. В меньшей степени картированы другие виды млекопитающих.
Полученные генные карты дали основу для изучения сцепления локусов гомеологичных у разных видов млекопитающих. В результате такого сравнения были выявлены группы генов, сохраняющие синтенные отношения в течение многих миллионов лет эволюции. Данные о консервативных участках геномов
млекопитающих и оценка частоты перестроек в них расширяют наши представления о путях эволюции геномов млекопитающих.
Для более успешного выявления наиболее консервативных
сннтенных групп генов у млекопитающих, изучения их эволюции и
выяснения причин стабильности этих связей О'Брайн с соавторами
(O'Brien et al, 1993) был предложен список из 321 маркеров для
картирования. Список представлен нуклеотидными
последовательностями функциональных генов, распределенных равномерно , через 5-Ю сМ по геному человека и мыши. Этим же целям служит расширение списка видов, представителей слабо или вообще не картированных отрядов млекопитающих.
Картирование генома американской норки было начато более 15 лет назад в Институте цитологии и генетики в лаборатории генетических основ онтогенеза совместно с лабораторией цитогенетики животных. Норка является представителем большого таксона куницеобразных (Mustelidae) отряда хищных (Carnivora). В систематическом отношении норка отдалена (далека) от хорошо изученных видов человека и мыши. Норка имеет простой кариотип, состоящий из 14 аутссом X и Y хромосом, которые легко идентифицируются цитогенетически. Кроме того, норка является сельско-хозяйственным видом, с которым ведутся селекционно-генетические исследования и построение генной карты будет иметь значение для ведения селекционных работ.
К началу данного исследования генная карта норки была представлена 65 генами. Хромосомная и региональная локализация генов у норки была определена различными методами: гибридологическим, анализом гибридов соматических клеток норка х китайский хомячок и норка х мышь, генным переносом, анализом спонтанных и индуцированных хромосомных перестроек.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы было увеличение количества картированных генов (тип 1 маркеров) и микросателлитов (маркеров типа 2) у американской норки. Это позволило-бы пронаблюдать за эволюцией синтенных групп генов и консервативных районов у видов, вовлеченных в работы по сравнительному картированию с использованием локусов 1-го типа, а также насытить геномную карту норки высокополиморфными ДНК маркерами - микросателлитами.
Для достижения поставленной цели в работе были поставлены следующие задачи:
1. Построить тканеспецифическую кДНК библиотеку из
гипофиза норки.
2. Выявить рекомбинантные клоны, содержащие фрагменты
кДНК генов гормона роста и пролактина норки, и определить их
нуклеотидные последовательности.
3. Провести сравнительный консенсусный анализ
нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов
гормона роста и пролактина у разных представителей
позвоночных.
4. Провести анализ различий по длине рестрикционных
фрагментов ДНК, выделенной из клеток американской норки и
китайского хомячка в Саузерн-блот гибридизации с гомологичными
зондами гормона роста, пролактина, -субъединицей легкой цепи
иммуноглобулинов и -субъединицей тяжелой цепи
иммуноглобулинов, а так же с гетерологичным зондом орнитин
транскарбомилазы человека, и провести хромосомную
локализацию соответствующих генов норки с помощью панели
клонов гибридов соматических клеток американская норка х
китайский хомячок.
5. Провести региональную локализацию гена гормона роста с
помощью гибридизации in situ.
6. Провести сравнительный анализ некоторых групп
сцепления Американской норки с таковыми у других видов
млекопитающих.
7. Провести локализацию геномных клонов, содержащих
микросателлитные последовательности, с помощью FISH
гибридизации в геноме Американской норки.
Научно-практическая значимость.
Работа имеет как теоретическое, так и практическое значение. Создание детальной цитогенетической карты норки важно для-< изучения закономерностей эволюции геномов млекопитающих, выявления наиболее консервативных синтенных групп генов и анализа их сохранения в течение эволюции млекопитающих.
Описанные в работе 34 микросателлита могут быть успешно использованы при построении генетической карты норки, а оставшиеся 10 - как удобные маркеры 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 12 и 14 хромосом норки.
Кроме того, полученные результаты имеют практическую значимость для частной генетики норки - объекта пушного звероводства.
Апробация результатов.
Материалы диссертации были представлены на 5 Российской конференции "Новые методы в биологии" (Пущино, 1992), на 24 конференции по генетике животных (Прага, 1994), на 11 Европейском коллоквиуме по цитогенетике сельскохозяйственных животных (Копенгаген, 1994).
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, 3-х глав, выводов и списка литературы (199 ссылок). Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25-ю рисунками и содержит 3 таблицы.