Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Эволюционные аспекты патогенетики болезней человека 16
1.1.1. Роль факторов, оказывающих влияние на фертильность и беременность в формировании адаптивной эволюции современного человека 17
1.1.2. Болезни человека с эволюционной точки зрения 23
1.2. Преэклампсия 24
1.2.1. Классификация гипертензивных расстройств во время беременности 24
1.2.2. Эпидемиология преэклампсии 27
1.2.3. Факторы риска преэклампсии 28
1.2.4. Современные представления об этиопатогенезе преэклампсии 30
1.3. Генетические аспекты преэклампсии 39
1.3.1. Метод «случай-контроль» 41
1.3.2. Метод полногеномного анализа сцепления в родословных (GWLS) 43
1.3.3. Метод полногеномного исследования ассоциаций (GWAS) 44
1.3.4. Анализ экспрессии генов 46
1.4. Роль регуляторных однонуклеотидных полиморфных вариантов в формировании патологических состояний человека 48
1.5. Эволюционный подход к анализу генетической архитектуры преэклампсии 51
1.6. Заключение по обзору литературы 58
Глава 2. Материал и методы исследования 60
2.1. Дизайн проведенного исследования 60
2.2. Характеристика обследованных групп 62
2.2.1. Выборки, обследуемые методом «случай-контроль» 62
2.2.2. Данные по мировым популяциям из проекта «1000 геномов» 63
2.2.3. Выборка популяций Северной Евразии 64
2.3. Молекулярно-генетические методы исследования 66
2.3.1. Генотипирование методом масс-спектрометрии MALDIOF 66
2.3.2. Генотипирование методом Realime PCR 70
2.4. Статистическая обработка полученных результатов 72
2.4.1. Статистическая обработка результатов, полученных методом «случай-контроль» 72
2.4.2. Детекция сигналов действия естественного отбора по изученным дифференциально-экспрессирующимся генам плацентарной ткани 73
2.4.2.1.Методы выявления сигналов естественного отбора, действовавшего в ходе микроэволюции 74
2.4.2.2.Методы выявления сигналов естественного отбора, действовавшего в ходе макроэволюции 74
Глава 3. Результаты и обсуждение 78
3.1. Идентификация in silico наиболее значимых генов, ассоциированных с преэклампсией по данным анализа транскриптома плацентарной ткани, и их регуляторных полиморфных вариантов 78
3.2. Генетическое разнообразие и ассоциации с развитием преэклампсии аллелей и генотипов, изученных rSNP дифференциально экспрессирующихся генов плаценты в различных этнических группах 88
3.2.1. Характеристика генетического разнообразия изученных rSNP 88
3.2.2. Ассоциации с развитием преэклампсии аллелей и генотипов изученных регуляторных полиморфных вариантов дифференциально-экспрессирующихся генов плацентарной ткани 106
3.2.3. Роль изученных дифференциально-экспрессирующихся генов плацентарной ткани и их регуляторных полиморфных вариантов в молекулярных механизмах преэклампсии 124
3.3. Вклад естественного отбора в формирование генетического разнообразия по изученным маркерам 128
3.3.1. Характеристика генетического разнообразия аллелей и генотипов, ассоциированных с развитием преэклампсии rSNP, в популяциях различного этнического происхождения и роль естественного отбора в ее формировании 128
3.3.2. Оценка роли естественного отбора в формировании структуры исследуемых дифференциально-экспрессирующихся генов и их регуляторных полиморфных вариантов на макроэволюционном уровне 150
3.4. Характеристика роли естественного отбора в формировании генетической архитектуры преэклампсии 158
3.4.1. Роль естественного отбора в формировании популяционно специфичной предрасположенности к развитию преэклампсии 168
Заключение 171
Выводы 175
Список сокращений 177
Список литературы 180
Приложение А 234
- Современные представления об этиопатогенезе преэклампсии
- Эволюционный подход к анализу генетической архитектуры преэклампсии
- Характеристика генетического разнообразия изученных rSNP
- Оценка роли естественного отбора в формировании структуры исследуемых дифференциально-экспрессирующихся генов и их регуляторных полиморфных вариантов на макроэволюционном уровне
Современные представления об этиопатогенезе преэклампсии
В связи с отсутствием единого мнения об этиологии и патогенезе преэклампсии, данное заболевание также называют «болезнью теорий». Несмотря на десятилетия исследований, механизмы, лежащие в основе данного осложнения беременности, остаются плохо понятными [33, 55, 161, 330, 442]. Плацента занимает центральное место в развитии ПЭ и ее удаление остается единственным эффективным методом лечения, предотвращая прогрессирование заболевания. Возникновение ПЭ может происходить при пузырном заносе, что свидетельствует о потребности в плаценте, а не плоде для развития данной патологии беременности [442]. Важно отметить, что преэклампсия является гетерогенным состоянием и характеризуется разной степенью вклада матери и плода в развитие патологического процесса [305, 367].
Для преэклампсии характерно двухэтапное развитие патологического процесса (рисунок 2). Первый преклинический этап возникает на ранних стадиях беременности, когда происходит нарушение плацентации в результате недостаточного ремоделирования сосудов матки, что приводит к низкому уровню перфузии плаценты. Второй этап характеризуется клиническими проявлениями материнского синдрома - гипертензией и протеинурией [330, 367, 442].
В настоящее время не выяснена связь между аномальной плацентацией и возникновением материнского синдрома, однако существует предположение, что одним из ключевых факторов может быть оксидативный стресс [180]. Нарушение ремоделирования сосудов матки и недостаточная перфузия плаценты на ранних этапах беременности, вероятно, не являются определяющими факторами для развития преэклампсии, поскольку такие патологические изменения характерны также для преждевременных родов, ограничения роста плода и проявляются без каких-либо клинических признаков ПЭ [364]. Появление второго этапа опосредовано материнскими конституциональными факторами, иммунной дезадаптацией, и/или экзогенными факторами [364]. Многие из этих факторов также являются факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний в более позднем возрасте [372].
Предполагается, что ПЭ начинает формироваться в первом триместре беременности с недостаточного ремоделирования дистальной части спиральных артерий матки [442]. Успешная инвазия и ремоделирование спиральных артерий зависит от накопления вблизи специализированных маточных NK-клеток (uNK) и макрофагов, которые разрушают гладкомышечный слой сосудов и эндотелий [161, 322, 418, 442]. Вневорсинчатые инвазивные цитотрофобласты проникают через децидуальную оболочку в миометрий и выравнивают просвет сосуда с образованием псевдоэндотелия. Это является завершающей стадией трансформации спиральных артерий из узких, вазореактивных сосудов в сосуды большей емкости и слабого сопротивления, которые позволяют увеличить плацентарный кровоток, необходимый для поддержания плода на протяжении всей беременности (рисунок 3) [55, 239, 333, 442].
Иммунная толерантность матери к чужеродным антигенам плода объясняется экспрессией вневорсинчатыми трофобластами человеческих лейкоцитарных антигенов G (HLA-G), что предотвращает их лизис NK-клетками [314]. При ПЭ наблюдается снижение экспрессии HLA-G, что приводит к нарушению инвазии трофобласта [98]. Трофобласты на низком уровне экспрессируют антигены HLA-C, которые взаимодействуют с киллерными иммуноглобулинподобными рецепторами (KIR) на поверхности материнских uNK-клеток. Было показано, что определенная комбинация генотипов HLA-С плода и материнского KIR ассоциирована с нарушением инвазии вневорсинчатого трофобласта и недостаточным ремоделированием спиральных артерий, приводящим к развитию преэклампсии [198, 476]. Также показано, что Т-хелперы 2 типа (Th2) играют важную роль в успешной беременности путем регулирования иммунного ответа на плод. В то время как при осложненной преэклампсией беременности баланс смещается в пользу Т-хелперов 1 типа (Th1) [161, 381]. Иммунная дезадаптация может приводить к нарушению инвазии трофобласта и/или вызвать выброс цитокинов, свободных радикалов и ферментов из децидуальной оболочки, которые могут привести к повреждению или нарушению нормальной функции материнского эндотелия и синцитиотрофобласта [330].
При преэклампсии, недостаточное ремоделирование спиральных артерий происходит вследствие неудачной инвазии вневорсинчатых цитотрофобластов, что приводит к сохранению высокой сократимости дистальной части сосудов. В результате развивается прерывистый кровоток и повышается риск повреждения вследствие ишемии/реперфузии, что является сильным стимулом для окислительного стресса [161, 442]. В тяжелых случаях, прерывистый ток крови может влиять на развитие плаценты [131, 442]. В случае неспособности эндоплазматического ретикулума восстановить клеточный гомеостаз и препятствовать развитию окислительного и воспалительного стресса, происходит апоптоз/некроз слоя синцитиотрофобласта [67, 442]. Недостаточная плацентарная перфузия в результате неполноценной сосудистой трансформации артерий вызывает высвобождение фактора/нескольких факторов плаценты в материнский кровоток, связывая плаценту с материнским системным воспалением, эндотелиальной дисфункцией и активацией свертывающей системы [442].
Связь между плацентарной патологией и материнским синдромом
В настоящее время не выявлено связи между аномальной инвазией трофобласта и последующей генерализованной эндотелиальной активацией и дисфункцией, приводящей к развитию материнского синдрома. Предполагается, что это происходит за счет высвобождения плацентарных факторов [330]. Было показано, что в течение всей беременности синцитиотрофобласт выпускает в материнский кровоток множество внеклеточных везикул, которые доставляют провоспалительные, антиангиогенные и прокоагулянтные факторы в клетки-мишени матери (лейкоциты, эндотелиальные клетки и тромбоциты), изменяя при этом их функции [354, 442]. Наблюдается повышение уровней циркулирующих плацентарных везикул в течение беременности, однако они перестают обнаруживаться в кровотоке позже 48 часов после родов [164, 353, 442]. Значительно большее количество этих везикул находится в кровотоке при ПЭ по сравнению с нормальной беременностью [161, 330, 442]. Они варьируют в размерах от экзосом (30-100 нм) до микровезикул (100-1000 нм) и апоптотических телец (1-5 мкм) [442]. Показано что плацентарные экзосомы обладают иммуносупрессивными свойствами [189], в то время как для микровезикул характерно провоспалительное действие [423].
В настоящее время описан ряд факторов, которые содержатся в везикулах синцитиотрофобласта и определяют их функциональные эффекты. К основным кандидатам на роль провоспалительных молекул относятся: белок теплового шока (HSP70), амфотерин (HMGB1) и ДНК плода [179, 358, 442], совместно с белком синцитином-1, стимулирующим выработку IL-1 и другими провоспалительными цитокинами мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) [202].
Показано, что везикулы также содержат sFlt-1 и эндоглин, которые вероятно способствуют развитию эндотелиальной дисфункции [179, 443]. В то же время, ингибиторы активатора плазминогена (PAI-1/PAI-2), регулирующие фибринолиз, могут быть ответственны за очень высокий уровень осаждения фибрина в межворсинчатом пространстве и инфаркт плаценты [179]. Повышенная активность образования тромбина в плацентарных везикулах при преэклампсии может быть причиной чрезмерной активации системы свертывания крови [160]. Характерные для преэклампсии воспалительные процессы в плаценте также могут усиливать воспалительную нагрузку везикул путем модификации белков и липидов синцитиотрофобласта, которые обычно не являются провоспалительными [140]. Наконец, плацента является богатым источником микроРНК, которые посттранскрипционно регулируют экспрессию генов и, таким образом, вовлечены в развитие большого числа заболеваний, в том числе и преэклампсии [171]. При этом трофобласт выпускает экзосомы, содержащие микроРНК, функционально значимые для патогенеза данного осложнения беременности [442].
Результаты многих исследований, посвященных изучению патогенеза преэклампсии, свидетельствуют о центральной роли в эндотелиальной дисфункции следующих антиангиогенных факторов: FMS-подобной тирозинкиназы-1 (sFlt-1) и эндоглина (sEng) [161, 277, 341, 463]. sFlt-1 функционирует как антагонист двух ангиогенных факторов: фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и плацентарного фактора роста (PIGF), которые необходимы для поддержания целостности сосудистого эндотелия [268, 300]. Изоформой корецептора трансформирующего фактора роста (TGF-) является sEng [442]. На крысиной модели беременности было показано, что при совместном введении sEng и sFlt-1 увеличивается степень тяжести подобных преэклампсии симптомов, в то время как индуцированное повышение только sFlt-1, присоединяло HELLP-синдром [277, 463]. Антагонизм передачи сигналов VEGF путем sFlt-1 in vitro также сенсибилизирует эндотелиальные клетки провоспалительными цитокинами, вовлекая sFlt-1 в чрезмерный материнский системный воспалительный ответ [97]. Несмотря на то, что sFlt и sEng являются важными факторами, способствующими возникновению материнского синдрома, их повышенный уровень наблюдается не у всех беременных женщин с преэклампсией [342, 442].
Эволюционный подход к анализу генетической архитектуры преэклампсии
Первая эволюционная теория по возникновению ПЭ сформулирована D. Haig в 1993 году [183]. Было высказано предположение, что в основе развития данной патологии беременности лежит «генетический конфликт интересов», согласно которому отбор действует не только на гены плода, стремящиеся повысить поступление питательных веществ, но и на гены матери, которые наоборот направлены на ограничение потребностей плода [183]. В связи с этим, эндотелиальная дисфункция у женщин с ПЭ может быть интерпретирована как попытка плода компенсировать недостаточное поступление питательных веществ с маточно-плацентарным кровотоком [476]. Кроме того, D. Haig высказал гипотезу, что за образование плаценты отвечают отцовские гены, в то время как материнские ответственны за дифференцировку клеток эмбриона при формировании тканей и органов [183]. Примечательно, что случаи ПЭ были зарегистрированы при пузырном заносе [476], что, вероятно, свидетельствует о значимой роли генов отцовского происхождения в развитии данного осложнения беременности. Это также подтверждается результатами исследований [146, 414] в которых показано, что риск развития данной патологии значительно повышается в случаях наступления беременности от мужчин, рожденных матерями с ПЭ.
Определенный интерес в контексте ведущей роли плаценты в этиопатогенезе ПЭ представляет эволюционный подход к анализу генетической структуры предрасположенности к данной патологии беременности по системе генов, вовлеченных в молекулярные процессы, происходящие в плацентарной ткани [17]. Существует предположение, согласно которому риск развития гестационных осложнений, связанных с аномалиями плаценты (преэклампсия и послеродовое кровотечение) может быть следствием эволюционных процессов, которые действуют на гены, кодирующие протеины, вовлеченные в регуляцию глубины инвазии трофобласта [30].
Важно отметить, что глубокая инвазия трофобласта характерна только для гемохориального типа плаценты и является предрасполагающим фактором для патологий, связанных с нарушением степени его инвазивности [108, 138, 332, 369], например, преэклампсии. В то же время показано, что эпителиохориальный тип плацентации может обеспечить защитный эффект против развития данной патологии беременности [139]. Ранее считалось, что эпителиохориальный тип плаценты является «примитивным», на основе которого в ходе эволюции возникли новые виды млекопитающих с высоко инвазивной плацентой. Однако, расширение исследований, направленных на сравнение уровня плацентации в еще большем разнообразии таксонов [136], в сочетании со статистическими моделями эволюционного процесса [76, 136, 282, 465] убедительно свидетельствуют об обратном. В настоящее время, показано, что самые ранние плацентарные млекопитающие обладали гемохориальной и эндотелиохориальной плацентацией, в то время как эпителиохориальный тип плаценты является сравнительно недавним эволюционным приобретением, возникшим в нескольких таксономических группах независимо друг от друга. Именно гемохориальную плаценту человека в некоторых отношениях можно назвать «примитивной», поскольку происхождение такого типа плаценты последовательно прослеживается до самых ранних видов млекопитающих, живших около 200 миллионов лет назад [139]. На рисунке 5 представлена характеристика типа плацентации у представителей грандотряда Euarchonta.
Было высказано предположение, что высоко инвазивная гемохориальная плацента необходима для развития большого мозга [99, 133, 368]. В этом случае, риск возникновения ПЭ у человека является расплатой за умственные способности. Тем не менее, в ряде исследований [74, 77, 137, 273] не обнаружено никаких доказательств того, что виды с гемохориальной плацентацией имеют больший размер мозга, чем виды с другими типами плаценты. Такое объяснение не может рассматриваться в качестве подтвержденного, поскольку польза гемохориального типа плаценты, обеспечивающего быстрое внутриутробное развитие мозга у человека, является неоправданно высокой ценой, приводящей к возможному развитию ПЭ [139]. Существует мнение, согласно которому при рассмотрении характера плацентации в контексте всего класса млекопитающих человек и другие приматы, вероятно, имеют «неправильный» тип плаценты.
Инвазивная гемохориальная плацента человека может являться не следствием адаптивной эволюционной стратегии, а отражением «случайного закрепления» неблагоприятного фенотипа [139]. Вероятно, центральная эволюционная проблема беременности человека состоит не в том «почему человеческая плацента настолько инвазивна?», а в том «почему человеческая плацента не эпителиохориального типа?» [139].
Результаты, полученные M.G. Elliot с соавт. [138] подтверждают гипотезу о том, что общий набор генов и патофизиологических процессов, лежащих в основе плацентарной инвазии у надотряда Euarchontoglires (грызуны, зайцеобразные, тупайи, шерстокрылы и приматы), ассоциирован с патогенезом ПЭ у человека. Кроме того, свидетельствуют о конвергентной эволюции менее инвазивных (эндотелиохориального и эпителиохориального) типов плаценты. Так, анализ 16578 белок-кодирующих генов в 18 таксонах (из которых: 14 - имеют гемохориальный, 2 - эпителиохориальный, 2 - эндотелиохориальный тип плаценты) выявил 1254 гена, подвергавшиеся адаптивной эволюции, направленной на уменьшение инвазивных свойств плаценты [138]. Вероятно, действие адаптивной эволюции приводит к формированию компенсаторных мутаций в белках, которые экспрессируются в организме плода и/или матери в ответ на регуляторную эволюцию как части процесса «генетического конфликта интересов», возникающего в результате избыточной плацентарной инвазии [107, 138, 183, 332, 499]. Эти результаты согласуются с другим исследованием, в котором одна ветвь филогенетического дерева ассоциируется с повышением инвазивных свойств плаценты вследствие эволюции спиральных артерий [108].
Некоторыми авторами предложена гипотеза, согласно которой риск развития ПЭ может быть следствием действия естественного отбора на гены, продукты которых вовлечены в регуляцию глубины инвазии трофобласта и ремоделирование спиральных артерий [30, 77, 108, 332]. Предполагается, что в эволюции степени инвазивности плаценты в линии предков человекообразных обезьян участвовал положительный отбор, направленный на гены, продукты которых определяют глубину инвазии цитотрофобласта и ремоделирование спиральных артерий [332]. Так, E.J. Crosley с коллегами в 2013 году была проведена оценка роли действия естественного отбора на формирование генетической структуры белок-кодирующих участков 18000 генов, экспрессирующихся в плацентарной ткани при физиологической беременности. Авторы показали, что 295 генов на ветках предков Hominidae (человек, шимпанзе, горилла, орангутан) и 264 гена на ветках предков Homininae (человек, шимпанз, горилла) находятся под действием положительного отбора. Интересно, что согласно результатам функциональной аннотации данных генов, значительная часть этих локусов, имеет отношение к риску развития ПЭ [108].
В настоящее время предметом многочисленных дискуссий остается роль действия естественного отбора на протеин-кодирующие гены в формировании фенотипического разнообразия. Однако показано, что наибольшее функциональное значение может иметь естественный отбор, направленный на регуляцию транскрипции, чем на изменение белок-кодирующих последовательностей [236, 480, 481]. Важно отметить, что характерно преобладание нейтрального дрейфа и стабилизирующего отбора, а не положительного отбора [138, 225, 234, 233]. Результаты недавних исследований свидетельствуют о том, что глубина инвазии трофобласта и ремоделирование спиральных артерий одинакова для представителей подсемейства Homininae: человека, шимпанзе, гориллы. В то же время, отличительной чертой семейства Hylobatidae (гиббон) является малая глубина инвазии трофобласта и отсутствие ремоделирования спиральных артерий на более глубоких уровнях миометрия (таблица 7) [77, 108]. Важно отметить, что развитие ПЭ характерно, прежде всего, для человека [33, 139, 369], однако имеются редкие сообщения о возникновении данной патологии у обезьян: горилл [47, 448], шимпанзе [435], макак [244]. Продолжительность беременности человека превышает срок гестации у гориллы, шимпанзе и орангутана, что вероятно, свидетельствует о эволюционных преимуществах продолжительного гестационного периода [130]. Кроме того, характерной чертой является необычно крупные новорожденные [326], что вероятно ассоциированно с большими размерами человеческого мозга [109]. Даже по сравнению с другими приматами, у человека эти особенности в сочетании с гемохориальным типом плаценты, способны приводить к необычно высокому риску окислительного стресса и сосудистого повреждения в плаценте во время беременности [139].
Характеристика генетического разнообразия изученных rSNP
В настоящей работе проведен анализ ассоциации 46 rSNP 21 ДЭГ плаценты с развитием преэклампсии в этнических выборках русских и якутов: пять rSNP (rs1523469, rs3774298, rs3821817, rs75777727, rs3733018) гена BCL6, кодирующего белок цинковых пальцев 51; четыре rSNP (rs11130215, rs12489120, rs6779816, rs7635972) гена BHLHE40, кодирующего белок E40 с основным доменом спираль-петля-спираль; полиморфный вариант rs12691 гена CEBPA, кодирующего CCAAT/энхансерсвязывающий белок ; пять rSNP (rs10985257, rs2231656, rs56916178, rs735111, rs78486797) гена коронина 2A (CORO2A); полиморфный вариант rs11545664 гена эндоглина (ENG); полиморфный вариант rs9370165 гена глутатион S-трансферазы альфа 3 (GSTA3); два rSNP (rs10496196, rs3771787) гена гексокиназы 2 (HK2); полиморфный вариант rs72959687 гена -субъединицы белковых комплексов ингибина А и В (INHA); полиморфный вариант rs56051972 гена кератина 19 (KRT19); полиморфный вариант rs2167270 гена лептина (LEP); полиморфный вариант rs10423795 гена полипептида лютеинизирующего гормона (LHB); четыре rSNP (rs12678229, rs2227262, rs2977559, rs3802252) гена цитоплазматического белка суперсемейства гидролаз (NDRG1); два rSNP (rs10753141, rs12083094) гена паппализина 2 (PAPPA2); три rSNP (rs10757027, rs12686810, rs113968629) гена перилипина 2 (PLIN2); два rSNP (rs2532058, rs66707428) гена, кодирующего регуляторную субъеденицу 12С фосфатазы 1 (PPP1R12C); четыре rSNP (rs1654439, rs1671169, rs1671215, rs8113032) гена ретинолдегидрогеназы 13 (RDH13); два rSNP (rs2493911, rs34845949) гена, кодирующего SAM-SH3-доменсодержащий белок 1 (SASH1); полиморфный вариант rs12609771 гена Ig-подобного лектина 6, связывающего сиаловую кислоту (SIGLEC6); два rSNP (rs56153523, rs8109071) гена, кодирующего белок Syd-1 гомолог 1 (SYDE1); полиморфный вариант rs36011588 гена трансмембранного белка 136 (TMEM136); два rSNP (rs79116633, rs7245838) гена белка цинковых пальцев 175 (ZNF175). Включенные в исследование гены являются новыми генами-кандидатами данного осложнения беременности и были впервые выявлены благодаря анализу транскриптома плацентарной ткани.
В таблице 15 представлены показатели гетерозиготности по изученным rSNP и уровень значимости, полученный при оценке соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга.
Отклонение соответствия распределения частот генотипов равновесию Харди Вайнберга показано для ряда исследованных rSNP. Так, в популяционной выборке якутов: rs2227262, rs3802252 гена NDRG1 и rs56051972 гена KRT19 в контрольной группе; rs12489120, rs6779816 гена BHLHE40 и rs34845949 гена SASH1 в группе больных ПЭ. В популяционной выборке русских: rs12083094 гена PAPPA2, rs78486797 гена CORO2A в группе контроля; rs10985257, rs2231656 гена CORO2A, rs9370165 гена GSTA3, rs72959687 гена INHA, rs56051972 гена KRT19, rs10423795 гена LHB в группе больных ПЭ. Статистически значимые отклонения наблюдаемых гетерозиготностей по изученным полиморфным вариантам от ожидаемых по закону Харди-Вайнберга, могут отражать специфику популяционно-генетических процессов, происходящих в популяции. Влияние могут оказывать следующие факторы: генетико-демографическая структура популяции (отсутствие панмиксии, популяционная подразделенность), функциональная значимость полиморфного варианта и вероятное действие естественного отбора [29]. Минимальная ожидаемая гетерозиготность (He) наблюдалась для четырех полиморфных вариантов во всех изученных группах: rs7635972 гена BHLHE40, rs78486797 гена CORO2A, rs2493911 гена SASH1 во всех этнических выборках; rs79116633 гена ZNF175 в этнической выборке русских. В некоторых изученных группах (таблица 15) показана максимальная ожидаемая гетерозиготность (He=0.50) для следующих полиморфных вариантов: rs3733018, rs3774298 гена BCL6; rs10423795 гена LHB; rs12678229, rs2977559, rs3802252 гена NDRG1; rs10753141 гена PAPPA2; rs12686810 гена PLIN2; rs8113032 гена RDH13; rs56153523 гена SYDE1; rs36011588 гена TMEM136; rs7245838 гена ZNF175.
Средняя ожидаемая гетерозиготность по всем изученным rSNP в группе контроля составила: в этнической выборке русских - 0.31; якутов - 0.29.
Распределение частот аллелей и генотипов исследованных rSNP в группе больных преэклампсией и контрольной группы в этнических выборках русских и якутов приведены в таблице 16. Из 46 изученных rSNP полиморфными оказались все, за исключением: rs7635972 гена BHLHE40 и rs2493911 гена SASH1 во всех обследованных группах этнических выборок русских и якутов; rs78486797 гена CORO2A во всех изученных группах этнической выборки якутов и группе больных ПЭ в этнической выборке русских; rs79116633 гена ZNF175 во всех изученных группах этнической выборки русских.
В таблице 17 представлены значения критерия 2 и уровень значимости, полученные при сравнении частот генотипов между контрольными группами или между группами больных преэклампсией, принадлежащих этническим выборкам русских и якутов. Характеристика генетического разнообразия в группах контроля из этнических выборок русских и якутов показала статистически значимые различия в распределении частот генотипов 27 полиморфных вариантов 19 ДЭГ: rs1523469 и rs3821817 гена BCL6; rs11130215 и rs12489120 гена BHLHE40; rs12691 гена CEBRA; rs56916178 гена CORO2A; rs11545664 гена ENG; rs9370165 гена GSTA3; rs10496196 и rs3771787 гена HK2; rs72959687 гена INHA; rs56051972 гена KRT19; rs10423795 гена LHB; rs12678229, rs2227262 и rs3802252 гена NDRG1; rs10753141 и rs12083094 гена PAPPA2; rs10757027 гена PLIN2; rs2532058 гена PPP1R12C; rs34845949 гена SASH1; rs12609771 гена SIGLEC6; rs56153523 и rs8109071 гена SYDE1; rs36011588 гена TMEM136; rs7245838 и rs79116633 гена ZNF175.
При сравнении частот генотипов между группами больных ПЭ, принадлежащих этническим выборкам русских и якутов, статистически значимые различия наблюдались для 27 rSNP 20 ДЭГ: rs3774298 гена BCL6; rs11130215, rs12489120 и rs6779816 гена BHLHE40; rs12691 гена CEBRA; rs10985257 гена CORO2A; rs11545664 гена ENG; rs9370165 гена GSTA3; rs10496196 и rs3771787 гена HK2; rs72959687 гена INHA; rs56051972 гена KRT19; rs2167270 гена LEP; rs10423795 гена LHB; rs12678229 и rs3802252 гена NDRG1; rs12083094 гена PAPPA2; rs10757027 гена PLIN2; rs2532058 гена PPP1R12C; rs1654439 и rs1671215 гена RDH13; rs12609771 гена SIGLEC6; rs56153523 и rs8109071 гена SYDE1; rs36011588 гена TMEM136; rs7245838 и rs79116633 гена ZNF175.
Результаты анализа генетического разнообразия распределения частот генотипов между группами контроля и между группами больных преэклампсией этнических выборок русских и якутов представлены на рисунке 14. Различия наблюдались для 12 rSNP 10 ДЭГ: 6 rSNP 5 ДЭГ в контрольных группах (rs1523469 и rs3821817 гена BCL6, rs56916178 гена CORO2A, rs2227262 гена NDRG1, rs10753141 гена PAPPA2, rs34845949 гена SASH1) и 6 rSNP 5 ДЭГ в группах с ПЭ (rs3774298 гена BCL6, rs6779816 гена BHLHE40, rs10985257 гена CORO2A, rs2167270 гена LEP, rs1654439 и rs1671215 гена RDH13). Частота предкового аллеля была выше у русских по 17 rSNP 11 ДЭГ: rs1523469, rs3821817 и rs3774298 гена BCL6; rs11130215 гена BHLHE40; rs12691 гена CEBRA; rs9370165 гена GSTA3; rs3771787 гена HK2; rs12678229 гена NDRG1; rs10753141 и rs12083094 гена PAPPA2; rs1654439 и rs1671215 гена RDH13; rs56153523 и rs8109071 гена SYDE1; rs36011588 гена TMEM136; rs7245838 и rs79116633 гена ZNF175. У якутов частота предкового аллеля была выше по 16 rSNP 13 ДЭГ: rs12489120 и rs6779816 гена BHLHE40; rs10985257 и rs56916178 гена CORO2A; rs11545664 гена ENG; rs10496196 гена HK2; rs72959687 гена INHA; rs56051972 гена KRT19; rs2167270 гена LEP; rs10423795 гена LHB; rs2227262 и rs3802252 гена NDRG1; rs10757027 гена PLIN2; rs2532058 гена PPP1R12C; rs34845949 гена SASH1; rs12609771 гена SIGLEC6. Наблюдаемая вариабельность распределения частот генотипов в изученных выборках, вероятно, отражает эволюционные процессы, происходившие в ходе формирования данных популяций.
Оценка роли естественного отбора в формировании структуры исследуемых дифференциально-экспрессирующихся генов и их регуляторных полиморфных вариантов на макроэволюционном уровне
Поиск сигналов естественного отбора по изученным сорока шести дифференциально-экспрессирующимся генам, впервые выявленным при анализе транскриптома плацентарной ткани, осуществляли с помощью оценки отношения числа несинонимичных замен на несинонимичный сайт к числу синонимичных замен на синонимичный сайт (тест dN/dS) в ряду представителей отряда Primates (таблица 24).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что белок-кодирующие участки гена SIGLEC6 являются эволюционно нейтральными при сопоставлении генов-ортологов макаки и человека (dN/dS=1.04). В тоже время, для большинства изученных генов-ортологов представителей отряда Primates и человека характерно сохранение структуры белка вследствие действия очищающего отбора, поскольку соотношение dN/dS меньше 1 [258, 464]. Так, сигналы действия очищающего отбора были выявлены при сопоставлении генов-ортологов человека и: лемура - 40 генов (ACOXL, BCL6, BHLHE40, CEBPA, CGA, CGB1, CGB5, CORO2A, CRH, CRHBP, ENG, EPAS1, F5, FLT1, FSTL3, GBA, GSTA3, HEXB, HK2, HTRA4, INHA, KRT19, LEP, LHB, MAN1C1, NDRG1, PAPPA2, PLIN2, PPP1R12C, PROCR, QPCT, RDH13, SASH1, SIGLEC6, SLCO2A1, SPAG4, ST5, SYDE1, TMEM136, ZNF175); галаго - 43 гена (ACOXL, BCL6, BHLHE40, CA10, CEBPA, CGA, CGB1, CGB5, CORO2A, CRH, CRHBP, EBI3, ENG, EPAS1, F5, FLT1, FSTL3, GBA, GSTA3, HEXB, HK2, HTRA4, INHA, INHBA, KRT19, LEP, LHB, MAN1C1, NDRG1, PAPPA2, PLIN2, PPP1R12C, PROCR, QPCT, RDH13, SASH1, SIGLEC6, SLCO2A1, SPAG4, ST5, SYDE1, TMEM136, ZNF175); макаки - 39 генов (ACOXL, BCL6, BHLHE40, CA10, CEBPA, CGB1, CGB5, CORO2A, CRH, CRHBP, EBI3, ENG, EPAS1, F5, FLT1, GBA, GSTA3, HEXB, HK2, HTRA4, INHA, KRT19, LEP, LHB, MAN1C1, NDRG1, PAPPA2, PLIN2, PPP1R12C, PROCR, QPCT, RDH13, SASH1, SLCO2A1, SPAG4, ST5, SYDE1, TMEM136, ZNF175); гиббона - 25 генов (BHLHE40, 151 CGA, CGB1, CGB5, EBI3, FLT1, KRT19, LEP, LHB, MAN1C1, NDRG1, PAPPA2, PLIN2, PPP1R12C, PROCR, QPCT, RDH13, SASH1, SIGLEC6, SLCO2A1, SPAG4, ST5, SYDE1, TMEM136, ZNF175); орангутана - 35 генов (ACOXL, BCL6, BHLHE40, CGA, CGB1, CGB5, CORO2A, CRH, CRHBP, EBI3, ENG, EPAS1, F5, FLT1, FSTL3, GBA, HEXB, HK2, INHA, KRT19, LEP, MAN1C1, NDRG1, PAPPA2, PLIN2, PPP1R12C, QPCT, RDH13, SASH1, SIGLEC6, SPAG4, ST5, SYDE1, TMEM136, ZNF175); шимпанзе - 36 генов (BCL6, CA10, CEBPA, CGB5, CORO2A, EBI3, ENG, EPAS1, F5, FLT1, FSTL3, GBA, GPSN2, GSTA3, HEXB, HK2, HTRA4, INHA, KRT19, LEP, LHB, MAN1C1, NDRG1, PAPPA2, PLIN2, PPP1R12C, PROCR, QPCT, RDH13, SASH1, SIGLEC6, SLCO2A1, ST5, SYDE1, TMEM136, ZNF175). Важно отметить, что отсутствие несинонимичных замен (dN=0) и значение отношения dN/dS близкое к нулю свидетельствует о действии сильного очищающего отбора [245].
Действие такого типа отбора было выявлено для шести генов: BHLHE40 (при сопоставлении генов-ортологов шимпанзе и человека), CA10 (при сопоставлении генов-ортологов: лемура и человека, орангутана и человека), CRH (при сопоставлении генов-ортологов шимпанзе и человека), CRHBP (при сопоставлении генов-ортологов шимпанзе и человека), INHBA (при сопоставлении генов-ортологов: лемура и человека, макаки и человека, орангутана и человека, шимпанзе и человека), SPAG4 (при сопоставлении генов-ортологов шимпанзе и человека). Примечательно, что действие очищающего отбора показано одновременно для всех исследуемых групп (при сопоставлении генов-ортологов представителей отряда Primates и человека) только для 19 генов: BHLHE40, CGB5, FLT1, KRT19, LEP, MAN1C1, NDRG1, PAPPA2, PLIN2, PPP1R12C, QPCT, RDH13, SASH1, SIGLEC6, SPAG4, ST5, SYDE1, TMEM136, ZNF175. Сигналы действия положительного отбора обнаружены для двух генов: CGA (при сопоставлении генов-ортологов: макаки и человека (dN/dS=1.78), шимпанзе и человека (dN/dS=1.65)), GSTA3 (при сопоставлении генов-ортологов орангутана и человека (dN/dS=1.19)), что может свидетельствовать как о закреплении новых белковых структур, так и о прекращении отрицательного отбора против изменений структуры белка [464].
Согласно полученным результатам, очищающий отбор является значимым эволюционным фактором, действующим на белок-кодирующие части исследованных генов-ортологов. Таким образом можно предположить, что ортологичные участки генома кодируют белки, выполняющие у дивергировавших современных видов сходную функцию с функцией, которую выполняли белки у предкового вида [8].
Для оценки роли действия естественного отбора на формирование генетической структуры регуляторных участков исследуемых 46 генов был использован новый вычислительный метод INSIGHT [39, 177]. Оценку вклада слабого очищающего, сильного очищающего и положительного отбора осуществляли с помощью сгенерированной вероятностной модели, построенной на основании данных о геномах внешней группы сравнения (представители парвотряда Catarrhini: шимпанзе, орангутан и макака-резус) и человека (полногеномные сиквенсы 54 неродственных индивидуумов, охватывающих 11 популяций). Поиск сигналов естественного отбора проводили в 9743 сайтах, из которых 920 относились к регуляторным полиморфным вариантам 46 дифференциально-экспрессирующихся генов плацентарной ткани при преэклампсии и физиологично протекающей беременности, тогда как 8823 уникальных сайта были представлены участками генома, расположенными на расстоянии ±5 bp от идентифицированных rSNP.
На первом этапе расчетов из дальнейшего анализа автоматически были исключены 4449 сайтов, что было связано с рядом причин: сайты исключены на этапе геномной фильтрации, отсутствуют данные о полиморфном варианте или данные о сиквенсах внешней группы сравнения недостаточны для проведения анализа. Следует отметить, что из 46 включенных в исследование rSNP на первом этапе расчетов были исключены 23 rSNP: rs3774298, rs3821817 гена BCL6; rs11130215, rs12489120, rs7635972 гена BHLHE40; rs56916178, rs735111 гена CORO2A; rs10496196 гена HK2; rs56051972 гена KRT19; rs2167270 гена LEP; rs10423795 гена LHB; rs12678229, rs3802252 гена NDRG1; rs10753141, rs12083094 гена PAPPA2; rs113968629, rs12686810 гена PLIN2; rs66707428 гена PPP1R12C; rs1671169, rs8113032 гена RDH13; rs56153523, rs8109071 гена SYDE1; rs7245838 гена ZNF175. Из оставшихся 5294 сайтов - 397 относились к изучаемым rSNP, в то время как 4897 сайтов представляли участки генома, расположенные на расстоянии ±5 bp от регуляторных полиморфных вариантов.
На рисунке 28 представлена характеристика изученных 5294 участков генома, основанная на апостериорных вероятностях, рассчитанных методом INSIGHT. Необходимо отметить, что из 397 проанализированных rSNP, действие слабого очищающего отбора показано для 206 rSNP. Полиморфными и нейтральными сайтами являются 144 rSNP, из которых: 1 rSNP с низкой частотой производного аллеля (5-35%), 132 rSNP со средней частотой производного аллеля (36-65%), 11 rSNP с высокой частотой производного аллеля (65-95%). Сорок шесть rSNP с высокой вероятностью относятся к мономорфным, недивергентным и нейтральным сайтам. Тогда как только один rSNP является мономорфным, дивергентным и нейтральным сайтом. Примечательно, что среди 4897 сайтов, располагающихся на расстоянии ±5 bp от исследованных rSNP, 99% (4866 сайтов) с высокой вероятностью являются мономорфными, недивергентными и нейтральными сайтами, тогда как 20 сайтов - мономорфные, дивергентные и нейтральные и только 11 сайтов - полиморфные, с низкой частотой производного аллеля и под отбором.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что очищающий отбор на таком значительном филогенетическом расстоянии является значимым эволюционным фактором, действующим на регуляторные участки исследуемых генов. Так, из 397 проанализированных rSNP у 52% (206 rSNP) продемонстрировано действие слабого очищающего отбора, тогда как из 46 rSNP 21 ДЭГ, включенных в диссертационное исследование, действие слабого очищающего отбора показано для 12 rSNP 9 ДЭГ: rs1523469 и rs75777727 гена BCL6, rs6779816 гена BHLHE40, rs10985257, rs2231656 и rs78486797 гена CORO2A, rs3771787 гена HK2, rs72959687 гена INHA, rs2227262 гена NDRG1, rs1654439 гена RDH13, rs34845949 гена SASH1, rs79116633 гена ZNF175. Не было обнаружено действие сильного очищающего и положительного отбора.