Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема генетической изменчивости, механизмы ее поддержания и важность для эволюции была и остается одной из основных и далеко не разрешенных проблем эволюционной биологии (Алтухов, 1989; Lewontin, 1974; Ayala, 1976; Kimura, 1983; Nei, 1987). С одной стороны, убедительно показано, что нейтральные факторы играют значительную роль в динамике генетической изменчивости (Kimura, 1983). С другой стороны, выявлено, что потеря изменчивости или повышение ее уровня, например, в результате антропогенных воздействий, может иметь негативные последствия для вида (Алтухов, 1989, 1995; Mitton, 1998). Неясность данного вопроса во многом связана с методологией анализа генетической изменчивости. До недавнего времени исследователям были доступны методы, характеризующие генетическую изменчивость лишь частично или косвенно (аллозимы, рестрикционный анализ и др.). Результаты этих работ, хотя и показали наличие огромного резерва изменчивости на молекулярном уровне, тем не менее, не позволили с необходимой ясностью объяснить причины и механизмы, обусловливающие поддержание изменчивости в популяциях.
Разработка методов секвенирования и амплификации ДНК (Sanger et al., 1977; Maxam and Gilbert, 1980; Mullis et al., 1986) в корне изменила ситуацию. Появилась возможность исследовать изменчивость на уровне нуклеотидных последовательностей - исчерпывающем уровне организации генома. Начиная с пионерской работы Мартина Крейтмана (Kreitman, 1983), впервые применившего метод секвенирования ДНК для исследования внутривидовой нуклеотидной изменчивости гена алкогольдегидрогеназы у Drosophila melanogaster, эволюционная и популяционная генетика вышла на новые рубежи. В результате быстрого методического прогресса можно говорить о революции в эволюционной биологии, обусловленной широким использованием ДНК технологий (см., например, Алтухов и Салменкова, 2002; Cavalli-Sforza, 1998).
До настоящего времени, однако, работ по секвенированию полных нуклеотидных последовательностей генов на популяционном уровне мало. Более того, имеющиеся данные в основном ограничены анализом отдельных генов, а не мультигенных семейств, что препятствует комплексному пониманию механизмов поддержания нуклеотидного полиморфизма и эволюции дупликаций генов, особенно тех, которые имеют преждевременные стоп-кодоны и другие повреждения, позволяющие классифицировать их как псевдогены. Если наличие одной копии гена является достаточным условием для удовлетворения потребностей организма, принимается, что мутации псевдогенов (повреждающие или нет) не подвергаются действию негативного отбора, и имеют равную вероятность фиксации в популяции (Kimura, 1980; Li et al, 1981; Gojobori et al, 1982, Li, 1983; Graur and Li, 2000). Отсюда следует,
ЛЬНА*I
V J
fос. национальная j вИКЛ«ОТЕСА
мпяпг
что вследствие быстрой аккумуляции рекуррентных мутаций псевдогены неизбежно должны подвергаться дегенеративному процессу и трансформироваться в фон окружающей их ДНК (см., например, Graur et а]., 1989). Однако даже в случае фиксации нуль-аллелей и полного превращения дуплицированной копии в псевдоген последующий процесс генетической дегенерации не очевиден. Фактически случаи значительной дегенерации описаны только для облигатных внутриклеточных паразитов как результат длительной ассоциации с эукариотическим хозяином (Andersson and Andersson, 2001; Moran, 2002).
Важны вопросы, касающиеся механизмов, определяющих не только уровень, но и характер распределения изменчивости. Понимание генома как совокупности относительно независимых генов (генетика '"мешка с бобами") было характерной чертой классического периода развития генетики. Начиная с двадцатых годов прошлого века, взаимодействие генов играет существенную роль в теории эволюции (Животовский, 1984; Wright, 1931; Dobzhansky, 1937, 1955; Schmalhausen, 1946; Mather, 1953; Waddington, 1957; Mayr, 1963). Неравновесие no сцеплению (неслучайные ассоциации) между аллелями или группами нуклеотидов может служить признаком эпистатических взаимоотношений, и на протяжении нескольких последних десятилетий большая эмпирическая работа была посвящена выяснению вопроса о степени и характере межлокусных взаимодействий. Проблема неслучайных ассоциаций генов также важна в связи с длительно продолжающейся нейтралистско-селекционистской полемикой (Алтухов, 1989; Kimura, 1968, 1983; Ayala et al., 1971; Kimura and Ohta, 1971; Lewontin, 1974). Неравновесие по сцеплению рассматривается как сильный аргумент в пользу отбора, особенно если ассоциации имеют согласующийся характер в различных популяциях (Lewontin, 1974). До сих пор, однако, исследования неравновесия по сцеплению носят спорадический характер, и, как следствие, отсутствует ясное понимание механизмов, обусловливающих возникновение существенных межлокусных взаимодействий на молекулярном уровне.
Решение очерченных выше проблем видится в анализе полиморфизма и дивергенции нуклеотидных последовательностей совместно для разных генов, а также разных функциональных регионов в пределах генов. Для этого мы подробно исследуем небольшое мультигенное семейство Р-эстераз в четырех природных популяциях D. melanogaster (Африка, Европа, Северная и Южная Америка) и у семи близких видов подгруппы melanogaster Кроме этого, мы исследуем три других гена, сцепленных с fi-эстеразами. superoxid dismutase (Sod), tinman (tin) и bagpipe (bap), в однократной выборке из популяции Северной Америки.
І е»« ** «о
(З-эстеразное мультигенное семейство включает два гена, Est-б и Est-P (синонимы Est-P- yEst-6 и Est-7) с одинаковой 5' —> 3' ориентацией и располагается у D. melanogaster на левом плече третьей хромосомы в позиции 68F7-69A1. Два гена обнаруживают соответственно 64 и 60% сходства на уровне ДНК и белка (Collet et al., 1990).
У D. melanogaster ген Est-6 кодирует /3-карбоксилэстеразу (EST-6) (Johnson et al., 1966; Корочкин, 1995), которая переносится в семенной жидкости от самцов к самкам в процессе копуляции (Richmond et al, 1980) и влияет на последующее поведение и склонность к спариванию у самок (Gromko et al., 1984). Est-6 является одним из наиболее интенсивно исследованных молекулярных маркеров в биохимической, популяционной и эволюционной генетике Drosophila (Корочкин, 1995; Oakeshott et al., 1989, 1993, 1995; Korochkin et al., 1990; Richmond et al., 1990). Полученные данные предполагают, что аллозимный полиморфизм EST-6 у D. melanogaster поддерживается позитивным отбором, что подтверждается, например, существенными различиями биохимических свойств основных (F и S) аллозимов, наличием клинальной изменчивости и сложной динамикой частот аллозимов в экспериментальных условиях Однако в разных лабораториях мира обнаружены парадоксальные несоответствия биохимических свойств F и S аллозимов; проблематичным оказались для интерпретации результаты исследований генетической динамики аллозимов в лабораторных экспериментах, противоречивые сведения получены и по клинальной изменчивости (см. обзоры Oakeshott et al., 1989, 1993). Как результат этих противоречивых данных, действие позитивного отбора на Est-б подвергалось сомнению, и этот ген рассматривался как нейтральный стандарт при популяционно-генетических исследованиях (Hamblin and Aquadro, 1997, стр. 1056). Таким образом, очевидна необходимость исследования изменчивости Est-6 на нуклеотидном уровне для выяснения механизма, поддерживающего изменчивость этого гена.
Информация по Est-P значительно более ограниченна, чем по Est-
6. Функция этого гена не известна и аллозимная изменчивость не изучена.
Коллет и ее соавторы (Collet et al., 1990), впервые обнаружившие и
описавшие Est-P, предположили, что данный ген является
функциональным, основываясь на ряде признаков, таких как транскрипционная активность, интактные сайты сплайсинга, отсутствие преждевременных стоп-кодонов, присутствие кодонов инициации и терминации. Однако, исследовав небольшую выборку (10 линий) D. melanogaster из Северной Америки (Калифорния), мы (Balakirev and Ayala, 1996) обнаружили преждевременные стоп-кодоны и выявили другие признаки, указывающие на то, что Est-P может являться псевдогеном, который мы обозначили как . Думанцик и ее соавторы (Dumancic et al., 1997) показали, что некоторые аллели Est-P продуцируют
каталитически активную эстеразу, соответствующую ранее идентифицированному изоферменту EST-7 (Healy et al, 1991), и в соответствии с этим переименовали ген в Est-7. В настоящей работе для обозначения дупликации гена Est-б мы используем символ цгЕм-б, предложенный нами ранее (Balakirev and Ayala, 1996) Сложившаяся ситуация поставила вопрос о природе и стимулировала его дальнейшее исследование.
Гены tin и bap являются членами NK семейства гомеобокс-содержащих генов, расположенных на правом плече третьей хромосомы у Drosophila melanogaster (позиция 93DE). Выявлено иерархическое взаимоотношение между генами tin и bap (Azpiazu and Frasch, 1993; Bodmer, 1993). До настоящего времени информация по изменчивости нуклеотидных последовательностей гомеобокс-содержащих генов чрезвычайно ограничена, хотя показано глобальное влияние этих генов на процесс индивидуального развития организмов (Корочкин, 2002)
Ген Sod расположен на левом плече третьей хромосомы у Drosophila melanogaster (позиция 68А7) и кодирует фермент, защищающий клетки от повреждающих воздействий свободных радикалов кислорода (Fridovich, 1986) При исследовании природных и лабораторных популяций D melanogaster обнаружено неравновесие по сцеплению между аллозимным полиморфизмом Est-б и Sod (Smit-McBride et al., 1988). Механизм неравновесия между генами остался невыясненным, что диктует необходимость исследования межлокусиых ассоциаций на уровне нуклеотидных последовательностей Исходные данные по полиморфизму гена Sod взяты из литературы (Hudson et al, 1994, 1997).
Таким образом, Р-эстеразпый кластер генов представляется нам удобной модельной системой, включающей функциональный ген {Est-б) и предполагаемый псевдоген (yEst-б), для исследования механизмов поддержания генетической изменчивости и эволюции дупликаций в мультигенном семействе. Исследование генов Sod, tin и bap мотивировано тем, что эти гены, также как и fl-эстеразы, располагаются у D. melanogaster на третьей хромосоме. Их исследование (наряду с самостоятельной значимостью) позволит учесть возможное влияние регионального хромосомного эффекта и таким образом обеспечит более обоснованную интерпретацию данных, полученных для Р-эстеразных генов.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы -исследование изменчивости нуклеотидных последовательностей (J-эстеразпых генов Est-б и , а также сцепленных с ними генов Sod, bap и tin у близких видов подгруппы Drosophila melanogaster для выяснения механизмов поддержания генетической изменчивости, межлокусиых взаимодействий и эволюции дупликаций. Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Клонировать и секвенировать гены Est-б и , а также сцепленные с ними гены tin и bap у близких видов подгруппы Drosophila melanogaster.
2 Провести детальный анализ полиморфизма, дивергенции и других характеристик изменчивости полных нуклеотидных последовательностей генов Est-б и yEst-б и фланкирующих областей в четырех выборках D melanogaster из природных популяций Африки, Европы, Северной и Южной Америки, а также у близких видов, входящих в подгруппу melanogaster.
3. Исследовать полиморфизм нуклеотидных последовательностей
генов Sod, tin и bap в выборке из североамериканской популяции D.
melanogaster и у близких видов подгруппы Drosophila melanogaster.
4. Определить эволюционные факторы, формирующие и
поддерживающие паттерны изменчивости последовательностей Est-6,
yEst-6, Sod, bap и tin; установить механизмы, обеспечивающие
межлокусные взаимодействия и определяющие эволюцию дупликаций в
исследованных мультигенных семействах.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведен анализ изменчивости полных последовательностей Est-6 и в четырех природных популяциях Drosophila melanogaster и у семи видов подгруппы D. melanogaster. Впервые исследован нуклеотидный полиморфизм гомеобокс-содержщих генов tin и bap Результаты работы ясно показывают существенную роль различных типов позитивного отбора (направленного и балансирующего) при формировании паттернов нуклеотидной изменчивости Показано, что межлокусные взаимодействия играют существенную роль в распределении изменчивости исследованных генов Позитивный отбор рассматривается как наиболее вероятная причина межлокусных ассоциаций. Впервые проведено сравнительное исследование структурной энтропии гена Est-6 и предполагаемого псевдогена . Обнаружено, что структурная энтропия является нуклеотид-зависимой и связана с ГЦ составом генов Увеличение уровня энтропии не является совершенно случайным процессом. Делается вывод, что псевдогены являются важной частью генома, которая обеспечивает набор последовательностей, участвующих в его функционировании и эволюции. Результаты работы важны для более глубокого понимания структуры, функции и эволюции генома, проблем соотношения селективных и нейтральных популяционно-генетических факторов микроэволюции
Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на семинаре Института Хормеля (США. Остин, 26 июня 2000 г ); симпозиуме "Естественный отбор и нейтральная теория", Искья (Италия, Неаполь, 28-30 октября 2001 г.); семинаре Отделения экологии и эволюционной биологии Калифорнийского университета (США, Ирвайн, 6
июня 2003); семинаре зоологической станции Антон Дорн (Италия, Неаполь, 4 ноября 2003); семинарах Лаборатории Ф. X. Айалы (США, Ирвайн, Отделение экологии и эволюционной биологии, Калифорнийский университет, 1993, 1995 - 2004); заседании Ученого совета Академии экологии, морской биологии и биотехнологии ДВГУ (Владивосток, 4 ноября 2004); семинаре Института общей генетики им. Н. И. Вавилова (Москва, 11 ноября 2004).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 240 страницах; содержит 31 рисунок и 15 таблиц По теме диссертации опубликовано 14 работ в российских и международных рецензируемых журналах В генном банке (GenBank) размещены 228 нуклеотидных последовательностей генов Est-6, yEst-6, bap и tin под инвентарными номерами: AF147095 - 147102; AF150809 - AF150815; AF217624 -AF217645; AF526538 - AF526559; AY247664 - AY247713, AY247987 -AY248036; AY368077 - AY368109; AY369088 - AY369115; AY695919 -AY695924.