Эволюция вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в процессе развития СПИД Струнникова, Наталья Валерьевна

Введение к работе

Актуальности проблемы. С момента описания в 1984 г. ретровируса, . вызывающего развитие острого иммунодефицита у человека (ВИЧ-1), и до настоящего времени всё проведенные исследования не раскрыли полностью как особенности молекулярной организации самого вируса, так и механизмы разрушения иммунной системы человека. Попытки создания вакцины или противовирусного препарата до настоящего времег і также не увенчались успехом. Наиболее вероятной причиной этих неудач может быть то, что вирус обладает чрезвычайно высоким уровнем генетического разнообразия и, вследствие этого, широко варьирует по своим биологическим свойствам (Coffin, 1995). Такое уникальное внутривидовое генетическое разнообразие вируса иммунодефицита Привело к необходимости использования понятия "квазивида" для описания популяции близкородственных, но не идентичных геномов.

В организме пораженного вирусом человека одновременно может находиться до 10^е генетически различных вирусных частиц, причем с развитием > заболевания это число может увеличиваться (Wei, 1995). В основе такой "вариабельности лежит отсутствие корректорской функции у РНК-зависимой ДНК полимераэы вируса. В результате этого при синтезе ДНК частота возникновения мутаций составляет величину порядка 10"⁴/10"⁵ на геном вируса (Klarman et al., 1993; Roberts et al., 1988).

Дальнейшими исследованиями было показано, что степень изменчивости различна для раз.іьіх районов генома вируса (Dellasus et al., 1991). Одним из объектов для изучения генетического разнообразия вируса является ген env, кодирующий поверхностный гликопротеин др120 Он имеет в своем составе пять вариабельных участков, причем генетическая изменчивость одного из них (V3) оказывает непосредственное влияние на тд<ие важнейшие биологические свойства вируса, как способность индуцировать слияние клеток, патогенность, вирулентность и клеточный тропизм (Fouchier et al., 1992; WiDey et al., 1994). Было показано, что в основе синдрома иммунодефицита у человека может лежать как увеличение генетического разнообразия популяции вируса, так и появление в процессе развития заболевания новых более вирулентных вариантов вируса (Donaldson et al., 1994; Nowak et al., 1991). Однако недостатком проведенных исследований является отсутствие систематического и долговременного анализ-*

вирусной популяции от момента заражения ерганизма вирусом до развития синдрома иммунодефицита.

Одним из новых подходов к изучению изменчивости и эволюции вирусных вариантов в популяции in vivo является выделение и секвенирование коротких фрагментов геномя вируса с последующим количественным анализом филогенетических взаимоотношений между различными вирусными вариантами. Научный и практический интерес к такого рода исследованиям в настоящее время очевиден, поскольку они дают возможность выяснить взаимосвязь между эволюцией вирусной популяции и развитием заболевания.

Цели и запачи исследования. Целью данной работы было изучение динамики и разнообразия генетических изменений в популяции ВИЧ-1 с развитием заболевания у педиатрических пациентов in vivo. В связи с этим работа предусматривала решение следующих задач:

1. Используя метод гетеродуплексного анализа ДНК, а также конформационный анализ одноцепочечных молекул ДНК, оценить динамику распределения квазивидов ВИЧ-1 в популяции. Проследить, как изменяется доля каждого уникального вирусного варианта с течением заболевания у отдельного пациента.

2. Филогенетическими методами исследовать эволюционные взаимоотношения между различными квазивидами ВИЧ-1 путем сравнения нуклеотидных последовательностей двух гипервариабельных районов гена ет.

3. Путем сравнения аминокислотных последовательностей двух гипервариабельных районов гена em/у шести педиатрических пациентов провести анализ взаимоотношений между вирусными вариантами и установить взаимосвязь между генетической изменчивостью вируса и развитием иммунодефицита.

4. Используя оригинальную компьютерную программу, оценить скорость возникновения несинонимических и синонимических мутаций в различных районах генома ВИЧ-1 и провести сравнение с другими методами вычисления скоростей мутирования в вирусной популяции.

5. Определить, существует ли корреляция между скоростью возникновения различных типов мутаций в геноме Еируса и степенью развития заболевания у каждого индивидуума и установить взаимосвязь между возникновением специфических аминокислотных замен в функциональных районах генома ВИЧ-1,

ответственных за изменения фенотипа вируса, и развитием синдрома иммунодефицита.

Научная новизна работы. Впервые проведены детальные и долговременные исследования генетических изменений в популяции ВИЧ-1 у педиатрических пациентов на разных стадиях заболевания. Методами молекулярно-филогенетического анализа популяции впервые было продемонстрировано явление "конвергентной" или "параллельной" эвэлкгции на примере появления общего функционального мотива в районе петли V3 оболочки белка ВИЧ-1. Показана взаимосвязь между развитием иммунодефицита и появлением в популяции новых вирусных частиц с описанным ранее Т-лимфотропным мотивом в районе V3 белка оболочки вируса. С использованием нового подхода даны более реалистичные оцемки скорости возникновения несйнонимичьских и синонимических мутаций в разных районах генома вируса и проведено сравнение между новым и традиционным методами расчета скоростей мутирования. Для района C2/V3 белка оболочки гена env впервые выявлена корреляция между скоростью возникновения мутаций и прогрессированием иммунодефицита.

Практическая ценность: Создан банк нуклеотидных последовательностей с использованием РНК из свободных вирусных частиц плазмы крови. В соавторстве разработана («бвая компьютерная программа для вычисления скорости мутирования вирусной популяции. При расчете генетического расстояния данная программа позволяет наиболее полно учитывать всю информацию о генетическом разнообразии и частоте встречаемости каждого квазивида в постоянно меняющейся популяции вируса. Разработан подход для сравнительного анализа большой выборки нуклеотидных последовательностей, позволяющий отбор и дальнейшее исследование отличающихся вариантов. Усовершенствован метод выделения РНК-содержащих вирусных частиц из плазмы крови. Апробация работы. Результаты работы были доложены на конференции по генетическим вариациям генома ВИЧ-1 и статистическим методам (Rutgers University, New Jersey, USA, May 1995); ll-ом Национальном конгрессе по человеческим ретровирусам (Washington, январь 1995); симпозиуме по молекулярной биологии ВИЧ (Keystone, Symposia, Taos, New Mexico, USA, 1996); на IV-ой международной конференции "СПИД, РАК и родственные проблемы" (С-

Петеобург, май 1996 г.); на межлабораторном семинаре ОМРБ ПИЯФ РАН (апрель

1996 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения,