Содержание к диссертации
Введение
I. Введение 6
II. Обзор литературы 12
II.1. Синдром Ретта 12
II. 1.1. Клиническая характеристика 12
II. 1.2. Диагностические критерии 18
II. 1.3. Классическая форма и атипичные случаи синдрома Ретта 20
II.2 Генетические особенности синдрома Ретта 21
II.2.1. Цитогенетические и молекулярно-цитогеиетические исследования 21
II.2.2. Картирование гена, ответственного за синдром Ретта 24
II.2.3. Ген МЕСР2 (характеристика белка МеСР2 и гена МЕСР2) 27
II.2.4. Мутации в гене МЕСР2 30
II.З. Инактивация хромосомы X 39
II.3.1. Феномен инактивации хромосомы X 39
II.3.2. Причины возникновения инактивации хромосомы X и её значение в патогенезе наследственных болезней 44
II.3.3. Роль инактивации хромосомы X при синдроме Ретта 50
11.4. Корреляции особенностей генотипа и фенотипа при синдроме Ретта 54
II.4.1. Корреляция фенотипа с типом и положением мутаций в гене МЕСР2 54
II.4.2. Корреляция фенотипа с особенностями инактивации хромосомы X 57
11.5. Заключение 59
III. Объект и методы исследования 63
III.1. Объект исследования 63
ІІІ.2. Методы исследования 64
ІІІ.2.1. Выделение ДНК из клеток лимфоцитов периферической крови 64
III.2.1.1. Определение концентрации ДНК 65
III.2.2. Анализ инактивации хромосомы X 65
III.2.3. Определение мутаций гена МЕСР2 методом секвенирования ДНК 67
ІІІ.2.4. Энзиматический тест на определение рекуррентных мутаций гена МЕСР2 68
III.2.5. Цитогенетический анализ 70
III.2.5.1. Культивирование и фиксация лимфоцитов периферической крови, приготовление препаратов метафазных клеток 70
ІІІ.2.5.2. G-окрашивание хромосом 71
III.2.5.3. С-окрашивание хромосом 71
III.2.6. Молекулярно-цитогенетические исследования методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) 72
III.2.7. Оценка клинических признаков при синдроме Ретта 73
III.2.8. Статистическая обработка данных 77
IV Результаты и обсуждение 78
IV. 1. Цитогенстичсские и молекулярно-цитогенетические исследования 78
IV. 1.1. Цитогеиетические исследования детей с синдромом Ретта и их матерей 78
IV. 1.2. Молекулярно-цитогенетические исследования детей с синдромом Ретта и их матерей 79
IV.2. Молекулярно-генстические исследования мутаций гена МЕСР2 у детей с синдромом Ретта 82
IV.2.1. Исследования мутаций гена МЕСР2 у детей с синдромом Ретта методом секвенирования ДНК 82
IV.2.2. Исследование рекуррентных мутаций гена МЕСР2 у детей с RTT при помощи энзиматического теста 97
IV.3. Исследование особенностей инактивации хромосомы X у детей с синдромом Ретта и их матерей 102
IV.4. Исследование зависимости фенотипических характеристик детей с синдромом Ретта от особенности инактивации хромосомы X и мутаций гена МЕСР2 124
IV.4.1. Анализ зависимости фенотипических характеристик от инактивации хромосомы X и мутаций гена МЕСР2 у детей с синдромом Рстта, исследованных на наличие мутаций в гене МЕСР2 132
IV.4.2. Анализ зависимости фенотипических характеристик от инактивации хромосомы X у детей с синдромом Ретта, неисследованных на наличие мутаций в гене МЕСР2 138
IV.4.3. Определение зависимости фенотипических характеристик от эпигенетических и генетических особенностей детей с синдромом Ретта 140
IV.4.4. Необычный случай монозиготных близнецов с синдромом Ретта, конкордатных по МЕСР2 мутации 145
IV.4.5. Необычный случай классической формы синдрома Ретта у мальчика с мозаичной формой синдрома Клайнфельтера 148
IV.5. Схема последовательных этапов диагностики синдрома Рстта, разработанная на базе полученных данных 151
V. Заключение 155
VI. Выводы 158
VII. Список литературы 160
VIII. Приложение 179
- Классическая форма и атипичные случаи синдрома Ретта
- Корреляция фенотипа с типом и положением мутаций в гене МЕСР2
- Молекулярно-цитогенетические исследования методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH)
- Анализ зависимости фенотипических характеристик от инактивации хромосомы X у детей с синдромом Ретта, неисследованных на наличие мутаций в гене МЕСР2
Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время насчитывается более 200 синдромальных и несиндромальных форм умственной отсталости, сцепленных с хромосомой X, основным симптомом которых является аутизм. Изучение генетических и эпигенетических особенностей нервно-психических заболеваний, связанных с различными формами аутизма, является одним из наиболее актуальных направлений в современной психиатрической генетике. Особое место среди этой группы болезней занимают формы умственной отсталости, сцепленной с хромосомой X. По данным ряда авторов суммарная частота данных заболеваний варьирует от 1:1000 до 1,8:1000 (Chiurazzi et al., 2001). Самым частым заболеванием из этой группы после синдрома умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой X, является синдром Ретта (Hagberg et al., 2001).
Синдром Ретта (RTT) (МІМ и ОМІМ, 312750) (McKusick, 1998) представляет собой тяжелое наследственное заболевание, сопровождающееся нарушениями нервно-психического развития. RTT характеризуется нормальным развитием ребенка до 6-18 месяцев с последующей утратой сформированных ранее навыков самообслуживания и целенаправленных движений рук, которые замещаются стереотипными "моющими" движениями, а также полной потерей речи. Это заболевание поражает преимущественно девочек. Случаи RTT у мальчиков встречаются крайне редко. Частота RTT составляет 1 на 10000 - 15000 детей женского пола, а в отдельных регионах — 1 на 3000 (Hagberg, 1985; Kozinetz et al., 1993; Hagberg, Hagberg, 1997), что позволяет говорить о RTT, как об одной из наиболее частых причин всех случаев умственной отсталости у девочек. Таким образом, RTT представляется одним из наиболее социально значимых среди заболеваний, сцепленных с хромосомой X.
В 1999г была определена генетическая причина болезни (Amir et al., 1999). Ген RTT, кодирующий метил-СрС-связывающий белок 2 — МЕСР2, расположен в хромосоме X (в районе q28) и участвует в регуляции транскрипции генома. RTT является болезнью, связанной с мутациями в гене-регуляторе, участвующем в эпигенетическом контроле транскрипции генов, наряду с такими болезнями, как синдромы ATRX, FRAXE и несиндромальная умственная отсталость, вызванная мутациями в гене FOXP2 (Nokelainen, Flint, 2002). Эпигенетические процессы представляют собой наследуемые изменения в экспрессии генов, нарушающие меиделевские принципы наследования, без количественного или качественного изменения последовательности ДНК (Kriaucionis, Bird, 2003). Учитывая небольшое количество болезней, связанных с мутациями в генах регуляторах транскрипции, а также исключительно низкую частоту этих синдромов, можно считать, что RTT является уникальным заболеванием, изучение которого может способствовать фундаментальным открытиям в области эпигенетического контроля экспрессии генов и определению причинно-следственной связи между генетическими аномалиями и эпигенетическими процессами, происходящими в клетках. Мутации гена МЕСР2 встречаются примерно у 70% детей с RTT. Известно, что многие изменения в последовательности гена МЕСР2 не могут быть классифицированы как патогенные мутации. В настоящее время патогенными перестройками в гене МЕСР2, приводящими к RTT, считаются восемь рекуррентных мутаций; нонсенс мутации в начале последовательности и в доменах MBD и TRD, а также крупные делеции в кодирующей последовательности этого гена (Miltenberger-Miltenyi, Laccone, 2003). Таким образом, определение мутаций гена МЕСР2 не является однозначным методом лабораторной диагностики RTT.
Помимо этого, неизвестна генетическая природа RTT у девочек без мутации в гене МЕСР2. Не определены также гены, в регуляции транксрипции которых участвует белок МеСР2. Теоретически, мутации в данных генах могут приводить к RTT, в связи с чем, поиск генов, в регуляции транксрипции которых участвует белок МеСР2, является приоритетным направлением в современной молекулярной генетике. Исследования последних лет направлены на обнаружение биологических маркеров (молекулярных и цитогенетических), которые можно использовать в доклинической и пренатальной диагностике RTT.
Анализируя современные данные о различных аспектах диагностики RTT, можно сделать вывод о том, что задача эффективной лабораторной диагностики RTT окончательно не решена (Miltenberger-Miltenyi, Laccone, 2003; Weaving ct al., 2003).
Несмотря на гипотезу о том, что RTT является Х-сцепленным доминантным заболеванием с внутриутробной летальностью среди мальчиков (Thomas, 1996), имеется ряд сообщений о мальчиках с фснотипическими проявлениями RTT (вплоть до полного соответствия всем обязательным диагностическим критериям болезни) и мутациями гена МЕСР2 (Leonard et al., 2001; Vorsanova et al., 2001). Следует отметить, что мутации гена МЕСР2 у мальчиков приводят не только к классической или атипичным формам RTT, но также к врожденной энцефалопатии и умственной отсталости в сочетании с различными неврологическими отклонениями (Moog et al., 2003). Изучение влияния различных мутаций гена МЕСР2 на фенотипические проявления болезни у мальчиков представляется информативным при изучении зависимости течения болезни от типа и положения мутации, поскольку это позволяет исключить влияние нормального аллеля гена МЕСР2.
Исключая неклассифицированные мутации гена МЕСР2, сравнение клинических характеристик мальчиков с одинаковыми мутациями показывает, что эти аномалии приводят к однотипной клинической картине (Villard et al., 2000; Iloffbuhr et al., 2001; Leonard et al., 2001; Lynch et al., 2003). Тем не менее, попытка выявления корреляций феиотипических проявлений у мальчиков с мутациями гена МЕСР2 одного типа и положения показала отсутствие какой-либо достоверной связи между ними (Ravn et al., 2003).
Эпигенетические факторы, в частности, неравная инактивация хромосомы X и, по-видимому, биаллельная экспрессия гена МЕСР2 могут оказывать модифицирующее влияние на действие белка МсСР2 при RTT (Villard et al., 2001; Shahbazian, Zoghbi, 2002). Известно, что неравная инактивация хромосомы X является характерной особенностью различных форм умственной отсталости, сцепленной с хромосомой X (Plenge et al., 2002). Однако, в настоящее время неизвестно, характерен ли данный эпигенетический феномен для RTT или нет. В немногочисленных работах об особенностях инактивации хромосомы X при RTT получены противоречивые результаты. Исследователи приходят к выводу о том, что для характеристики феномена неравной инактивации при RTT необходимы дальнейшие исследования значительно большей группы детей (Camus et al., 1996; Amir et al., 2000; Auranen et al., 2001).
При попытке выявления корреляций феиотипических особенностей в зависимости от типа и положения мутаций гена МЕСР2, а также особенностей инактивации хромосомы X, определенной зависимости не обнаружено (Amir et al., 2000; Nielsen et al., 2001; Weaving et al., 2003). Многие исследователи отмечают, что отсутствие корреляции, вероятно, связано с несовершенством методов клинической оценки тяжести фенотипа. Кроме того, были попытки установить корреляцию между типом и положением мутаций гена МЕСР2 и течением болезни без учета модифицирующего влияния эпигенетического фактора инактивации хромосомы X. Ряд исследований эпигенетического феномена инактивации хромосомы X при RTT показали возможность влияния неравной Х-инактивации на клинические особенности RTT (Hoffbuhr et al., 2001; Percy, 2001; Shahbazian et al., 2002; Weaving et al., 2003).
Современные данные об эпигенетическом контроле экспрессии генов хромосомы X, достигаемом за счет феномена Х-инактивации, позволили высказать предположение о модифицирующем влиянии некоторых веществ на этот процесс. В связи с этим, не исключается возможность лечения RTT. Помимо симптоматического лечения, коррекция этого заболевания предположительно основывается на том, что мутантный ген МЕСР2 каким-то образом можно инактивировать (Nan, Bird, 2001; Urnov, 2002). Таким образом, поиск возможностей инактивировать хромосому X с мутацией в гене МЕСР2 является перспективным направлением в генной терапии. Поскольку исследований в области экзогенного эпигенетического контроля экспрессии генов хромосомы X проделано не было, данное утверждение стоит рассматривать исключительно как гипотезу. Таким образом, исследование феномена инактивации хромосомы X при RTT представляется крайне актуальным, так как это необходимо для экспериментального подтверждения модифицирующего влияния неравной Х-инактивации на фснотипические проявления RTT.
В России изучение генетических особенностей детей с RTT проводится с 1993г. Результаты обследования российской когорты больных показывают, что среди девочек с умственной отсталостью примерно 2,5% страдают RTT (Улас, 1994; Ворсанова и др., 1999). Некоторые больные с RTT охарактеризованы клинически, цитогенетически и молекулярно-цитогенетически (Ворсанова и др., 1998; Vorsanova et al., 1996; 2001). Однако, изучение спектра мутаций гена МЕСР2, а также анализ особенностей инактивации хромосомы X у детей с RTT в России не проводились. В связи с вышесказанным, были сформулированы цель и задачи данного исследования.
Цель исследования. Основная цель работы заключалась в определении влияния эпигенетических и генетических факторов на фенотипические проявления при RTT на основе анализа особенностей инактивации хромосомы X и мутаций гена МЕСР2.
Задачи исследования.
1. Провести анализ особенностей инактивации хромосомы X у 75 девочек с RTT.
2. Провести анализ особенностей инактивации хромосомы X у 75 матерей девочек с RTT, а также 5 матерей мальчиков с фенотипическими проявлениями RTT.
3. Определить спектр мутаций в гене МЕСР2 у 40 больных с классической и атипичными формами RTT, методом прямого секвенирования кодирующей области и фланкирующих интронов гена МЕСР2.
4. Определить эффективность лабораторной диагностики RTT на основе методов энзиматического теста для выявления рекуррентных мутаций в гене МЕСР2 и прямого секвенирования кодирующей последовательности гена МЕСР2.
5. Определить возможность корреляции между генотипом и фенотипом в группе детей с RTT на основе комплексной клинической балльной оценки и данных об эпигенетических (инактивация хромосомы X) и генетических (мутации в гене МЕСР2) особенностях RTT.
Научная новизна.
Впервые изучен эпигенетический феномен инактивации хромосомы X в репрезентативной группе девочек с RTT, и показано, что неравная инактивация хромосомы X является характерной особенностью RTT.
Впервые изучен эпигенетический феномен инактивации хромосомы X в репрезентативной группе матерей детей с RTT и показано, что среди них могут присутствовать асимптоматические носители мутаций в генах, сцепленных с хромосомой X, включая мутации в гене МЕСР2.
Впервые обнаружены корреляции между генотипом и фенотипом при RTT, обусловленные мнпггиЬяктппной чпвисимпсткю_1ЯЖССТИ je4HHJLl .pne4HH от инактипании
На основе полученных данных об особенностях инактивации хромосомы X и мутациях гена МЕСР2 разработана оригинальная схема комплексной диагностики RTT.
Полученные результаты могут использоваться для эффективного медико-генетического консультирования с определением семейных случаев RTT, а также для разработки эффективных методов пренатальной и постнатальной диагностики RTT.
Положения, выдвигаемые на защиту
1. Исследованы особенности инактивации хромосомы X у 75 девочек с RTT. Впервые показано, что эпигенетический феномен неравной инактивации хромосомы X является характерной особенностью RTT.
2. Особенности инактивации хромосомы X исследованы у 75 матерей девочек с RTT и 5-ти матерей мальчиков с фенотипическими проявлениями RTT. Впервые показано, что неравная инактивация хромосомы X среди матерей детей с RTT наблюдается достоверно выше, чем в контрольной группе. Среди матерей детей с RTT, по-видимому, имеются асимптоматические носители мутаций в генах, сцепленных с хромосомой X, включая мутации в гене МЕСР2.
3. На основе анализа происхождения ииактивированной хромосомы X показано, что у девочек с RTT преимущественно инактивируется отцовская хромосома X.
4. Определен спектр МЕСР2 мутаций в группе, состоящей из 40 детей с RTT. В том числе, у 33 из 39 (84,6%) девочек и одного мальчика определены мутации гена МЕСР2, тогда как у б девочек с RTT обнаружено отсутствие МЕСР2 мутаций. Обнаружено пять новых мутаций гена МЕСР2 у девочек с RTT. У мальчика с классической формой RTT обнаружена мутация гена МЕСР2.
5. Обнаружены корреляции между генотипом и фенотипом при RTT, обусловленные зависимостью тяжести течения болезни от инактивации хромосомы X, положения и типа мутаций гена МЕСР2. Показано, что неравная Х-инактивация является основным фактором, определяющим клиническую гетерогенность RTT, и характерна как для легких, так и для тяжелых форм заболевания в зависимости от направления сдвига X- инактивации. Для дальнейшего корректного анализа влияния различных факторов на фенотип при RTT предложено изучение каждого конкретного случая. Показана необходимость учитывать как генетические, так и эпигенетические характеристики пробандов и их родителей (матерей).
Классическая форма и атипичные случаи синдрома Ретта
В течение длительного времени после открытия RTT и последующего детального клинического описания болезни этиология заболевания не была ясна. Несмотря на то, что 99% случаев заболевания были спорадические, описано несколько семейных случаев, в которых болезнь наследовалась по материнской линии (Xiang et al., 1998; Schanen, 1999), и даже случай, где клиника RTT наблюдалась у матери и ребенка (Engerstrom, Forslund, 1992). В связи с тем, что заболевание поражало преимущественно девочек, а случаи заболевания у мальчиков, в основном, протекали с очень тяжелыми формами энцефалопатии, высказывалось предположение об Х-сцеплеином доминантном типе наследования заболевания (Thomas, 1996). Эту гипотезу также подтверждали наблюдениями трех семей, в которых матери являлись бессимптомными носителями заболевания со сдвигом Х-инактивации, а дети мужского пола страдали тяжелой формой неонатальной энцефалопатии и умерли в раннем детстве (Schanen et al., 1998).
В литературе имеется достаточно доказательств наследственной природы RTT. Описано несколько десятков пар близнецов с RTT, среди которых были и монозиготные, и дизиготные пары (Anvret et al., 1990). Убедительным доказательством генетической природы заболевания является конкордантность по RTT почти всех пар монозиготных близнецов. С другой стороны, не описано ни одного случая, когда оба дизиготных близнеца страдали RTT: в подобных парах всегда поражена одна девочка (Migeon et al., 1995). Помимо этого, описано не менее 15 семей, в которых RTT наблюдался у 2-х и более женщин - тетки и племянницы (3 семьи), родных сестер (не менее 10 семей), полусестер по материнской линии (2 семьи) (Thomas et al., 1995). Особого внимания заслуживает сообщение о бразильской семье, в которой классическая форма заболевания была определена у трех родных сестер (Pereira, Piloto, 1997).
Наследственная природа заболевания подтверждена как в эпидемиологических, так и в генеалогических исследованиях. В некоторых работах отмечено увеличение числа кровнородственных браков в родословных при RTT (до 2,4% при общей частоте в популяции 0,5%) (Akesson et al., 1995). Следует выделить уникальное генеалогическое исследование (Akesson et al., 1996), проведенное в Швеции, в ходе которого было изучено 128 семей с классическими и атипичными формами течения болезни. Родословные включали от 7 до 10 поколений, прослеженных с помощью церковных записей с начала XVIII века. Около половины пробандов имели общее происхождение из одних и тех же небольших сельских районов и фермерских усадеб. Благодаря существованию общего предка девятнадцать независимых родословных были объединены в восемь, в которых имелись как классические, так и атипичные формы RTT, что свидетельствует об их общей генетической природе. Хотя необходимо отметить, что последующие молекулярно-генетические исследования (после 1999г) не обнаружили у этих детей одинаковой мутации. Это может свидетельствовать о том, что RTT в этих родословЕїьіх вызван спорадическими мутациями или семейные случаи RTT вызваны другой генетической аномалией, а не мутациями в гене МЕСР2 (Xiang et al., 2002).
Довольно интересные наблюдения представлены в работе, описывающей девочку с клиническими проявлениями RTT при мутации в гене FMR1, вызывающей синдром умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой X (Alembik ct al., 1995). Этот случай был выявлен, когда беременная женщина 23-х лет проходила генетическое консультирование с целью возможной пренаталыюй диагностики в связи с наличием умственной отсталости неясной этиологии у дяди по отцовской линии. Обследование семьи показало следующее: наличие у отца двух умственно отсталых сестер и брата, а также нормальной сестры; эта сестра имела трех здоровых детей (двух сыновей и дочь) и одну умственно отсталую дочь. У здоровой дочери дочь страдала RTT. Был обследован и дядя по отцу, у которого наблюдались типичные проявления синдрома умственной отсталости, сцепленный с ломкой хромосомой X. В данной семье были проведены цитогенетические и молекулярные исследования. У девочки с RTT обнаружена умственная отсталость, сцепленная с ломкой хромосомой X, по наличию классической мутации гена FMR1, что было подтверждено и цитогенетическими исследованиями, которые выявили 12% клеток с ломкой хромосомой X. Следует отметить, что вероятность наличия у одной и той же девочки RTT и синдрома умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой X, одновременно составляет 1/15 000 1/2 000 = 1/30 000 000. Это ставит вопрос о том, что некоторые девочки с синдромом fra(X) и признаками RTT могут соответствовать определенному субфенотипу синдрома умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой X? Для ответа на этот вопрос, необходимо дальнейшее изучение подобных случаев.
Картирование гена, ответственного за RTT, было связано с рядом сложностей. Как уже было отмечено, RTT носит преимущественно спорадический характер. В литературе имеются данные о транслокациях при RTT (Journel et al., 1990; Zoghbi et al., 1990a), но, поскольку точки разрыва при них локализованы на разных участках хромосомы X, эти данные были признаны иеинформативными для картирования гена. Последующие изучения связи RTT и аномалий хромосомы X показали достаточно противоречивые результаты. Так в некоторых работах утверждается, что аномалии и инактивация хромосомы X не связаны с RTT (Rivkin et al., 1992; Migeon et al., 1995). Тем не менее, RTT был признан Х-сцепленным доминантным заболеванием с высоким уровнем летальности среди мальчиков (Thomas, 1996), что подтвердилось изучением мальчиков, родившихся в семьях с RTT (Schanen, Francke, 1998; Wan et al., 1999; Villard et al., 2000), а также изучением мальчиков с RTT-фенотипом и дополнительной хромосомой X в кариотипе (47,XXY) (Vorsanova et al., 1996).
Стандартный анализ сцепления также не мог предоставить определенных результатов из-за отсутствия достаточного количества семейных случаев. Картирование определенного гена RTT на хромосоме X проводилось методом исключения и в результате несколько участков хромосомы X были неспецифичны для RTT (Archidiacono et al., 1991; Ellison et al., 1992; Curtis et al., 1993;). Впоследствии было определенно сцепление RTT с локусами в участке Xq28 (Siriani et al., 1998; Webb et al., 1998; Xiang et al., 1998). В работе Amir и др. (2000a) описан систематический скрининг на наличие мутаций в генах, ответственных за различные функции центральной нервной системы, находящихся в участке Xq28. Результатом этого исследования стало открытие мутаций в гене МЕСР2 как генетической причины синдрома Ретта (Amir et al., 1999). Таким образом, синдром Ретта является наследственной болезнью, связанной с мутациями в гене-регуляторе, наряду с такими болезнями, как синдромы ATRX, FRAXE и несиндромальная умственная отсталость, связанная с мутациями в гене FOXP2 (Nokelainen, Flint, 2002).
Корреляция фенотипа с типом и положением мутаций в гене МЕСР2
МЕСР2 стало возможным проводить направленное исследование генотип-фенотип корреляций в зависимости как от типа и положения мутаций, так и от особенностей Х-инактивации.
Теоретически, зависимость тяжести болезни от типа (миссенс, нонсенс, деления и.т.д.) и положения (MBD, TRD или в промежуточных областях) мутаций можно представить как функциональное последствие мутаций гена МЕСР2. В связи с чем миссенс мутации, за исключением тех, которые ведут к потери специфичности взаимодействия белка МеСР2 с CpG сайтами (Т158М и R133C) являются, по-видимому, менее тяжелыми по сравнению с нонсенс мутациями и делециями, приводящими к сдвигу рамки считывания. Нонсенс мутации и делеции в начале кодирующей области МЕСР2 также, возможно, являются наиболее тяжелыми, а в конце кодирующей области наиболее легкими. Помимо этого, в настоящее время не оценено функциональное значение миссенс мутаций в TRD (R306C) (Yusufzai, Wolffe, 2000).
При изучении мутаций гена МЕСР2 у девочек с классической формой RTT было показано, что мутации являются одной из характеристик данной формы RTT. В связи с этим, можно сказать, что повышенная частота мутаций у детей с классической по сравнению с атипичными формами RTT косвенно свидетельствует о наличии зависимости фенотипа от типа и положения перестроек в гене МЕСР2 (Bienvenu et al., 2000; Auranen et al., 2001; Weaving et al., 2003). В работе Amir и др. (20006) были изучены корреляции генотип-фенотип у 48 детей с классической формой RTT при анализе зависимости типа мутаций и различных клинических характеристик. Зависимость была обнаружена только между нонсенс мутациями и двумя клиническими характеристиками (аномалии дыхания и пониженное содержание гомоваиилиновой кислоты в спинно-мозговой жидкости). Обнаружено также, что сколиоз чаще всего встречается у больных с миссенс мутациями. Тем не менее, общий показатель тяжести проявления болезни не был связан с типом и положением мутаций гена МЕСР2. Изучение мутаций у 18 детей с такой атипичной формой RTT, как вариант с сохранной речью, показал, что у данных индивидуумов преобладают миссенс и нонсенс мутации в конце кодирующей области МЕСР2. Эти результаты подтверждают предположение о том, что данные мутации приводят к более легкому течению болезни (Zapella et al., 2001). Имеются также данные о том, что мутация R133C в большинстве случаев приводит к варианту с сохранной речью, хотя у всех исследованных наблюдалась неравная Х-инактивация (Nielsen et al., 20016).
Отмечается ещё одна важная характеристика, способная влиять на фенотип, — соматический мозаицизм мутаций гена МЕСР2 у детей с RTT. В связи с чем, исследователями предлагается оценивать процент клеток с мутированным геном МЕСР2, и лишь затем изучать зависимость манифестации заболевания от особенностей перестроек в гене МЕСР2. В данной работе были описаны два случая соматического мозаицизма мутаций у детей с RTT, и проведено сравнение с клинической картиной у детей без соматического мозаицизма с такой же мутацией. В результате было обнаружено, что у детей с мозаицизмом по мутациям гена МЕСР2 течение болезни представляется более легким (Bourdon et al., 20016). Тем не менее, данный феномен вряд ли необходимо учитывать, поскольку соматический мозаицизм мутаций в данной работе был обнаружен менее, чем у 2% детей с RTT (два случая из 102). Таким образом, соматический мозаицизм мутаций гена МЕСР2 не может значительно влиять на результаты исследования корреляций между фенотипом, положением и типом МЕСР2 мутаций при RTT.
Анализ зависимости фенотипа от особенностей мутаций гена МЕСР2 не позволил определить каких-либо четких корреляций, что связано с модифицирующим влиянием на фенотип такого феномена, как Х-инактивация (Amir et al., 20006; Weaving et al., 2003).
В связи с тем, что изучение корреляций генотип-фенотип у девочек с RTT представляется крайне сложным из-за влияния на манифестацию и течение болезни процесса инактивации хромосомы X, ряд исследователей попытались изучить зависимость клинических проявлений и особенностей мутаций гена МЕСР2 у мальчиков.
В ходе изучения корреляций генотип-фенотип у мальчиков разными группами ученых были получены противоречивые результаты. Так, в работе Zeev и др. (2002) авторы сумели установить определенные корреляции генотип-фенотип в рамках одной семьи. Но анализ литературных данных в другой работе показал, что у мальчиков с нонсенс мутациями и делениями определить корреляции генотип-фенотип не удается (Ravn et al., 2003). Таким образом, несмотря на то, что изучение корреляций генотип-фенотип у мальчиков позволяет исключить влияние такого фактора, как Х-инактивация, подобные исследования имеют свои сложности. Основной сложностью изучения влияния мутаций в гене МЕСР2 на фенотип у мальчиков является исключительная гетерогенность клинических проявлений. Ярким .примером может служить мутация A140V, которая встречается у мальчиков с нервно-психическими заболеваниями разной тяжести (Moog et al., 2003). В значительной степени на течение болезни влияет также наличие соматического мозаицизма по мутациям гена МЕСР2 (Clayton-Smith et al., 2000) или наличие мозаичной формы синдрома Клайнфельтера (Vorsanova et al., 1996; 20016). Таким образом, наибольший интерес в свете проблемы зависимости генотипа от МЕСР2 мутаций представляет сравнительный анализ рекуррентных мутаций (кроме A140V) и тяжести проявления болезни у мальчиков. В литературе описаны четыре случая Т158М мутаций у мальчиков. При наличии полной и мозаичной формы синдрома Клайнфельтера данная мутация приводила к фенотипу RTT, полностью удовлетворявшему всем обязательным диагностическим критериям (Hoffbuhr et al., 2001; Leonard et al., 2001), в то время как, при отсутствии клона 47.XXY мутация Т158М приводила к тяжелой форме врожденной энцефалопатии, несовместимой с жизнью (Villard et al., 2000; Lynch et al., 2003). Ha примере мутации T158M можно видеть, что несмотря на все сложности изучения влияния мутаций в гене МЕСР2 на фенотип у мальчиков, определение корреляций генотип-фенотип в данной группе больных вполне возможно.
Молекулярно-цитогенетические исследования методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH)
Реактивы: формамид (Реахим), этанол (реахим), декстрансульфат-500 (Sigma), авидин (Sigma), биотип (Sigma), антитела к авидину (Sigma), флюоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ) (Sigma), двузамещенный (К2НРО4) и однозамещенный фосфат калия (КН2РО4) (Реахим), Тритон-ХЮО (Merck), Tris/HCl (Serva), глицерин (Реахим), 1,4-диазабицикло[2,2,2]октан (Serva), 4,6-диамидино-2-финилиндол (DAPI) (Sigma), пропидиум йодид (Sigma).
Использовали ДНК пробы из оригинальной коллекции лаборатории цитогенетики Научного центра психического здоровья РАМН (Соловьев и др., 1998; Soloviev et al., 1997; Yurov et al., 2002).
Флюоресцентную гибридизацию in situ на интерфазных и метафазных хромосомных препаратах проводили по методу, разработанному в лаборатории цитогенетики НЦПЗ РАМН (Соловьев и др., 1998; Soloviev et al., 1994; Yurov et al., 1996). Для гибридизации использовали препараты культивируемых лимфоцитов периферической крови, приготовленные по методу, описанному выше в Ш.2.5.1.
Денатурацию хромосомной ДНК проводили погружением в 70% формамид и 2х солевой раствор цитрата натрия при температуре 70С в течение 30 секунд с последующем промыванием в двух сменах 70% и 96% этанола по 10 минут в каждой. Денатурацию ДНК проб, меченных биотипом, осуществляли прогреванием в течении 5 минут при температуре 100С на водяной бане в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамид, 2х НЦСР, 10% декстрансульфат-500. Гибридизационную смесь по 10-15 мкл наносили на препараты хромосом, накрывали покровными стеклами (размер 22x22 мм) и инкубировали во влажной камере при температуре 37-42С в течение 17-18 часов.
После удаления покровных стекол препараты отмывали при температуре 42С в двух сменах 50% формамида и 2х НЦСР в течение 10 минут, затем в двух сменах 2х НЦСР при комнатной температуре в течение 10 минут. На препараты наносили по 0,0125 коныогата авидина и ФИТЦ в концентрации 5 мкг/мл, накрывали покровными стеклами (размер 22x22 мм) и выдерживали во влажной камере 30 минут при температуре 37С. Затем удаляли покровные стекла и промывали препараты в трех сменах 0,1 М раствора фосфатного буфера (94 мл ЇМ К2НРО4, 6 мл ЇМ КН2РО4 и 0,1% раствор Тритона-ХЮО).
Для амплификации сигнала на препараты наносили 12,5 мкл раствора антител к авидину, коныогированных биотином (5 мкг/мл), препараты накрывали покровными стеклами (размер 22x22 мм) и выдерживали во влажной камере 30 минут при температуре 37С. Затем покровные стекла удаляли и препараты промывали в 3-х сменах 0,1 М раствора фосфатного буфера. После этого на препараты наносили по 12,5 мкл коныогата авидина и ФИТЦ в концентрации 5 мкг/мл, накрывали покровными стеклами (размер 22x22 мм) и выдерживали во влажной камере 30 минут при температуре 37С. Затем удаляли покровные стекла и промывали препараты в трех сменах 0,1М раствора фосфатного буфера.
Окраску препаратов производили нанесением 20 мкл смеси, состоящей из 0,05 мл 2% раствора 1,4-диазабицикло[2,2,2] октана (противовыцветающего реагента), 0,05 мл 90% глицерина в 0,2М Tris/HCl, 0,004мл DAPI и 0,0048мл пропидиума йодида. Микроскопический анализ проводили с использованием флюоресцентного микроскопа (Leitz Ortoplan), оборудованного 13-фильтром для ФИТЦ и А-фильтром для DAPI. Для анализа изображения использовалась система, включающая в себя микроскоп Leitz Ortoplan, черно-белую CCD-камеру Cohu 4910 (Cohu Inc.), компьютер, карту для захвата изображения Scion LG-3 (Scion Corporation, National Institute of Health, USA). Программное обеспечение включало в себя программу Scion Image Beta 4.0.2 (Scion Corporation, National Institute of Health, USA) для захвата изображения и оригинальную программу Fishmet для обработки изображений, разработанную в лаборатории цитогенетики НЦПЗ РАМН (Юров и др., 2000).
Количественная оценка клинических проявлений при RTT была разработана и проводилась в отделе врожденных и наследственных заболеваний у детей с нарушением психики Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ. Эта система представляет балльную оценку степени выраженности 23-х клинических признаков, общая сумма баллов составляет 80 (Улас, 1994; Харабадзе и др., 2003). Характеристика количественной оценки клинических проявлений при RTT приведена в таблице 9:
В настоящей работе применяли стандартные методы статистической обработки для медико-биологических исследований (Гланц, 1999). Для анализа достоверности отличия количества индивидуумов с неравной инактивацией хромосомы X исследованных (девочки RTT и их матерей) и контрольной групп использовался общепринятый метод дисперсионного анализа с использованием критерия Стьюдента (t-критерий) для сравнения двух групп. Определение зависимости между сдвигом инактивации хромосомы X у детей с RTT и их матерей было осуществлено с помощью стандартного корреляционного анализа с использованием коэффициента Пирсона. Изучение корреляций генотип-фенотип в зависимости от положения мутаций гена МЕСР2 проводили с помощью корреляционного анализа с использованием коэффициента Спирмена (R — коэффициент корреляции, R2 — коэффициент детерминации).
Анализ зависимости фенотипических характеристик от инактивации хромосомы X у детей с синдромом Ретта, неисследованных на наличие мутаций в гене МЕСР2
В семьях 1,4, 15,58,61, 66, 69 (табл. 20) обнаружена равная Х-инактивация у детей с классической формой RTT и легкой степенью тяжести течения болезни (средняя суммарная количественная оценка клинической тяжести — 30). Легкая форма болезни в этой группе больных может объясняться тем, что мутации гена МЕСР2, которыми, вероятно, обусловлены эти случаи, не сильно поражают основные функции белка МеСР2 (связывание с CpG сайтами и подавление транскрипции). Этот факт свидетельствует о том, что можно судить о патогенносте и влиянии на фенотип МЕСР2 мутаций, основываясь исключительно на данных об особенностях Х-инактивации.
Анализируя случаи RTT со средней количественной оценкой клинической тяжести ниже 20 (семьи 44, 51, 52 и 68), следует отметить, что сдвиг Х-инактивации обнаружен только в одном случае у девочки со стертой формой RTT (73:27). В данном случае инактивировалась преимущественно отцовская хромосома X, следовательно, X-инактивация имеет положительное влияние на клиническую картину. Тем не менее, другие случаи из этой группы характеризуются отсутствием неравной инактивации хромосомы X. Это показывает, что в некоторых случаях мутации гена МЕСР2 определяют характер течения болезни. Таким образом, можно сделать вывод о том, что тип и положение МЕСР2 мутаций имеют определенное влияние на фенотип.
Особого внимания заслуживают три случая с практически полным сдвигом X-инактивации (семья 16, 42 и 57). В семье 16 наблюдается полная инактивация отцовской хромосомы X. Клиническая характеристика не дает однозначного ответа на вопрос о генетических особенностях данного случая. Мать пробанда не имеет сдвига X-инактивации, и это свидетельствует о том, что она не является носительницей. Тем не менее, можно предположить, что в данном случае наблюдается инактивация против мутантной хромосомы X, которая может отличаться в разных тканях организма (Gale et al., 1994), вследствие чего, девочка имеет классическую форму RTT. По поводу двух других случаев со значительным сдвигом Х-инактивации (97:3 в обоях случаях), исходя из клинической картины и сравнения со случаями, для которых определялись мутации гена МЕСР2, а также учитывая наличие сдвига против материнской хромосомы X в семье 57, можно предположить, что пробанды, скорее всего, не имеют МЕСР2 мутаций. Помимо этого, в одном из случаев исключено наличие рекуррентных мутаций, что также подтверждает выдвинутое предположение. Этот факт свидетельствует о том, что анализ инактивации хромосомы X является в значительной степени более информативным для клинической и генетической характеристик заболевания, чем исследование мутаций гена МЕСР2удетейсРЛТ.
Случай семьи 46 представляет собой вариант RTT с сохранной речью и характеризуется значительным сдвигом Х-инактивации (88:12) против отцовской хромосомы X. При анализе всех трех случаев с вариантом с сохранной речью, исследованных в настоящей работе, обнаружено, что во всех случаях наблюдается значительный сдвиг Х-инактивации (степени сдвига — 88%, 90% и 94%) против мутантной хромосомы X. Таким образом, можно сделать вывод о том, что для данного легкого варианта течения болезни характерна неравная Х-инактивация, приводящая к варианту с сохранной речью. Полученные данные о том, что неравная Х-инактивация является одной из основных причин варианта RTT с сохранной речью, представляют собой доказательство ранее выдвинутой гипотезы об исключительном влиянии X-инактивации на патогенез RTT при данном варианте болезни (De Bona et., 2000; Zappella etal.,2001).
В семьях 17, 29, 39, 49, 50, 59, 60, 65 и 70 у девочек наблюдается классическая и стертая формы RTT с легким и средним течением болезни (средняя суммарная количественная оценка клинической тяжести — 30), а также средним и значительным сдвигом Х-инактивации. Семьи 50 и 60 являются ярким примером положительного влияния значительного сдвига Х-инактивации против отцовской хромосомы X (94:6 и 83:17, соответственно). Эти два случая представляют собой самые легкие формы течения заболевания из данной группы. Остальные случаи представляют собой незначительное отклонение сдвига Х-инактивации от 50:50. Степень сдвига в этих случаях варьирует от 60 до 75%. Легкое течение болезни в этих случаях объясняется сдвигом Х-инактивации против мутантной хромосомы X. Таким образом, данная группа случаев показывает, что даже 10%-ное отклонение от равной Х-инактивации может в значительной степени влиять на фенотип.
Случаи семей 2, 3 и 43 представляют собой тяжелые варианты течения RTT (суммарная количественная оценка клинической тяжести — 59,49,5 и 46, соответственно) при классической форме, что обусловлено равной Х-инактивацией. Следовательно, можно сделать заключение о том, что равная инактивация хромосомы X характерна преимущественно для тяжелого течения RTT.
Особого внимания заслуживает случай семьи 67. В данном случае наблюдается практически полная инактивация материнской хромосомы X в сочетании с тяжелой врожденной формой RTT (суммарная количественная оценка клинической тяжести — 50,5). Исключительность этого случая заключается в том, что, скорее всего, обнаружена практически полная инактивация нсмутантной хромосомы X. Это, в свою очередь, привело к тяжелому течению болезни. Ранее, был описан случай с практически полной инактивацией немутантной хромосомы X (степень сдвига 99%), тем не менее, у девочки, описанной Amir и др. (20006), течение болезни было более легким, чем в настоящей работе. Данный случай подчеркивает серьезные последствия, к которым может привести сдвиг Х-инактивации против немутантной хромосомы X.