Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. История изучения фенилкетонурии 12
1.2. Частота ФКУ и ГФА 15
1.3. Классификация ФКУ и ГФА 16
1.4. Метаболизм фенилаланина. Патогенез ФКУ 19
1.5. Клиническая характеристика ФКУ 23
1.6. Диагностика ФКУ
1.6.1. Биохимическая диагностика ФКУ 26
1.6.2. ДНК-диагностика. Мутации в гене РАН
1.7. Корреляция между генотипом и фенотипом у больных ФКУ 28
1.8. Лечение ФКУ 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Историко-географическое описание Ростовской области 33
2.2. Демографические показатели и национальный состав населения РО 35
2.3. Материал и объект исследования 38
2.4. Методы исследования 40
2.5. Генетико-статистические методы исследования 42
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Частота ФКУ в Ростовской области 45
3.2. Спектр мутаций в гене РАН у пациентов с ФКУ в Ростовской области 50
3.3. Спектр мутаций в гене РАН с учетом национальности пациентов 59
3.4. Оценка гетерозиготного носительства мутаций в гене РАН в РО 62
3.5. Изучение взаимосвязи генотипов в гене РАН и фенотипов у больных ФКУ в РО
3.5.1. Спектр генотипов в гене РАН, выявленных у пациентов с ФКУ РО 63
3.5.2. Изучение генотип-фенотип корреляций у пациентов с ФКУ в РО 68
3.6. Клинические формы ФКУ у пациентов РО 79
3.6.1. Классическая и мягкая формы ФКУ у пациентов РО 81
3.6.2. Гиперфенилаланинемия у пациентов РО 84
3.7. Гиперфенилаланинемия BH4 A в РО 86
Заключение 89
Выводы 96
Практические рекомендации 97
Список публикаций по теме диссертации 98
Список использованных сокращений 101
Список литературы 102
- Клиническая характеристика ФКУ
- Демографические показатели и национальный состав населения РО
- Спектр мутаций в гене РАН с учетом национальности пациентов
- Изучение генотип-фенотип корреляций у пациентов с ФКУ в РО
Введение к работе
Актуальность исследования
Фенилкетонурия (ФКУ) – одно из наиболее изученных наследственных заболеваний обмена веществ. На модели ФКУ показано, как нарушение одного из звеньев метаболизма только одной аминокислоты приводит к формированию характерного симптомокомплекса, с поражением центральной нервной системы, и как лечение, заключающееся в ограничении поступления в организм данной аминокислоты, позволяет предотвратить клинические проявления заболевания. Разработка и массовое внедрение в практическое здравоохранение большинства стран мира скрининга новорожденных на ФКУ и назначение диетического лечения позволили значительно сократить количество детей с умственной отсталостью (Scriver C.R., 2007; Williams R.A. et al., 2008; Harms E., Olgemller B., 2011; Berry S.A. et al., 2013; Blau N., 2016).
Частота ФКУ варьирует у населения разных регионов и стран мира, в среднем составляя 1:10000 (Mitchell J.J., 2013). Наибольшие показатели частоты ФКУ зарегистрированы в Турции (1:2600) и Иране (1:3627) (Ozalp Y. et al., 1986; Zare-Karizi Sh. et al., 2011), наименьшие в Финляндии (1:100000) (Scriver C.R. et al., 2001) и Японии (1:120000) (Okano Y. et al., 2011). В Российской Федерации частота ФКУ колеблется от 1:3000 в Карачаево-Черкессии до 1:18000 в Республике Тыва, в среднем по стране составляя 1:7142 (Ондар Э.А. и др., 2005; Новиков П.В., Ходунова А.А., 2012; Гундорова П. и др., 2015).
В 97-98% случаев развитие ФКУ связано с мутациями в гене РАН (612349), кодирующем фермент фениаланингидроксилазу (ФАГ), идентифицированные в 80-х годах прошлого столетия (Kwok S.C.M. et al., 1985; DiLella A.G. et al., 1986). Ген PAH, локализованный на хромосоме 12 (12q23.2), содержит 13 кодирующих экзонов (). В настоящее время в гене РАН описано 955 различных мутаций (по состоянию на май 2016 года), которые неравномерно распределены по всему гену формируя «горячие участки» в каталитическом домене (Mitchell J.J., 2013; Donlon J. et al., 2014).
С внедрением молекулярно-генетических методов определены спектр и частоты мутаций в гене РАН в различных популяциях мира. Данные исследования показали наличие региональных и этнических особенностей. В средиземноморских популяциях частой мутацией является IVS10-11G>А, в Дании и Англии - IVS12+1G>А, в Скандинавии - Y414C. Вариант I65T является частым в Западной Европе, а R408W гаплотип 1 - часто выявляется на Британских островах, в то время как гаплотип 2 характерен для Восточной Европы и Балтийских стран (Tansek M.Z. et al., 2015). В России наиболее частыми являются мутации: R408W (61,4%), P281L (4,95%), IVS10-11G>A (4,1%), R261Q (3,3%), IVS12+1G>A (2,3%), R252W (1,82%), R158Q (1,65%) (Степанова А.А., 2005). Показано, что спектр мутаций, характерный для отдельных регионов, является результатом сочетания основных факторов популяционной динамики, включающих миграционные процессы, эффект основателя, генетический дрейф, и, вероятно, преимущество гетерозигот (Tansek M.Z. et al., 2015).
Мутации в гене РАН приводят к различным по степени тяжести клиническим и биохимическим фенотипам, формируя диапазон клинических форм от тяжелой ФКУ до
умеренной ГФА. Выделяют мутации, которые приводят к более тяжелой форме ФКУ в связи с их более значимым влиянием на структуру и функцию фермента. Результаты исследований демонстрируют корреляцию между характером мутаций и тяжестью заболевания у значительного числа больных. В большинстве случаев возможно прогнозирование фенотипа исходя из знаний о генотипе (Kayaalp E. et al., 1997; Guldberg P. et al., 1998; Daniele A. et al., 2007; Blau N. et al., 2010; Blau N., 2016). Тем не менее, корреляция между генотипом и фенотипом у больных ФКУ не является абсолютной, и пациенты с аналогичными генотипами в некоторых случаях могут иметь различные формы ФКУ (Scriver C. R., 2007).
Успехи в области молекулярной генетики и проведение неонатального скрининга
позволили выявить и описать атипичные формы ФКУ. Рядом исследователей было
показано, что в основе патогенеза вариантных форм лежит дефицит
тетрагидробиоптерина, который является кофактором фермента
фенилаланингидроксилазы. За время проведения скрининга на ФКУ описаны единичные
случаи гиперфенилаланинемии, обусловленные нарушением обмена
тетрагидробиоптерина, составляющие не более 1 - 3% от всех пациентов с повышенным уровнем ФА (Scriver, C.R., 2007; Blau N. et al., 2011; Werner E. et al., 2011).
До настоящего времени остаются актуальными изучение частоты и молекулярно-генетическое обследование больных ФКУ в конкретных регионах с целью выявления различных форм, прогнозирование тяжести заболевания по генотипу для обеспечения персонализированного подхода в лечении больного ФКУ, установления территориальной и этнической специфичности распространения мутаций в гене РАН, в том числе в Ростовской области.
Цель исследования: Изучить фено-генетические особенности и эпидемиологию фенилкетонурии в Ростовской области.
Задачи исследования:
-
Оценить частоту ФКУ в Ростовской области по данным неонатального скрининга.
-
На основании молекулярно-генетического исследования определить частоту и спектр мутаций в гене РАН у пациентов с ФКУ, а также при необходимости в генах тетрагидробиоптеринового обмена. Изучить спектр и частоты мутаций в гене РАН у пациентов с ФКУ различных этнических групп в РО.
-
Оценить частоту гетерозиготного носительства мутаций в гене РАН для населения РО среди здорового населения области по данным неонатального скрининга и скрининга мутации R408W среди здорового населения области.
-
Изучить частоту и спектр генотипов и фенотипов у больных ФКУ. Изучить особенности клинических форм ФКУ (кФКУ, мФКУ, ГФА) у пациентов РО. Исследовать взаимосвязь генотипов в гене РАН и фенотипов у пациентов ФКУ.
Научная новизна исследования.
Впервые проведено комплексное генетико-эпидемиологическое обследование пациентов с ФКУ в Ростовской области. На основании скрининга новорожденных (1997-2014 гг.) определена частота ФКУ, которая составила 1:6077 новорожденных. Анализ
вариации значений частоты ФКУ в разные годы за период проведения скрининга не выявил статистически значимых отличий.
Впервые исследованы спектр и частоты мутаций в гене РАН с использованием методов ДНК анализа (ПЦР, секвенирование по Сенгеру и MLPA анализ) в группе пациентов с классической ФКУ, мягкой ФКУ и гиперфенилаланиемией (ГФА), позволившее выявить 40 различных мутаций. Наиболее частыми определены мутации R408W (62,31%), IVS12+1G>A (3,85%), IVS10-11G>A(3,85%), R261Q (3,85%), P281L (2,69%), R158Q (2,69%), R252W (1,92%), EX5DEL (1,92%) R261X (1,20%). Обнаружены две ранее не описанные мутации - Y268C (0,38%), c.1298dupT (0,38%). Информативность составила 100%.
Впервые проведенный анализ спектра и частот мутаций в гене РАН с учетом национальной принадлежности больных ФКУ РО показал наличие этнических особенностей. Для русского населения РО самыми частыми являются мутации: R408W (аллельная частота составила 69,47%), IVS12+1G>A (3,46%), R261Q (2,69%) и R158Q (2,31%). Мутация R408W в гомозиготном состоянии выявлена у 54,95% русских больных. Среди больных ФКУ армянской национальности частыми оказались мутации IVS10-11G>A (40,0% среди армян) и R252W (20,0% у армян). У больных ФКУ турок-месхетинцев мутация R408W и IVS10-11G>A встречаются на 40,0% хромосом каждая.
Впервые, оценена частота гетерозиготного носительства мутаций в гене РАН, на основании закона Харди-Вайнберга по данным неонатального скрининга, которая составила 2,60% (1:39 человек), и частота мутации R408W при ДНК-тестировании здоровых индивидов (анализ 940 хромосом), проживающих в различных районах области, которая составила 2,13% (1:47).
Впервые проведен анализ гено-фенотипических корреляций, изучена взаимосвязь между генотипом (49 различных генотипов) и показателем (ФА) до начала лечения и на фоне проводимой диетотерапии. Установлены статистически значимые коэффициенты корреляции, свидетельствующие о наличии генотип-фенотип корреляции у большинства пациентов с диагнозом ФКУ (классической, мягкой и гиперфенилаланинемией), обратной зависимости между активностью фермента и показателями уровня ФА и прямой зависимости между уровнями ФА до лечения и на диетотерапии у больных.
Практическая значимость исследования
Проведено медико-генетическое консультирование семей с различными формами ФКУ (классической, мягкой и гиперфенилаланинемией). На основании подтверждающей ДНК-диагностики и идентифицированных мутаций в 7 семьях с ФКУ проведена пренатальная диагностика.
Создана база данных больных ФКУ, включающая генеалогические данные, описание клинических симптомов, данные биохимических, инструментальных и молекулярно-генетических исследований, которая послужит основой для регионального регистра, позволяющего осуществлять активный мониторинг отягощенных семей.
Полученные данные о высоких значениях гено-фенотипической корреляции обеспечивают как прямые, так и косвенные свидетельства о наличии взаимосвязи между генотипом и фенотипом у большинства пациентов с диагнозом ФКУ и требуют
персонализированного подхода при терапии больных с различными формами ФКУ (классической, мягкой).
Впервые в РО у пациента с повышением уровня ФА в крови выявлены мутации N52S и P87S в гене PTS, что позволило поставить диагноз ГФА BH4A и назначить патогенетическую терапию препаратом саптоптерин дигидрохлорид (КУВАН).
Положения, выносимые на защиту:
-
По данным неонатального скрининга (1997-2014 гг) частота ФКУ в РО составляет 0,16±0,01 (1:6077). Статистически значимых различий в значениях частоты ФКУ в разные годы проведения скрининга не выявлено.
-
Диагностическая эффективность ДНК-диагностики у больных с ФКУ РО при применении методов ПЦР, секвенирование по Сенгеру и MLPA-системы составила 100%. Выявлено 40 различных мутаций в гене РАН, в том числе 8 частых для РО: R408W (62,31%), IVS10-11G>A (3,85%), IVS12+1G>A (3,85%), R261Q (3,85%), P281L (2,69%), R158Q (2,69%), EX5del (1,92%) и R252W (1,92%).
-
Установлены этнические различия, как в спектре мутаций в гене РАН, так и в аллельных частотах. У русских больных ФКУ определены 4 мажорные мутации для РО (R408W – 69,47%, IVS12+1G>A – 3,46%, R261Q – 2,69% и R158Q – 2,31%), у армян – IVS10-11G>A (40%) и R252W (20%), у турок-месхетинцев - R408W (40%), IVS10-11G>A (40%), у даргинцев - R261X (75%).
-
Частота гетерозиготного носительства мутаций в гене РАН, рассчитанная исходя из частоты ФКУ среди новорожденных по данным неонатального скрининга, составила 2,60% (1:39 человек). Частота гетерозиготного носительства мутации R408W, оцененная путём ДНК-скрининга здоровых индивидов составила 2,13% (1:47 человек).
-
Определена обратная регрессионная зависимость между активностью фермента ФАГ и средними значениями уровня ФА в группах ФА «скрининг» (r=-0,88±0,28), ФА «ретест» (r=-0,96±0,17) и ФА «диета» (r=-0,89±0,32).
-
Доля больных с тяжелыми формами классической ФКУ в РО составляет 77,69%, мягкой ФКУ - 16,92%, ГФА - 5,39%. Эффективность заместительной диетотерапии – 97%.
Степень достоверности результатов
Основные положения диссертационной работы базируются на материалах первичной документации и полностью им соответствуют. Результаты, полученные автором вследствие генетико-эпидемиологического анализа и клинико-молекулярно-генетических данных, свидетельствуют о решении поставленных задач. Высокая степень достоверности и обоснованности выводов, основных научных положений диссертации определяются достаточно большим объемом материала: вся Ростовская область (265 пациентов). Для сравнительного анализа привлечено достаточное количество данных отечественной и зарубежной литературы (более 200 источников). Выводы объективно и полноценно отражают результаты проведенных исследований.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
В соответствии с формулой специальности «03.02.07 - Генетика (медицинские науки)», охватывающей проблемы изменчивости и наследственности, закономерности процессов хранения, передачи и реализации генетической информации на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровнях в области «Генетика человека. Медицинская генетика. Наследственные болезни».
Апробация результатов исследования
Материалы диссертации доложены: на VI съезде Российского общества медицинских генетиков. Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010; European Human Genetics Conference 2013, June 8-11, 2013, Paris, France; European Human Genetics Conference 2014, May 31-June 3, 2014, Milan, Italy; V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013; European Human Genetics Conference 2015, June 3-9, 2015, Glasgow, Scotland; на Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых. Москва, 19 марта 2015; XI Международная (XX Всероссийская) на XI Международной (XX Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых. Москва, 17 марта 2016; на VII съезде Российского общества медицинских генетиков, Санкт-Петербург, 19-23мая 2015; в стендовом докладе, на «European Conference of Human Genetics», May 21-24, 2016, Barselona, Spain.
Работа прошла экспертную комиссию и рекомендована к защите на заседании Ученого совета ФБГНУ «МГНЦ».
Личный вклад автора в выполнение исследования
Автор непосредственно участвовала в разработке самой идеи, организации и проведении всех этапов исследования, при формулировании цели и задач, выборе методов исследования, обработке медицинского и статистического материала, анализе и интерпретации полученных данных, а также в подготовке публикаций по диссертационной теме. Автор принимала участие в планировании и проведении экспедиционных работ с целью выявления семей с ФКУ. Автором лично проведен осмотр больных ФКУ и членов их семей в Ростовской области, осуществлен забор биологического материала, заполнение медицинских карт. Автор лично формировал регистр больных с ФКУ и осуществлял мониторинг семей с назначением заместительной диетотерпии с учетом персонализированного подхода. Автором досконально изучена и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, проведен математический анализ данных, сформулированы результаты и выводы. Результаты исследования опубликованы в рецензируемых журналах и доложены на научных конференциях.
Публикации
По результатам диссертации опубликовано 15 печатных работ соискателя, в том числе 5 статей – в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук.
Структура и объём диссертации
Диссертация имеет следующую структуру: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждения, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы и приложения. Работа представлена на 130 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 20 рисунков. Библиографический указатель включает 212 наименований, из них 43 отечественных и 169 иностранных источников.
Клиническая характеристика ФКУ
Частота встречаемости ФКУ варьирует в широких пределах у населения разных регионов и стран. Показана значительная межэтническая вариабельность данного показателя. Например, популяции Юго-Восточной Европы (11 стран с совокупным населением 52,5 млн.) являются этнически и генетически неоднородными, что нашло свое отражение в различиях частот ФКУ даже в пределах одной страны. В Хорватии, частота ФКУ в регионе Хорватского Загорья составляет 1:3500, в то время как в регионе Далмация - 1:15500 [Stojiljkovic M. et al., 2006; Loeber J.G., 2007; Tansek M.Z. et al., 2015]. Распространенность ФКУ для белого населения, проживающего в Англии, составляет - 1,14 на 10000 населения, в то время как, для черных и азиатских британцев 0,11 и 0,29, соответственно [Hardelid P. et al., 2008]. Крайне редко ФКУ встречается у финнов, японцев. В изученных популяциях России среди чувашей Чувашской Республики и марийцев Республики Марий Эл фенилкетонурия встречается существенно реже, чем среди русского населения [Зинченко Р.А. и др., 2007; 2014; Гундорова П. и др., 2015].
Внедрение в практическое здравоохранение большинства стран государственной программы скрининга новорожденных позволило оценить частоту ФКУ в различных популяциях, которая в среднем составляет 1:10000 (Прил. 1, табл. 1) [Williams R.A. et al., 2008; Mitchell J.J., 2013]. Выявлены существенные колебания показателей частоты ФКУ в различных регионах: от 1:2600 в Турции и 1:3627 Иране [Zare-Karizi Sh. et al., 2011] до 1:120000 в Японии [Okano Y. et al., 2011].
В Российской Федерации диагностика ФКУ в рамках скринирующей программы проводится с 1992 г. По результатам неонатального скрининга частота заболевания варьирует от 1:3000 в Карачаево-Черкессии до 1:18000 в Республике Тыва, в среднем по стране составляя 1:7000 [Ондар Э.А. и др., 2005; Новиков П.В., Ходунова А.А., 2012; Гундорова П. и др., 2015].
В приложении 1 таблице 1 собраны и систематизированы данные о частоте ФКУ в различных популяциях России и мира. 1.3. Классификация ФКУ и ГФА
В настоящее время в онлайн базе генов человека и генетических болезней (Online Mendelian Inheritance in Man - OMIM) представлены следующие нозологические формы, обусловленные нарушением обмена ФА, в соответствии с молекулярно-генетическим уровнем поражения [http://omim.org/].
1. Фенилкетонурия (ФКУ) (#261600). Альтернативные названия и символы: дефицит фенилаланингидроксилазы (ФАГ дефицит), oligophrenia phenylpyruvica, болезнь Фёллинга. Под этим же номером в базе OMIM обозначены еще 2 формы, обусловленные дефицитом фермента ФАГ: гиперфенилаланиемия (ГФА) мягкая не-ФКУ (ГФА мягкая не-ФКУ) и материнская фенилкетонурия [Scriver C.R., 2007; Blau N. et al., 2010; http://omim.org/entry/261600]. К развитию данных форм приводят мутации в гене фенилаланингидроксилазы (PAH; 612349), локализованном на хромосоме 12 (12q23.2) и содержащем 13 кодирующих экзонов [Mitchell J.J., 2013; Donlon J. et al., 2014; http://omim.org/entry/612349]. Продуктом гена РАН является фермент фенилаланингидроксилаза (ФАГ, ЕС 1.14.16.1) [http://enzyme.expasy.org/EC/1.14.16.1]. Фенилаланингидроксилаза катализирует реакцию гидроксилирования ФА в тирозин [Fitzpatrick P.F., 2012].
2. Наследственные гиперфенилаланинемии (ГФА) связанные с дефицитом тетрагидробиоптерина (BH4) - генетически гетерогенная группа прогрессирующих неврологических расстройств, обусловленных мутациями в генах, кодирующих ферменты, участвующих в синтезе или регенерации BH4. Тетрагидробиоптерин является кофактором ферментов фенилаланингидроксилазы, тирозингидроксилазы (TH; 191290) и триптофангидроксилазы (TPH1; 191060), участвующих в синтезе нейромедиаторов - дофамина, серотонина, норадреналина [Thny B., Blau N., 2006]. ГФА BH4 C (#261630), обусловлена мутациями в гене дигидроптеридин редуктазы (QDPR, 612676) [http://omim.org/entry/261630; http://omim.org/entry/ 612676] описана одной из первых, у детей с прогрессирующей неврологической симптоматикой и не реагирующих на диету с ограничением ФА [Butler I.J. et al., 1975; Smith I. et al., 1975]. В печени, мозге и культивируемых фибробластах кожи больных было обнаружено отсутствие фермента дигидроптеридин редуктазы [Kaufman S. et al., 1975].
ГФА BH4 A (#261640), вызвана мутациями в гене 6 пирувоилтетрагидроптерин синтазы (PTS, 612719) [http://omim.org/entry/261640; http://omim.org/entry/612719] описана в 1978г. у ребенка с гипотонией и задержкой моторного развития, у которого было выявлено значительное снижение тетрагидробиоптерина (до 10% от нормы) в печени, сыворотке крови и моче [Milstien S. et al., 1977; Rey F. et al., 1977; Kaufman S. et al., 1978]. Позже было установлено, что причиной данного типа ГФА является недостаточность 6 пирувоилтетрагидроптеринсинтазы, участвующей в метаболизме тетрагидробиоптерина [Niederwieser A. et al., 1987; Dudesek A. et al., 2001].
ГФА BH4 B (#233910), вызвана мутациями в гене GTP-циклогидролазы (GCH1, 600225) [http://omim.org/entry/233910; http://omim.org/entry/600225] впервые диагностирована в 1984г. у четырехлетнего ребенка с тяжелой дистонией, судорогами и приступами гипертермии. В спинномозговой жидкости было выявлено снижение биоптерина, а при биопсии печени - дефицит GTP-циклогидролазы I [Niederwieser A. et al., 1984; Naylor E.W. et al., 1987; Blau N. et al., 1995]. Рядом исследователей показана связь дефицита GTP-циклогидролазы I с ДОФА-зависимой дистонией с или без ГФА (синдром Сегавы, DYT5, #128230) [Furukawa Y. et al., 1998; Nardocci N. et al., 2003; http://omim.org/entry/128230].
ГФА BH4 D (#264070), обусловлена мутациями в ген 4-карбиноламин дегидратазы (PCBD1 126090) [http://omim.org/entry/264070; http://omim.org/entry/ 126090] описана в 1987г. [Dhondt J.-L., 1987]. Данная форма ГФА обусловлена дефицитом птерин-4-альфа-карбиноламиндегидратазы и характеризуется преходящим повышением уровня ФА, мягким течением, нормальным уровнем психомоторного развития, повышением экскреции 7-биоптерина (примаптерина) [Blaskovics M. et al., 1988]. Согласно данным литературы наиболее часто встречаются формы, обусловленные мутациями в генах PTS и QDPR [http://www.bh4.org/; http://www.biopku.org/home/BH4.asp].
Описаны еще две формы заболеваний, обусловленные дефицитом BH4 и характеризующиеся преимущественным поражением центральной нервной системы, но не сопровождающиеся ГФА: дофа-чувствительная дистония (#612716), вызванная мутациями в гене сепиаптерин редуктазы (SPR, 182125) и аутосомно-доминантная дофа-чувствительная дистония (DYT5; #128230), обусловленная мутациями в гене GCH1, ответственном за развитие ГФА BH4 B . Однако гиперфенилаланинемия у пациентов с данными формами все же может развиться на фоне стресса [http://omim.org/entry/182125; http://omim.org/ entry/128230].
Показателем, определяющим «фенотип» или тяжести течения ФКУ, согласно современным классификациям, является уровень фенилаланина. При определении тяжести состояния не учитываются клинические проявления заболевания, в том числе и степень умственной отсталости [Daniele A. et al., 2007; Mitchell J.J., 2013; Blau N., 2016].
Демографические показатели и национальный состав населения РО
Из 265 пациентов зарегистрированных в базе данных ФКУ, 61 больной выявлен при проведении селективного скрининга и 204 при проведении неонатального скрининга, что составило 23,02% и 76,98% соответственно. При проведении неонатального скрининга с диагнозом ФКУ выявлено 140 больных (68,63%) и с ГФА - 64 ребенка (31,37%). Соотношение больных ФКУ и ГФА составило 2,19:1. В группе наблюдается незначительное преобладание лиц мужского пола – 136 (51,32%) против 129 лиц женского пола (48,68%), соотношение м:ж – 1,1:1. По данным ГБУ РО «МИАЦ» численность детского населения (от 0 до 14 лет 11 месяцев 29 дней) на 1.01.2015г. составляет 648245, из них проживающие в городах - 349853, в сельской местности 298392 [http://www.miacrost.ru/].
Все семьи были приглашены на прием к врачу-генетику для проведения молекулярно-генетического исследования. На приглашение откликнулись 120 семей (131 больной). На каждого пробанда заполнялась генетическая карта с обязательным составлением родословной. При составлении родословной учитывали сведения о местах рождения родителей пробандов, их национальную принадлежность, наличие кровнородственных браков, а также информацию о заболеваниях и причинах смерти членов родословной. Этническая принадлежность пробанда регистрировалась с учетом национальности обоих родителей и прародителей.
При обследовании, все пациенты подписали письменное информированное согласие (в случае несовершеннолетних детей информированное согласие получено у их родителей) на добровольное участие в исследовании, на забор биологического материала (кровь) и на публикацию в печати (Прил. 6). Настоящее исследование одобрено этическим комитетом ФГБНУ «МГНЦ».
Материалом для исследования служили бланки с кровью или венозная кровь.
Биохимическое исследование - определение уровня фенилаланина у больных ФКУ (в динамике) осуществляли в клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ РО «Перинатальный Центр» флуориметрическим методом. Исследование проводили с применением набора реагентов для количественного определения фенилаланина в сухих пятнах крови (Россия) на приборе «Victor-2» (Wallac Oy/Perkin Elmer Life Sciences (Финляндия)).
Набор состоит из двух комплектов, один из которых – комплект калибровочных и контрольных проб, другой – реагенты для проведения химической реакции. Метод основан на образовании флуоресцирующего комплекса фенилаланина с нингидрином, в присутствии L-лейцин-L-аланина. Интенсивность флуоресценции комплекса соответствует количеству исходного фенилаланина. На приборе измеряется интенсивность флуоресценции. Для измерения флуоресценции в лунках планшета при длине волны возбуждения 390 нм и длине волны испускания 485 нм [Инструкция по применению набора реагентов для количественного определения ФА в сухих пятнах крови флуориметрическим методом, утверждена МЗ РФ 10.08.1998г., разработали А.П.Савицкий, М.В.Пискунов, А.В.Савицкая].
Проводилось исследование мутаций в гене РАН, при отсутствии мутаций поиск осуществляли в генах ответственных за формирование ГФА ВН4.
Выделение геномной ДНК, из лейкоцитов периферической крови пациентов, выполнялось с помощью набора реактивов для выделения DNA Prep100 (DIAtomтм) в соответствии с протоколом производителя.
Поиск 8 наиболее частых мутаций в гене РАН (R408W, R252W, P281L, R158Q, R261Q, IVS4+5G T, IS10-11G A, IVS 12+1G A) проводили методом аллельспецифичной мультиплексной лигазной реакции (MLPA).
Метод полимеразной цепной реакции применялся для выявления точковых мутаций. Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводилась по методу ПЦР, с помощью программируемого термоциклера MC2 фирмы «ДНК-технология» (Россия).
Определение образцов нуклеотидной последовательности, для которых не были выявлены мутации на первом этапе, проводились методом прямого секвенирования продукта ПЦР, как с прямого, так и с обратного праймера, на основе ферментативного сиквенса по Сенгеру. Для проведения сиквенса, в качестве матрицы, использовались фрагменты, полученные после проведения ПЦР [Степанова А.А., 2005]. Поиск крупных делеций в гене РАН осуществляли с применением количественной мультиплексной лигазной реакции (MLPA) на программируемом термоциклере MC2 фирмы «ДНК-технология» (Россия).
Для определения частоты мутации R408W в Ростовской области проведен скрининг здоровых неродственных индивидов из пяти районов области. Исследование было добровольным. Во всех случаях получено информированное согласие о проведении данного исследования. Все доноры выбраны с учетом проживания на территории РО не менее 3-х поколений.
Группа здоровых доноров в основном представлена старшеклассниками общеобразовательных школ и колледжей - 88%, остальные 12% - взрослые доноры станции переливаний крови. В общей сложности обследовано 470 индивидов из следующих районов области: Миллеровский – 108, Цимлянский – 96, Волгодонской – 93, Целинский – 92, Родионово-Несветаевский – 81.
Молекулярно-генетическое исследование по определению мутации R408W в гене РАН проведено в лаборатории ДНК–диагностики МГНЦ РАМН под руководством проф. Полякова А.В.
Спектр мутаций в гене РАН с учетом национальности пациентов
Далее по частоте, у больных ФКУ в Ростовской области, следуют мутации в сайтах сплайсинга 10 и 12 экзонов: IVS10-11G A (IVS10nt546) и IVS12+1G A (IVS12ntl). Частота обеих мутаций составляет по 3,85%, соответственно.
Данные мутации встречаются в различных регионах России с частотой, не превышающей 10%. Показана вариация значений частоты мутации сайта сплайсинга IVS10-11G A от 1,2% в г. Санкт-Петербург до 8,7% в Самарской области [Барановская С.С. и др., 1996; Смагулова Ф. и др., 2000; Степанова А.А., 2005; Зинченко Л.В. и др., 2006; Батурина О. А. и др., 2012]. У больных в Вологодской области, Республике Башкортостан и Карачаево-Черкесской Республике данная мутация не выявлена [Степанова А.А., 2005; Караванова Е.А. и др., 2010; Гундорова П. и др. 2015].
Частота мутации сайта сплайсинга IVS12+1G A в России также варьирует от 2,2% в Курской области до 10,0% Вологодской области [Степанова А.А., 2005; Зинченко Л.В. и др., 2006].
Мутация сайта сплайсинга IVS10-11G A наиболее характерна для жителей Средиземноморских стран, так частота во Франции составляет 8,6% [Jeannessonhivisol E. et al., 2015], в Италии 12,1% [Trunzo R. et al., 2014], в Испании 14,7%, у испанских цыган 87,5% [Prez B. et al., 1997]. Высокие частоты мутации IVS10-11G A отмечены в Марокко 8,3% [Dahri S. et al., 2010], в Тунисе 12,0% [Khemir et al., 2012], в Египте 17,4% [Effat L.K. et al., 2008], в Израиле 18,8% [Bercovich D. et al., 2008], в Турции 24,6% [Dobrowolski S.F. et al., 2011]. Данная мутация является частой и в странах Латинской Америки - Аргентине, Мексике и Чили и составляет 10-13% [Guldberg P., 1998; Pеrez B. et al., 1999].
В Европе и мире частота мутации сайта сплайсинга IVS12+1G A варьирует и составляет в Молдове - 2,3% [Boiciuc K. et al., 2014], в Чехии - 3,0% [Kozk L. et al., 1997], в Словакии - 5,3% [Polak E. et al., 2013], в США - 7,8% [Guldberg P. et al., 1996], в Германии - 10,0% [Aulehla-Scholz C. et al., 2003], у казахов в Казахстане 10,0% [Оразгалиева М.Г., 2005], в Нидерландах - 24,0%, Англии -27,0% и Дании - 37,0% [Zschocke J., 2003]. Несмотря на выраженные вариации значений частоты встречаемости данная мутация входит в спектр частых мутаций в большинстве стран Европы.
Частота миссенс мутаций R261Q у больных ФКУ Ростовской области составила так же 3,85%. В России данная мутация выявлена в Кемеровской области с частотой 2,9%, в Новосибирской 8,5%, в Республике Башкортостан 12,4% [Караванова Е.А. и др., 2010; Батурина О. А. и др., 2012].
Наибольшие частоты мутации R261Q по данным литературы отмечены у казахов в Казахстане 20,0%, в Нидерландах 18,0%, в Бразилии 16,0%, на Кубе 15,8%, в Италии 15,7% и в Иране 12,1% [Desviat L.R. et al., 2001; Zschocke J., 2003; Оразгалиева М.Г., 2005; Daniele A. et al., 2007; Santos L.L. et al., 2008; Zare-Karizi Sh. et al., 2011]. В других популяциях Южной Европы, Северной Африки и малой Азии данная мутация встречается с частотой от 2,1% до 10% и также входит в спектр частых мутаций, характерных для региона.
С одинаковой частотой выявлены мутации P281L и R158Q по 2,69% (по 7 хромосом) соответственно. Указанные мутации в большинстве регионов также входят в группу частых мутаций с частотой, не превышающей 10,0%.
В России по данным популяционных исследований значения частоты мутации P281L варьировали от 2,9% в Новосибирской области до 6,5% в Московской [Степанова А.А., 2005; Зинченко Л.В. и др., 2006; Батурина О. А. и др., 2012]. В Греции и Хорватии частота данной мутации выше, чем в других регионах и составляет 10,0% и 11,0%, соответственно, что позволило авторам высказать предположение о возможном происхождении данной мутации в Юго-Восточной Европе [Zschocke J. et al., 2003].
Частота мутации R158Q у больных ФКУ Ростовской области сопоставима с данными по другим регионам, как например, 2,69% против 2,9% в Кемеровской области и Республике Башкортостан. Однако в Новосибирской области частота данной мутации составляет 5,0% [Караванова Е.А. и др., 2010; Батурина О. А. и др., 2012]. В Европе показатели частоты мутации R158Q варьируют от 2,6% в Украине до 9,0% в Бельгии и Словении [Nechiporenko M.V. et al., 2000; Zschocke J., 2003; Groselj U et al., 2012].
Другие мутации, выявленные в ходе данного исследования, встречались с частотой менее 2,0%. Крупная делеция EX5DEL впервые выявлена у больных РО и не относится к частым в других регионах мира. Частота данной мутации в РО составляет 1,92%. Ранее не зарегистрированная у больных ФКУ, проживающих на территории РФ, миссенс мутация R252W также выявлена с частотой 1,92% в РО. Однако в Чили ее частота составляет 8,7% [Pеrez B. et al., 1999].
Необходимо отметить, что мутация L48S частота, которой составляет 1,15% в РО, является частой в Сербии и у евреев не ашкенази в Израиле, у которых показатели ее частоты составляют 31,0% и 16,8% соответственно [Bercovich D. et al., 2008; Djordjevic M. et al., 2013].
Нонсенс мутация R261X, по результатам данного исследования является редкой (1,15%), в то время как в Карачаево-Черкесской республике является частой и составляет 69,4% [Гундорова П. и др. 2015]. Мутации в сайтах сплайсинга IVS4+5G T, IVS103C T, IVS11+1G C, миссенс мутации A300S, Е280К, R297H и делеции F39del, K363f Nfs определены также с одинаковой частотой (0,77%) и в общей сложности составили 6,15%. Остальные 22 мутации выявлены в единичных случаях (0,38%) и суммарно составляют 8,46% от всех мутантных аллелей гена РАН.
Изучение генотип-фенотип корреляций у пациентов с ФКУ в РО
Проведенный анализ спектра и частот мутаций в гене РАН с учетом национальной принадлежности больных ФКУ, показал, что выявлены определенные особенности частот и спектра мутаций в разных этнических группах. Для русского населения наиболее частыми мутациями определены: R408W (частота мутации 69,47%), IVS12+1G A (3,46%); R261Q (2,69%), и R158Q (2,31%). У армян, больных ФКУ частыми определены мутации IVS10-11G A (40% у армян) и R252W (20% у армян). У турок-месхетинцев больных ФКУ частыми выявлены мутация R408W (40% у турок-месхетинцев), IVS10-11G A (40% у турок-месхетинцев). Для /R297H (даргинцев частой определена мутация R261X (75% у даргинцев). При ДНК исследовании 8 пациентов с ГФА у 7 больных выявлены мутации в гене PAH в гомозиготном и в компаунд гетерозиготном состоянии (R408W/R408W, R408W/A403V, R408W/T372S, R408W/p.I306V, A300S2), V245A/S16 XfsX1). В одном случае диагностирована ГФА BH4A (ген PTS генотип N52S/P87S).
Частота гетерозиготного носительства, по результатам скрининга здоровых индивидов на носительство мутации R408W в обследованной выборке составила 2,13% (1:47 человек) или 90356 человек в РО являются гетерозиготными носителями. Проведение в регионе неонатального скрининга и выявление больных ФКУ позволило рассчитать, в соответствие с законом Харди-Вайнберга, частоту гетерозиготного носительства ФКУ среди детского населения, которая составила 2,60% или 18687 детей, родившихся в период 1997-2014 гг. При пересчете на общую численность населения области (4242080) 106052 человека в РО являются гетерозиготными носителями различных мутаций в гене РАН.
В настоящее время описано более 950 мутаций в гене РАН, обуславливающих большое разнообразие генотипов. При анализе локализации и типу выявленных мутаций определено, что в РО чаще встречаются миссенс мутаций (21 мутация-52,50% от общего числа выявленных мутаций/81,54% от общего числа исследованных хромосом), локализованные в каталитическом домене. Известно, что миссенс и нонсенс мутации, мутации сайта сплайсинга, большинство делеций и инсерций приводят к значительному снижению активности ФАГ [Lleyap H.U. et al., 2006; Pey A.L et al.,2007; Scriver C. R., 2007; Gersting S.W. et al., 2008; Cerreto M. et al., 2011; Rblov K. et al., 2015]. Учитывая, что у больных ФКУ РО 81,54% выявленных миссенс мутаций находятся в каталитическом домене можно ожидать большое число тяжелых форм ФКУ.
Проведенное молекулярно-генетическое исследование позволило описать 49 различных вариантов генотипов у обследованных больных. Гомозиготные генотипы определены у 65 больных по 4 мутациям: R408W – 59 больных (90,76%), IVS12+1G A – 3 больных (4,62%), IVS10-11G A – 2 (3,08%), R261X – 1 больной (1,54%), в двух случаях гомозиготное состояние по мутациям IVS12+1G A и R261X в русской и даргинской семьях обусловлено инбредным браком.
Генотипы в компаунд гетерозиготном состоянии, выявленные также у 65 больных ФКУ в РО, в большинстве случаев (27 генотипов у 44 больных), представлены сочетанием мутации R408W со следующими вариантами: P281L (3,85%), IVS12+1G A (3,08%), R158Q (2,31%), L48S (2,31%), EX5del (2,31%), R261Q, (2,31%), R252W (1,54%) и IVS10-11G A (1,54) и другими единичными мутациями, которые составили в общей сложности 14,61%. Другие сложные генотипы (18) в компаунд гетерозиготном состоянии отмечены у 21 больного, что составляет суммарно 16,15%. В общей сложности генотипы с гомозиготным и компаунд гетерозиготным состоянием по различным мутациям в гене РАН разделились 1:1.
В ряде работ отмечено, что спектр генотипов характерный для отдельных регионов является результатом сочетания основных факторов популяционной динамики, включающих эффект миграции, основателя и генетический дрейф [Реу A.L. et al, 2007; Tansek M.Z. et al., 2015].
Современная классификация ФКУ не учитывает данные о переносимости ФА конкретным больным. Для анализа степени тяжести фенотипов больных выделены три категории: кФКУ, уровень ФА в крови 20 мг% и переносимость ФА менее 20 мг/кг/сутки; мФКУ, уровень ФА10 20 мг% и переносимость ФА 25-50 мг/кг/сутки; ГФА, уровень ФА2 10 мг%, диетотерапии не придерживаются. Проведенный анализ показал, что в общей сложности из 130 больных ФКУ у 101 (77,69%) болезнь протекает в тяжелой форме (кФКУ), у 22 (16,92%) можно говорить о мягкой форме ФКУ (мФКУ) и у 7 (5,39%) о гиперфенилаланинемии (ГФА). Формы мФКУ и ГФА в общей сложности составляют 22,31%.
Большое число исследований в последнее время посвящено оценке чувствительности к сапроптерину гидрохлориду больных ФКУ в регионе, который может быть предложен в качестве дополнения к диете или как монотерапия. Группе детей с мФКУ и ГФА может быть рекомендовано тестирование с целью определения чувствительности к сапроптерину гидрохлориду. Анализ кФКУ выявил 18 детей со сложными генотипами в компаунд гетерозиготном состоянии, которым также может быть рекомендовано тестирование с целью определения чувствительности к сапроптерину. Таким образом, 34 больных ФКУ в РО могут быть потенциальными «ВН4-ответчиками», что составляет 26,15%. Полученные результаты согласуются с данными литературы, что около трети больных в регионе могут быть чувствительными к терапии сапроптерином [Bercovich D. et al., 2008; Zurflh M. R. et al., 2008; Dobrowolski S.F. et al., 2009; Trefz F.K. et al., 2009; Feillet F. et al., 2010; Camp K.M. et al., 2014; Scala I. et al., 2015; Anjema K. et al., 2016; Blau N., 2016].