Введение к работе
Хромосомы эукариотических организмов являются сложными надмолекулярными образованиями,осуществлящими кодирование и реализацию наследственной информации.Выяснение принципов организации хромосомы и составляющих ее структурных элементов является одной из главных задач современной генетики.
В зависимости от стадии клеточного цикла,укладка ДОІ и интенсивность функционирования хромосомы меняются.Максимальная экспрессия генетического материала происходит в интерфазе.Однако в это время хромосомы максимально деконденсированн, и визуальный анализ подавляющего большинства локусов невозможен.
Уникальной и общепринятой моделью интерфазной -хромосомы являются политешше хромосомы слюнных желез двукрылых. Они представляют собой пучки хроматид, каждая из которых неоднородна по длине и состоит из плотных конденсированных образований - хромомеров,соединенных между собой менее конденсированными межхромомерными образованиями.Параллельные связки гомологичных хромомеров формируют диски,активация генетического материала которых сопровождается образованием вздутий или пуфов.Большие размеры хромосом и высокая специфичность дискового рисунка позволяет легко идентифицировать отдельные районы. Данное исследование проводилось на наиболее изученном генетическом Объекте Drosophila melatiogaster.
Одним из ключевых вопросов организации интерфазной хромосомы является вопрос о функциональном смысле ее дифферекциро-ванности по длине,о соотношении меяду генами и составляющими хромосому морфологическими элементами - дисками.междисками и пуфами. Наличие многочисленных гипотез,объясняющих организацию этих структур,отражает отсутствие надежного фактического материала, который позволил бы осуществить привязку генов к наблюдаемым структурам (обзорн.*Веегташі,19б2, 1972; Кикнад-3e,I972;Ashbumer,1972; Гвоздев,1978;Zhimulev et al.,1981 ). Решить эту проблему можно путем исследования информационного содержания конкретных дисков,междисков и пуфов,выяснения вопроса о том.какие последовательности ЩК формируют эти структуры и как зависит их морфология от активности этих последовательностей.
Дель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение функционального значения хромомерной организации по-литенной хромосомы путем анализа информационного содержания составляющих ее морфологических элементов - дисков,междисков и пуфов.
Для достижения этой цели в работе были использованы два подхода. Первый из них, традиционный в цитогенетике, состоял в изучении генетическими методами функциональной организации элементарных структур - дисков, междисков и пуфов. При этом необходимо было перевести такие исследования на электронно-микроскопический (ЭМ) уровень,позволяющий с максимальной точностью картировать как исследуемые районы, так и затрагивающие их хромосомные перестройки. Ультраструктурный уровень патогенетического анализа использовался впервые, что потребовало проведения ряда методических разработок.
Второй - совершенно новый, оригинальный подход заключался в выявлении и морфологическом описании "искусственных" структур, формируемых встроенными в хромосому фрагментами ДНК с заранее известными молекулярно-генетическими характеристиками. Этот подход также требует применения ЭМ уровня анализа.
Конкретные задачи данной работы состояли в следующем:
I.Разработать приемы ЭМ картирования,позволяющие эффективно и точно определить дисковый рисунок исследуемого района.
2.Провести ЭМ картирование трех районов политенных хромосом D.meianogaster - 24А-25Р, 9Е-10В, 2АВ - И определить границы хромосомных перестроек,затрагивающих эти районы. Используя генетические данные.осуществить привязку выявляемых генетических локусов к морфологическим структурам, и таким путем оценить информационное содержание отдельных дисков.
3.Проанализировать развитие по возможности большого числа пуфов с разнообразной морфологией. Это позволило бы: а) выявить закономерности онтогенеза пуфов,как активных районов хромосом; б) оценить вклад пассивной деконденсации в процессы пуфообразования; в) определить степень морфологической и генетической сложности пуфов,сравнив полученные результаты с известными молекулярно-генетическими данными.
4.С помощью ЭМ авторадиографии провести анализ включения %-уридина в непуфовые районы политенных хромосом.чтобы, оце-
нить наличие транскрипционной активности в междисках.
5.Провести ультраструктурный анализ трансформированных районов хромосом, содержащих в своем составе фрагменты ДНК с известными молекулярно-генетическими характеристиками.Выявление новых структурных элементов,образуемых этими фрагментами, анализ их активного и неактивного состояния,дает возможность осуществить моделирование дисков, междисков и пуфов,что позволяет прямым путем оценить соотношение между морфологией,молекулярной организацией и функциональным состоянием встроенного материала ДНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. Основным научным результатом данной работы является создание нового направления, которое мояет быть сформулировано как молекулярно-цитогенетический анализ политенных хромосом на ультраструктурном уровне.Вклад автора в это направление состоит в разработке приемов и принципов ЭМ анализа политенных хромосом и их применение для изучения информационного содержания индивидуальных структур - дисков, мекдисков и пуфов.
С помсщы) разработанных приемов впервые реализован новый подход в изучении функциональной морфологии политенных хромосом - моделирование структур, формируемых фрагментами ДНК, встроенными в хромосомы путем трансформации.
- Сделаны оценки молекулярной длины ДНК в составе дисков, междасков и пуфов, а также определены коэффициенты упаковки . ДНК в этих структурах.
Впервые выполнен анализ развития более 60 морфологически различных пуфов и проведена классификация пуфов по числу дисков, участвующих в их формировании.
С помощью ЭМ авторадиографии осуществлен анализ интенсивности синтеза FHK в малых пуфах и междисках.
С привлечением генетических данных построены наиболее точные цитогенетические карты трех районов политенных' хромосом, используемых в настоящее время для молекулярно-генетиче-ских исследований.
На основании, полученных данных сделан ряд заключений,имеющих принципиальное значение для понимания структурной и функциональной организации хромосомы:
а) наряду с хромомерами, содержащими один ген, существуют
полигенные хромомеры;
б) активация гена в составе сложного хромсмера строго ло
кальна; хромомер не является единицей декомпактизации;
в) размер деконденсированной зоны соответствует длине
транскрибируемой последовательности ДНК;
г) морфологическое разнообразие пуфинга отражает степень
. транскрипционной сложности района;
д) мевдиск является транскрибируемым участком хромосомы
и может быть образован небольшой по длине последова
тельностью ДНК.
Полученные результаты используются при чтении курсов лекций в ряде вузов страны (Новосибирск,.Алма-Ата,Томск) и могут бнть применены в дальнейших генетических л молекулярно-гене-тических исследованиях. Разработанные приемы ЭМ картирования применяются при изучении политенных хромосом в ряде зарубежных лабораторий (Венгрия, Испания).
Апробация работы. Основные результаты данного исследова- ния докладывались на различных всесоюзных и международных симпозиумах,в том числе на третьем (Ленинград,1977), четвертом (Кишинев,1981) и пятом (Москва,1987) Съездах ВОІиС им. Н.И.Вавилова, ХІУ Международном генетическом конгрессе (Москва,1978),17 Советско-западногерманском симпозиуме "Структура и транскрипция генома" (Ереван,1981),мевдународном симпозиуме "Организация и экспрессия тканеспецифических генов"(Новосибирск, 1982), УШ Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Пущино,І984), У Всесоюзном совещании по структуре и функциям хромосомы (Пущино,1985),7 Всесоюзном совещании эмбриологов "Закономерности индивидуального развития организмов" (Ленинград,1985), 71 Всесоюзном симпозиуме"Моле-кулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), У Всесоюзной конференции по биологии и генетике дрозофилы (Львов,1987),а также на УІ Европейской конференции по генетике и биологии дрозофилы (Купари,Югославия, 1979), ІУ, У и 71 Международных совещаниях "Молекулярная биология и биология' развития дрозофилы (о.Крит, Греция, 1984, 1986, 1988).
Структура и объем работы. Диссертация изложена в настоящей брошюре в форме научного доклада. По теме диссертации опубликовано 49 работ. Представленный в них научный материал