Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Молекулярно-генетические механизмы морфогенеза сетчатки позвоночных 10
1.2. Транскрипционные факторы, принимающие участие в морфогенезе сетчатки позвоночных 15
1.2.1. Ген Retina and anterior neural fold homeobox (Rax) 18
1.2.2. Ген Paired box 6 (Pax6) 22
1.2.3. Ген Orthodenticle homeobox 2 (Otx2) 25
1.2.4. Ген Sine Oculis Homeobox 3 (Six3) 27
1.2.5. Ген Prospero-related homeobox 1 (Prox1) 29
1.2.6. Гены Distal-Less Homeobox 1 и 2 (Dlx1, Dlx2) 31
1.2.7. Гены Visual system homeobox 1 и 2 (Vsx1, Vsx2) 34
1.3. Фундаментальные исследования для регенеративной медицины 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Объект исследования 44
2.2. Препарирование тканей 44
2.3. Выделение РНК 45
2.4. Удаление геномной ДНК 46
2.5. Синтез кДНК 46
2.7. Конструирование праймеров 47
2.6. Нормировка кДНК библиотек 48
2.8. Полимеразная цепная реакция 48
2.9. Агарозный электрофорез 49
2.10. Секвенирование 49
2.11. Полимеразная цепная реакция в режиме «реального времени» 50
2.12. Иммуногистохимия 51
2.13. ImageJ 53
2.14. Интернет-ресурсы 53
Глава 3. Результаты исследования 55
3.1. Анализ динамики экспрессии генов семейства Vsx, Vsx1/Chx10-1 и Vsx2/Chx10, в процессе формирования сетчатки глаза кур Gallus domesticus 56
3.2. Структурный анализа ДНК ПЦР-фрагментов, соответствующих генам Vsx1/Chx10-1 и Vsx2/Chx10 кур. 58
3.3. Сравнительный анализ уровней экспрессии генов Vsx1/Chx10-1 и Vsx2/Chx10 в ходе развития сетчатки у эмбрионов кур 60
3.4. Локализации экспрессии белков Vsx1/Chx10-1 в сетчатке кур (Gallus domesticus) 62
3.5. Локализации экспрессии белков Vsx2/Chx10 в сетчатке кур (Gallus domesticus) 67
Глава 4. Обсуждение результатов 69
4.1. Эволюционные аспекты молекулярно-генетических механизмов морфогенеза сетчатки 73
4.2. Взаимодействия генов Vsx1/Chx10-1 и Vsx2/Chx10 82
Заключение 84
Список сокращений 86
Список литературы 88
- Ген Retina and anterior neural fold homeobox (Rax)
- Фундаментальные исследования для регенеративной медицины
- Локализации экспрессии белков Vsx1/Chx10-1 в сетчатке кур (Gallus domesticus)
- Эволюционные аспекты молекулярно-генетических механизмов морфогенеза сетчатки
Ген Retina and anterior neural fold homeobox (Rax)
Высоко консервативный транскрипционный фактор Rax (retina and anterior neural fold homeobox), содержащий кроме гомеодомена OAR-домен и октопептид (Рис.5), необходимые для связывания с ДНК при контроле активности подчиненных генов. Rax выполняет критическую роль в развитии глаза и сетчатки многих видов позвоночных и беспозвоночных. В таблице.2 приведена информация об ортологах гена RAX человека (для примера приведено 6 из 15 видов различных систематических групп из базы данных Gene Cards).
Как видно из таблицы структура генов Rax очень консервативна, однако паттерн экспрессии схож, но не идентичен между различными видами позвоночных и беспозвоночных, включая мушку дрозофилу, мышь, тропическую лягушку, кур и человека (Casarosa et al., 1997, Loosli et al., 2001). Различно и число генов этого семейства: у мыши идентифицирован один ген Rax, у амфибий Xenopus laevis - два, xRx, xRxL/xRx2, у рыб Zebrafish три гена (zRx1,2,3) (Mathers et al.,1997). Экспрессия гена Rax впервые детектируется в передней части нейрального региона развивающегося эмбриона, позднее наблюдается в сетчатке, в вентральном гипоталамусе и в шишковидной железе (эпифизе).
Показано участие гена Rax в специализации клеток глазного поля в передней части нервной пластинки на стадии ранней нейрулы (Рис. 6А), при разделении глазного поля на два билатерально симметричных домена и в дифференцировке клеток сетчатки (Рис. 6С) (Stigloher et al., 2006; Bailey et al., 2004). Эвагинация глазных пузырей из боковых стенок переднего мозга у рыб обеспечивается латеральной миграцией rx3 позитивных клеток - предшественников сетчатки (Rembold et al., 2006). Мутации гена Rax (rx3 у zebrafish Danio rerio) приводят к нарушению этого процесса (Loosli et al., 2003). У человека один ген семейства RAX, RAX, участвует в самых ранних процессах развития глаз, в пролиферации стволовых клеток сетчатки, второй ген RAX2 детектируется в наружном и во внутреннем слое зрелой сетчатки, влияя на экспрессию фоторецепторных генов (Furukawa et al., 1997).
Семейство Rax у Gallus gallus также имеет два гена, cRax и cRaxL. Ген cRax преимущественно экспрессируется в прогениторных клетках сетчатки, для второго гена cRaxL показано участие в дифференцировке фоторецепторных колбочек (Chen et al., 2002). У эмбрионов мыши высокий уровень экспрессии гена Rax детектируется в прогениторных клетках сетчатки, а позднее Rax участвует в дифференцировке фоторецепторных клетках и в формировании Мюллеровской глии (Furukawa et al., 2000).
В результате элиминации функции Rx у эмбрионов мышей, содержащих один ген семейства Rx (Рис. 6D), не формируется оптический бокал и глаз в целом. Нокаут гена Xrx1 у эмбрионов xenopus также приводит к полному отсутствию глаза (Рис. 6F,6Е) (Bailey et al., 2004). И наоборот, суперэкспрессия гена Rx у эмбрионов шпорцевой лягушки способствует гиперпролиферации в результате чего формируется эктопический пигментный эпителий (Рис. 7а), происходит дупликация сетчатки (Рис. 7d) (Mathers et al.,1997). Описано множество случаев микрофтальмии и анофтальмии у человека связанных с мутации в гене Rax (Voronina et al., 2004), некоторые связывают с тяжелыми аномалиями развития мозга (Abouzeid et al., 2012). Показано, что в процессах нейрогенеза сетчатки принимают участие транскрипционные факторы Pax6, Chx10, Rax, Six3, коэкспрессия которых в прогениторных клетках сетчатки указывает на возможное взаимодействие. В исследованиях на шпорцевой лягушке доказано прямое взаимодействие Rax с факторами транскрипции Sox2 и Otx2 (Danno et al., 2008).
Транскрипционный фактор Rax участвует в спецификации нейральной сетчатки, регулируя активность 52 нижестоящих генов. К ним относятся EphrinB1 и Sh2d3c, являющиеся позитивными регуляторами передачи сигналов TCR (T-Cell Receptor) и EGF (Epidermal Growth Factor), которые контролируют миграцию, адгезию, пролиферацию и поддержание мультипотентного статуса клеток нейральной сетчатки (Giudetti et al., 2014).
Фундаментальные исследования для регенеративной медицины
В настоящее время благодаря успехам в молекулярной генетике и экспериментальной эмбриологии возникла новая область медицины -регенеративная медицина, которая включает молекулярно-биологические, фармацевтические, клеточные, тканевые технологии для стимуляции регенерации поврежденных органов и тканей. Для дальнейшего развития регенеративной медицины необходимы исследования генетических механизмов регуляции клеточной дифференцировки; идентификация транскрипционных факторов и биологически активных молекул, стимулирующих процесс регенерации;
Основные результаты научных исследований в этих направлениях
Важнейшим достижением последнего десятилетия стала технология получения плюрипотентных клеток из дифференцированных клеток взрослого организма. Из фибробластов кожи человека и мыши с помощью трансдукции четырех транскрипционных факторов: Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc, получены индуцированные плюрипотентные клетки (iPS). По морфологии, пролиферации, экспрессии генов плюрипотентного статуса, поверхностным антигенам и активности теломеразы iPS схожи с эмбриональными стволовыми клетками (Yamanaka, 2007; Takahashi et al., 2006). Использование iPS-клеток может внести существенный вклад в области офтальмологии, в частности при разработке эффективных методов лечения дистрофии сетчатки. Используя метод перепрограммирования генома клеток кожи, уже получены iPS, из которых удалось вырастить пласт клеток пигментного эпителия. Этот пласт пересаживали на тыльную сторону сетчатки той же обезьяны, у которой брали кожу, что исключало несовместимость. Пересаженный пласт клеток восстанавливал дегенерировавший пигментный эпителий сетчатки (Okamoto et al., 2011). В 2013 г в Японии начаты клинические исследования с использованием iPS-клеток для лечения возрастной макулярной дистрофии, при которой происходит разрушение клеток центральной сетчатки, в результате чего нарушается зрение, часто вызывая слепоту (Perusek and Maeda, 2013).
Группа исследователей под руководством M. Valeria Canto-Soler (Johns Hopkins University School of Medicine, Балтимор, США) из iPSC клеток человека в условиях 3D культивировании, обеспечивающей нейральную дифференцировку, «вырастила» сетчатку человека. Полученная ткань содержала семь клеточных типов, включая фоторецепторов, которые не только имеют морфологию, но и обладают функцией световой детекции (Zhong et al. 2014).
В ходе совместных исследований ученые Израиля (Beth Israel Deaconess Medical Center) и США (Dana-Farber/Boston Children s Cancer and Blood Disorders Center, США) был разработан новый метод регенерации ткани с помощью синтетических аналогов стимуляторов ангиогенеза. Известно, что при повреждениях эндотелиальные клетки интимы сосудов продуцируют эпоксиэйкозотриеновые кислоты (EETs), которые могут стимулировать ангиогенез, индуцируя синтез фактора роста эндотелия сосудов VEGF (vascular endothelial growth factor). Для изучения регенерации разных тканей, в том числе сетчатки, создано 7 экспериментальных моделей животных. Установлено, что применение генетических и фармакологических модификаций EETs in vivo стимулирует процессы регенерации ткани (Panigrahy et al., 2013). Дисфункция клеток пигментного эпителия является одной из причин развития возрастной макулярной дистрофии, ишемии сетчатки и других наследственных заболеваний сетчатки. В настоящее время активно ведутся работы в области генной терапии, которые путем внедрения терапевтической генной конструкции устраняют дефекты в работе органов. Так, у обезьян и мышей удалось вылечить амавроз Лебера, наследственное заболевание сетчатки. Для доставки генной конструкции был использован аденовирус (Li et al., 2011; Jacobson et al. 2006). Известно, что развитие возрастной макулярной дегенерации сетчатки, пигментного ретинита и врожденного амавроза Лебера связано с мутациями гена RPE65 (retinal pigment epithelium 65), специфически экспрессирующийся в пигментном эпителии. Проводятся работы по разработке методик лечения заболеваний сетчатки человека (Cideciyan et al., 2008). Начаты клинические исследования терапии этого заболевания путем введения функционального гена RPE65 (http://www.revophth.com/content/d/retina/c/44206/). Перспективным направлением в современной медицине для лечения наследственных заболеваний является использование направленного редактирования генома с помощью систем CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) (Ma et al., 2007). Отношение международного сообщества исследователей стволовых клеток (ISSCR, International Society for Stem Cell Research) к этим исследованиям неоднозначно. С одной стороны, использование технологии редактирования генома может привести к грандиозным открытиям в медицине, с другой – её нельзя применять без изучения безопасности и рассмотрения этических и социальных факторов. Неисчерпаемым источником для применения технологий направленного редактирования генома является множество заболеваний связанных с мутациями генов-регуляторов развития глаз, в частности в рассмотренных в настоящем обзоре. Мутации генов Rx/Rax, Pax6, Otx2, Six3, Hox7, Prox1и Vsx2 у человека приводят к дефектам или отсутствию глаз (Lagutin et al., 2003; Porter et al., 1997; Monaghan et al., 1991).
С мутациями в гене RAX у человека связаны микрофтальмия и анофтальмия (Voronina et al., 2004), некоторые связаны с тяжелыми аномалиями развития мозга - cerebral malformation (Abouzeid et al., 2012). Мутации гена PAX6 идентифицированы у многих пациентов с аниридией, которая у некоторых сопряжена с аномалиями нейрального развития (Chograni et al., 2014). С мутацией гена CRX связывают с наследственным заболеванием сетчатки амавроз Лебера и прогрессирующие заболевания, как колбочко–палочковая дистрофия или пигментный ретинит (Sohocki et al., 1998). Результатом мутации в гене OTX2 у человека является целый ряд заболеваний, включая микрофтальмию, гипоплазию оптического нерва, оплазию оптического нерва, колобом и анофтальмию (Beby and Lamonerie, 2013; Jimenez et al., 2011). Мутация в гомеодомене приводит к существенной редукции экспрессии гена SIX3, что вызывает гипоплазию оптического нерва (Samuel et al., 2016). Нокаут гена Prox1 у мышей приводит к гибели эмбрионов в середине беременности и к множеству дефектов развития глаза, а суперэкспрессия гена Prox1 индуцирует дифференцировку горизонтальных клеток сетчатки, продуцируя маленькие клоны (Wigle et al., 1999). С мутациями гена VSX2/Vsx2 у человека и у мыши связывают редукцию оптического нерва и микрофтальмию (Percin et al., 2000).
Наиболее перспективным направлением развития регенеративной медицины на сегодня рассматриваются исследования молекулярных основ патогенеза болезней и разработка новых способов генетической диагностики, персонализированный подход к терапии и совершенствование технологий направленного редактирования генома дифференцированных клеток. Изучение нормальных и дефектных генов, определение механизмов реализации генетической программы, изучение технологий лечения наследственных болезней, исправления генетических дефектов являются базой развития современной медицины. Результаты этих исследований в будущем позволят создавать новые клеточные модели получения аутологичных клеток и тканей с исправленным генотипом для заместительной клеточной терапии и тканевой инженерии.
Локализации экспрессии белков Vsx1/Chx10-1 в сетчатке кур (Gallus domesticus)
Для изучения локализации белков Vsx1/Chx10-1 в сетчатке кур (Gallus domesticus) применяли метод имуногистохимии. С помощью конфокальной микроскопии анализировали экспрессию данных генов в сетчатке на разных стадиях развития. Для анализа использовали сетчатку после отделения пигментного эпителия. В качестве маркера дифференцировки амакриновых клеток использовали Prox1, имуногистохимический сигнал которого выявляется во внутреннем ядерном слое (Рис.21), что совпадает с данными других авторов (Dyer et al., 2003).
На ранних анализируемых стадиях Е6-Е8 в сетчатке идет активная пролиферация, миграция и дифференцировка клеток. Сетчатка представлена упорядоченным слоем клеток, которые организованы в наружный и внутренний нейробластические слои. Внутренний слой сформирован из рыхло расположенных клеток, за счет выселения их из наружного слоя. Форма ядер внутреннего слоя овальная или слегка вытянутая. Среди них встречаются довольно крупные светлые ядра округлой формы. Применение моноклональных антител против Prox1 на стадиях Е6-Е8 позволило обнаружить в сетчатке единичные клетки внутреннего нейробластического слоя.
На стадиях Е10-Е12 продолжается активный морфогенез сетчатки. Клетки сетчатки на данных стадиях организованы в три ядерных слоя: наружный, внутренний и ганглиозный слои. Иммуноспецифическая реакция на Vsx1 была обнаружена во внутреннем ядерном слое, где идет активная дифференцировка интернейронов, в частности амакриновых клеток, маркером которых является Prox1. Сигнал Prox1 также детектировался в отдельных клетках ганглиозного слоя сетчатки.
На стадии Е14 произошли существенные изменения в морфогенезе, по сравнению с предыдущими стадиями. В сетчатке хорошо представлены наружный ядерный слой, внутренний ядерный слой и слой ганглиозных клеток, разделенные наружным сетчатым и внутренним сетчатым слоями. От ганглиозных клеток отходят нервные волокна, формирующие слой нервных волокон. Иммуноспецифическая реакция на Vsx1 четко детектируется в наружной части внутреннего ядерного слоя, где расположены on-биполяры. Сигнал моноклональных антител против Prox1 наблюдается во внутреннем ядерном и в ганглиозном слоях.
Таким образом, экспрессия транскрипционного фактора Vsx1/Chx10-1, имеющего ядерную локализацию, отчетливо выявляется в период с 6 и до 14 сут инкубации зародышей: на стадии Е6-Е8 (Рис.20) во внутреннем нейробластическом слое, позже, Е12-Е14, в наружной части внутреннего ядерного слоя (Рис. 21,22), который содержит ядра биполярных нейронов. Это согласуется с ранее полученными с помощью in situ гибридизации данными о распределении мРНК Vsx1/Chx10-1 в формирующейся сетчатки эмбрионов кур (Chen, Cepko, 2000). С помощью программы ImageJ был посчитан процент области определенного цвета и на основе этих данных построен график динамики экспрессии Vsx1 в ходе формирования сетчатки (Рис. 24).
Полуколичественный анализ белков показал, что транскрипционный фактор Vsx1/Chx10-1 имеет тенденцию к уменьшению белка в процессе активной дифференцировке клеток сетчатки (Е8-Е10). Максимальный уровень экспрессии Vsx1/Chx10-1 наблюдается на Е14, на стадии, когда морфогенез сетчатки заканчивается.
Основным результатом этой работы является наблюдение, что ген Vsx1 имеет несколько фаз максимального уровня экспрессии: на ранних стадиях формирования глаза (Е4), в процессе дифференцировки клеток сетчатки (Е6-Е10), и на более поздних стадиях развития (Е14), когда слои сетчатки в основном сформированы. Мы предполагаем, что во время формирования сетчатки ген Vsx1 выполняет разные функции, взаимодействует с генами-мишенями и принимает участие в пролиферации, дифференцировки и функционировании определенных типов клеток сетчатки.
Эволюционные аспекты молекулярно-генетических механизмов морфогенеза сетчатки
Глаз позвоночных формировался в ходе эволюции под влиянием условий внешней среды и генетики, приобретал новые функции и оптимизировал имеющиеся. У разных видов животных различия в строении сетчатки, свидетельствуют о большой приспособленности к жизни в различных условиях.
Светочувствительные элементы сетчатки, палочки и колбочки, распределены в разных частях сетчатки неравномерно. У человека палочки, воспринимающие сумеречный свет, рассеяны по всей поверхности зрительного отдела сетчатки, за исключением центральной ямки, которая содержит только колбочки, воспринимающие яркий и хроматический свет. У большинства млекопитающих, а также у амфибий и рыб преобладают палочки. У птиц и большинства рептилий больше колбочек, в силу чего птицы при сумеречном свете видят плохо.
Крупнейшим открытием конца ХХ века в области исследования глаза было обнаружение чрезвычайной консервативности механизмов, направляющих развитие глаза в различных систематических группах. Прогресс в понимании молекулярно-генетических механизмов, формирования глаза достигнут при изучении развивающегося глаза дрозофилы (Halder et al., 1995). Было установлено, что определяющую роль в развитии глаза у представителей всех изученных систематических групп играет ген Pax6/PAX6 и его ортологи (см. Обзор, гл 1.2.2). Ген Pax6/PAX6 является гомологом гена eyeless дрозофилы (Gehring, 1996; Quiring et al., 1994). Результаты экспериментов по эктопической экспрессии гена Pax6 мыши и кальмара в геноме дрозофилы (см. обзор литературы Рис. 8) позволили рассматривать его как мастер-ген, инициирующий экспрессию множества генов, необходимых для развития глаза (Halder et al., 1995; Tomarev et al., 1997). В настоящее время известно, что определяющую роль в морфогенезе глаза играют многокомпонентные сигнальные пути с участием основного каскада регуляторных генов. Исследуемые в настоящей работе транскрипционные факторы семейства Vsx входят в каскад регуляторов морфогенеза глаза.
Известно, что гомеобоксные гены Vsx1/Chx10-1, Vsx2/Chx10, кодируют белки, относящиеся к классу эволюционно консервативных транскрипционных факторов, которые содержат последовательность из 60 аминокислот - ДНК-связывающий гомео домен и CVC домен. Ортологи Vsx1 и Vsx2 идентифицированы у многих видов различных систематических групп: рыб (Passini et al., 1997), кур (Chen, Cepko, 2000), мышей (Chow et al., 2001; Liu et al., 1994) и человека (Semina et al., 2000). На рисунке 28 приведено сравнение аминокислотный последовательностей транскрипционных факторов семейства VSX у кур и двух видов рыб (Рис.28 В). На участках, соответствующих гомео и CVC доменам гомология аминокислотных последовательностей составляет более 90% как между видами, так и между родственными белками семейства Vsx кур, Vsx1/Chx10-1 и Vsx2/Chx10 (Рис.28 С).
Выравнивание аминокислотной последовательностей кур Chx10-1 и двух видов лучеперых рыб zebrafish Vsx-1 (NCBI AAB71611) и goldfish Vsx-1 (NCBI AAC24600). Область гомео и CVC доменов подчеркнуты одиночной и двойной линией соответственно. (В,С) Выравнивание аминокислотной последовательности гомео и CVC доменов соответственно (ck) Chx10-1 (NCBI AF178670) и Chx10 (NCBI AF178671); zebrafish (zf) Vsx-1 и Alx (NCBI AAB66714); goldfish (gf) Vsx-1 и Vsx-2; курица (NCBI AAC24601); мышь (mu) Chx10 (NCBI AAA60431); elegans (ce) Ceh-10 (NCBI AAA93063) (Chen and Cerko, 2000). Белки, содержащие СVС домен, классифицируются в две группы по RV и OAR регионам. Регион RV характерен группе Vsx1, а OAR группе Vsx2 (Рис 29). Кроме того, нематоды и насекомые имеют OAR домены, что свидетельствует о том, что белки домена HD/CVC беспозвоночных более связаны с группой Vsx2 и что группа Vsx1 могла возникнуть в результате дубликации Vsx2/Chx10 после отделения хордовых в процессе эволюции (Chow et al., 2001).
Данные, по количественной оценке, экспрессии мРНК исследуемых генов показали разные уровни (Рис.20), что согласуется с данными литературы. Было показано, что у мышей Vsx2 экспрессируется в прогениторных клетках на ранних стадиях морфогенеза глаза, а Vsx1 - в сетчатке во время постнатального развития (Chow et al., 2001; Liu et al., 1994). Экспрессия Vsx2/Chx10 у кур продолжается и в зрелой сетчатке в биполярных клетках и клетках Мюллеровской глии (Clark et al., 2008). Экспрессии Vsx1/Chx10-1 у кур существенно отличается от данных полученных на млекопитающихся. Так, у мышей белок Vsx1/Chx10-1 впервые выявлен в клетках внутреннего ядерного слоя на 5 сутки постнатального развития, экспрессия ограничивается биполярными клетками (Chow et al., 2001). Более поздние данные, полученные на Vsx1-ноль (нокаутных) мышах, указывают на то, что Vsx1 принимает участие в терминальной дифференцировке ON-, но не OFF-, биполяров (Рис.30) (Shi et al., 2011).
У позвоночных существует множество типов биполярных нейронов, но главным образом их можно классифицировать по мембранному потенциалу в 3 группы: OFF-нейроны колбочек (OFF cone bipolar cell), ON-нейроны колбочек (ON cone bipolar cell), R-нейроны палочек (Rode bipolar cell). Мембранный потенциал биполярных нейронов изменяется, под действие нервного импульса фоторецепторов, в отрицательную (гиперполяризация) или положительную (деполяризация) сторону. Биполярные клетки ON- и R- типов деполяризуются на свету, а OFF-биполяры в темноте, а гиперполяризуются, соответственно, наоборот. Наличие трех видов колбочек (и палочек, чувствительных в изумрудно-зеленой части спектра) дает человеку цветное зрение. Можно предположить, что появления гена Vsx1 привело к увеличению разнообразия типов биполярных клеток, что могло повлиять на цветовое зрение позвоночных. Как и многие факторы транскрипции, Vsx1/Chx10-1 и Vsx2/Chx10 многофункциональны и участвуют как в дифференцировке клеток сетчатки, так и в дальнейшем их функционировании. Эти транскрипционные факторы могут быть маркерами биполярных клеток, т.к. регулируют дифференцировку и функционирование данного типа интернейронов сетчатки. На основе полученных данных по относительному уровню экспрессии мРНК и полуколличественной оценке белков исследуемых генов были построены графики, приведенные на рисунке 31.
На графике 31(а) мы видим что экспрессия гена Vsx2 выше чем Vsx1, но оба гена имеют сходные пики на стадиях Е10 и Е14. На графике 31 (б) белки генов на стадии Е14 имеют максимальное значение в то время как на стадии Е10 минимальное. Можно предположить, что мРНК исследуемых генов после процессинга и выхода в цитоплазму не сразу приступает к трансляции, а образует нуклеопротеидные комплексы, тем самым регулируя интенсивность синтеза белка, отсюда несоответствие пиков мРНК и белка на представленных графиках. Периодичность функции ядер и сохранение полученной мРНК в цитоплазме до определенного времени, когда будет синтезирован белок, была открыта ещё А.А. Нейфахом (Нейфах и Лозовская, 1984) при изучении раннего зародышевого развития, однако для генов-регуляторов органогенеза и в частности генов семейства Vsx показана впервые.
Несмотря на то, что оба исследуемых гена играют важную, но отличающуюся роль в дифференцировке биполярных клеток сетчатки их роль в механизмах возникновения патологий сетчатки у человека изучена мало. Было показано, что Vsx1 и Vsx2 могут функционировать как транскрипционные репрессоры нескольких классов активаторов иммортализированных линий клеток, Vsx2 является репрессором нескольких индивидуальных энхансеров, таких как c-MYC, HSF1, SV40 и c-JUN (Dorval et al., 2005). Wang и коллеги (2016) продемонстрировали с помощью трансфицированных мультипотентных клеток глаза кур, что суперэкспрессия Chx10/Vsx2 не только нарушает пигментацию ПЭ, но и способствует появлению эктопической нейросетчатки. Подавление экспрессии гена Chx10/Vsx2 в постнатальной сетчатке путем РНК-интерференции приводит к значительному сокращению биполярных клеток (Livne-Bar et al., 2006). Нокаут гена Vsx2 у мышей приводит к уменьшению пролиферации прогениторных клеток и к отсутствию дифференцировки биполярных клеток (Percin F et al., 2000; Burmeister et al., 1996).
Следствием нарушения экспрессии Vsx2 являются множественные дефекты развития глаз, включая микрофтальмию, у человека и мутантных мышей, Chx10or-J/or-J (Burmeister et al., 1996). Развитие пигментного ретинита также связывают с нарушением экспрессии VSX2, который как установлено регулирует дифференцировку фоторецепторных клеток через активацию экспрессии фактора жизнеспособности колбочек RdCVF (Rod-derived Cone Viability Factor) (Reichman et al., 2010). Предполагается, что у мышей и рыб Vsx2 принамает участие в регуляции экспрессии Vsx1, поскольку дефицит экспрессии Vsx2 приводит к существенному повышению уровня мРНК Vsx1 (Clark et al., 2008). Для гена VSX1 описаны мутации, приводящие к утрате центрального зрения в следствие макулярной дегенерацией сетчатки у человека (Valleix et al., 2006). Мутация в гомеодомене (R166W) гена Vsx1 является причиной такой аномалии развития глаза у человека как кератоконус. Данная мутация значительно уменьшает репрессивную активность Vsx1 (Dorval et el., 2005). О важной роли транскрипционных факторов Vsx1/Chx10-1 и Vsx2/Chx10 в ретиногенезе свидетельствуют данные о наличии связи многих заболеваний и нарушений развития глаза у человека, включая микрофтальмию и анафтальмию (Zagozewskia et al., 2014).