Введение к работе
Актуальность проблемы. Синтез небольшого числа полипептидов
в ответ на повышение температуры выше оптимального для данпого
организма уровня - универсальная реакция,характерная для всех изу
ченных организмов от із.noil до человека ( Lindquiat , 1986).
При тепловом шоке (ТШ) происходит перестройка всех уровней актив
ности генома - от транскрипции и созревания РНК, до трансляции и
сборки белков (Лозовская, Евгеньев, 1984). Белки теплового шока
(БТР^ синтезируются не только в ответ на повшение внешней темпе
ратуры за пределы, характерные для обычных условий обитания орга
низма, но и на действие ряда других стрессовых факторов (например
окисляющих агентов, веществ, нарушающих энергетический метаболизм,
веществ, вызывающих осмотический стресс, некоторых вирусов и г.д.)
4 Kover , I9B4; Lindqui3t , 1986). Интересно и то, что ге-
ны, кодирующие БТШ, отличаются высоким консерватизмом своей структуры, что характерю для тех генов, которые играет важную роль в жизнедеятельности клетки (пример - гистоновые гены).
Т.к. экспрессия генов ТШ может индуцироваться различными стрессовыми факторами, то естественно было бы предположить, что одной из основных функции этой системы генов является защита клетки от повреждающего действия стресса и повышение ее устойчивости - иными словами, адаптация клетки к неблагоприятным воздействиям. Несмотря на то, что количество работ, посвященных изучению этого вопроса, стремительно расте' , молекулярные механизмы функциончро-вания системы теплового шока и функции БГШ в клетке в настоящее время до конца не ясны. Получен ряд данных, убедительно свидетельствующих в пользу участия БГШ в формировании термотолерантности и их возможной роли в защите клетки от неблагоприятных условий Среды ( Tanguay , 1983; Bosch et al , I98H).
К настоящему времени в литературе имеется сравнительно мало данных ио г-учению экспрессии генов ТШ у организмов, резко отличающихся по температуре спеды обитания. В связи с этим представлялось интересным выяснить характер экспрессии ггнов, кодирующих БТШ, у организмов, приспособленных в процессе эволюции к различны! температурным режимам. Отличаются ли более теплолюбивые организмы по способности экспрессировать БТШ при экстремально высоких температурах от тех, которые приспособлены к обитанию в более уме-
4. ренноы климате, и можно ли определенно говорить о положительной корреляции между способностью организма к высокотемпературной экспрессии генов ТШ и его термоустойчивостью? Имеет ли эта способность синтезировать БГШ при повішений температуры адаптивное значение? Ответы на эти вопрслы, а также изучение молекулярно-биоло-гических механизмов функционирования системы ответа на ТШ представляют не только теоретические интерес в плане изучения многосторонних взаимодействий организма и окружающей среды, но имеют и практически ценность при разработке способов и режимов адаптации к различным стрессам и создании новых форм с повышенной термоустойчивостью. Кроме того, в последнее время проблема реакции организмов на повышение температуры окружающей среды рассматривается в плане воздействия гипертермии на раковые клетки, которые, как и все активно делящееся клетки, оказались чувствительными, к высокой температуре. Поэтому проблемы, связанные с выяснением механизмов воздействия гипертермии на рост ракоЕ х опухолей, сейчас очень актуальны.
Цель работы. Целью настоящей работы явилось сравнение экспрессии генов ТШ у организыоз, отличающихся по температуре среды обитания, и установление возможных корреляций между синтезом БШ и термоустойчивостью организмов, приспособленных в процессе эволюции к различным температурным режимам внешней среды. Работа включала следующие задачи: I) изучить синтез БГШ как на трансляционном уровне, так и на уровне синтеза мРНК в модельных системах; 2) сравнить характер экспрессии генов ТШ при разных температурах у организмов, отличающихся по термоустойчивости; 3) проанализировать первичную структуру гена, кодирующего главный белок теплового шока у организма, приспособленного к обитанию в среде с жарким климатом - тутового шелкопряда.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований показано существование положительной корреляции между экспрессией генов ТШ и термоустойчивостьго у трех линий D.melanogaster, реагирующих по-разному на температурный стресс: контрольной ore -gon R , термоустойчивой линии Т и мутантной линии і (i)ts -403, характеризующейся высокой термочувствительностью.
Показана авторегуляция синтеза БГШ, т.е. способность этих белков ингибирозать собственный синтез по принципу обратной связи.
При изучении характера синтеза БТ1Д у трех видов шелкопряда, отличающихся по температуре среды обитания, обнаружено, что куль-
5. тур" клеток тутового и дубового шелкопрядов, видов, обитающих на юге, способны были синтезировать ьГШ при исключительно высоких температурах (до 50С) и отличались высокой термоусгойчивостыо. В клетках тутового шелкопряда (B.mori ) наблюдалось нарастание синтеза мРНК, кодирующая БТШ70, при повышении температуры вплоть до 45 С. Показано, что повышенная тер»орезистентность характерна и для гусениц тутового шелкопряда. G другой стороны, культура клеток вида, обитающего в умеренной полосе (непарный шелкопряд), характеризовалась гораздо меньшей теплоустойчивостью и способна была экспрессировать БТШ при температурах не выше 40С.
Показано, что инфецированна" вирусом ядерного полиэдроза (оЯП) культура B.mori теряла способность синтезировать ЕШ, что,по-видимому, явилось причиной ее повышенной чувствительности к высокой температуре.
Из геномной библиотеки B.mori получен клон Вшлзр 70, содержащий термоиндуцибельный ген ЫШ70. Построена рестрйктная карта этого клона и опрзделена нуклеотидная последовательность гена.Сте-пень гомологии его, последовательности аминокислот с ET1L70 дрозофилы составляет 83%. В 5'-регуляторной области клонированного гена обнаружены типичные регуляторные элементы ТШ (14-нуклеотидные про-иоторные HSE -элементы) с высокой степенью гомологии (не более 3-х замен) аналогичным регуляторним элементам дрозофилы.
Практическая ценность работы. Полученные данные могут быть использованы в экспериментах по разработке спсзобов и режимов адаптации организмов к различным экстремальным факторам. Результаты наших исследований можно использовать в работах по генетической инженерии» имеющих целью создание фор* с повышенной термоустойчивостью. Клон из генома B.mori , содержащий ген ШГ70, можно использовать при создании генных конструкций, активность экспрессии которых регулируется температурным фактором. Тутовый шелкопряд - важны" в народнохозяйственном плане объект, полученные в работе результаты по индукции БШ в зараженных клгтках могут быть хспользованы в разработках по борьбе с распространенн й болезнью з.тогі , вызываемой ВЯЛ. Кроме того, в последнее время растет число работ по использованию вируса ядерного полиэдроза в качестве эукариотического вектора для наработки в гусеницах шелкопряда ценных биотехнологических продуктов (интерферона, интерлекина и т.д.) и наши данные по действию ТШ на зараженные клетки следует учитывать в подобных исследованиях.
б.
Дубликации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, одна находится в печати. Результаты, изложенные в диссертации, обсуждались на рабочем совещании "Белки теплового шока" (Ленинград, 1987 г.), а также на межлабораторном научном проблемном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" ИОГен им. Н.И.Вавилова АН СССР.
Структура и объем работы. Работа состоит из введения, 4-х глав (литературный обзор, материалы и методы, результаты исследований и обсуждение результатов), выводов и списка литературы, состоящего из 166 наименований, содержит 106 страниц текста, J8 рисунков и одну таблицу.