Введение к работе
Актуальность темы. Повторяющиеся последовательности ДНК в геноме про- и эукариота создают основу для структурной изменчивости наследственного материала. Генетическая рекомбинация между повторами ДНК, расположенными в эктопической позиции, приводит к хромосомным перестройкам -делениям, транслокациям, инверсиям, дупликациям, и тем самым обеспечивает онтогенетическое и эволюционное преобразование генома. Поиск и изучение свойств "горячих точек" хромосомных аберраций представляется важным для понимания механизмов клеточной дифференциации и видообразования, прогнозирования и диагностики наследственных и раковых заболеваний.
"Горячие точки" возникновения делеций в геноме про- и эукариот характеризуются наличием инвертированных повторов (Erlich et al. 1989, Meuth, 1989). Свойство инвертированных повторов стимулировать делеций связывают с их способностью к комплементарному спариванию и формированию вторичной структуры типа "шпильки", репликативное проскальзывание по коротким прямым повторам в основании которой приводит к образованию делеций. У дрожжей длинные инвертированные повторы (ДИП) стимулируют не только делеций бактериального транспозона Тп5 (точное и неточное вырезание), но и митотическую гомологичную рекомбинацию, в последовательности, прилежащей к ДИП (Gordenin et al. 1993). Насыщенность генома высших эукариот повторяющимися последовательностями, значительная часть которых находится в инвертированной ориентации, делает изучение свойства ДИП индуцировать гомологичную рекомбинацию особенно важным для понимания механизмов инициации хромосомных перестроек . Мы предполагаем, что способность ДИП индуцировать эктопическую рекомбинацию в дрожжевом геноме может свидетельствовать о потенциальной структурной нестабильности участков генома высших эукариот, содержащих инвертированные повторы. Настоящая работа посвящена изучению влияния инвертированных повторов на эктопическую -межхромосомную и внутрихромосомную - рекомбинацию у дрожжей S. cerevisiae и определению структурных параметров рекомбиногенных инвертированных повторов.
Задачи работы. 1. Изучение влияния длинных инвертированных повторов транспозона Тп5 и инвертированных иЯАЗ-повторов на эктопическую - межхромосомную и внутрихромосомную - рекомбинацию у дрожжей S. cerevisiae.
-
Изучение влияния длины инвертированных повторов и спейсера между ними на способность инвертированных повторов стимулировать делеций и эктопическую рекомбинацию.
-
Изучение роли репликации в индукции делеций и эктопической рекомбинации длинными инвертированными повторами.
Научная новизна полученных результатов. При исследовании реком-бинационных свойств длинных инвертированных повторов в геноме дрожжей мы впервые показали:
1. Длинные инвертированные повторы стимулируют эктопическую - межхромо
сомную и внутрихромосомную - рекомбинацию. При этом происходит индукция
как конверсии, так и кроссинговера, приводящего к транслокациям и протя
женным делениям.
2, Индукция эктопической рекомбинации не зависит от последовательности
инвертированных повторов: инвертированные повторы, сконструированные из
последовательностей гена URA3, также как и инвертированные повторы транс-
позона Тп5 - "горячая точка" эктопической рекомбинации.
3. С уменьшением длины инвертированных повторов и с увеличением расстояния между ними уменьшается частота делеций инвертированных повторов и частота ДИП-индуцированной эктопической рекомбинации.
4. Ориджин репликации, помещенный между инвертированными повторами,
приводит к снижению частоты делеций инвертированных повторов и ДИП-
индуцированной рекомбинации, что свидетельствует в пользу решшкативного
механизма нестабильности инвертированных повторов.
Теоретическая и практическая ценность работы. Представленные в диссертационной работе результаты свидетельствуют о потенциальной нестабильности участков эукариотического генома, содержащих инвертированные повторы. Обнаруженные нами закономерности следует.учитывать при анализе структуры и эволюции геномов, содержащих большое число повторов; выявлении механизмов клеточной дифференциации; анализе наследственных и раковых заболеваний у человека, вызванных хромосомными аберрациями; конструировании рекомбинантных молекул и манипуляциях с искусственными хромосомами. Кроме того, полученные в нашей работе данные, свидетельствующие о взаимодействии участков ДНК, способных формировать вторичные, структуры, процессов репликации и рекомбинации в контроле стабильности дрожжевого генома могут быть использованы для построения реком'бийашюнных моделей и выяснения механизмов инициации рекомбинации в эукариотической клетке.
Материалы и экспериментальные данные, полученные в диссертационной работе, могут быть использованы для чтения лекций по курсам "Молекулярные механизмы рекомбинации" , "Структура и функция ДНК'', "Цитогенетика", "Мутационный процесс" на кафедре генетики и сатекции Санкт-Петербургского государственного университета и в других научных и образовательных институтах, изучающих проблему стабильности генома, молекулярные механизмы рекомбинации и репликации.
Апробация работы, Результаты работы были представлены на симпозиуме "Структура и функний клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 1993), 1 съезде Вавилонского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС) (Саратов, і994), конференциях "Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting" (Seattle, USA, 1994; Madison, USA, 1996), "Genetic Recombination and Genome Rearrangements" (Snowmass Village, USA, 1995), "Molecular Mechanisms in UNA Replication and Recombination" (Taos, USA, 1996), на семинарах лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ и лаборатории молекулярной генетики Национального шегитута здоровья окружающей среды (США).
Объем и структура диссертации-Диссертация изложена на 155 страницах и содержит 33 рисунка и 23 таблицы. Работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", выводов и списка литературы, содержащего !43 ссылки на научные публикации.