Содержание к диссертации
Введение
1 Список сокращений 5
2 Введение 7
3 Обзор литературы. Амилоиды и их взаимодействие
3.1 Определение термина «амилоид» 12
3.2 История формирования представлений об амилоидах
3.2.1 Описание заболеваний, связанных с амилоидами 12
3.2.2 Изучение структуры амилоидов 15
3.2.3 Определение состава амилоидов 16
3.3 Разнообразие амилоидов 18
3.3.1 Патологические амилоиды 18
3.3.2 Функциональные амилоиды 21
3.3.3 Прионы как подгруппа амилоидов
2.3.3.1 Прионы млекопитающих 24
2.3.3.2 Прионы грибов 27
2.3.3.2.1 Фактор [PSI+] 31
2.3.3.2.1 Фактор [PIN+] 33
3.4 Структура амилоидов 34
3.4.1 Особенности аминокислотной последовательности 34
3.4.2 Особенности пространственной структуры амилоидов
3.5 Взаимодействие амилоидов 41
3.6 Методы идентификации амилоидов
3.6.1 Биоинформатические методы 44
3.6.2 Биохимические методы 47
3.7 Заключение 49
4 Материалы и методы 51
4.1 Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования 51
4.2 Плазмиды 52
4.2.1 Плазмиды, полученные в данной работе 54
4.3 Генетические методы 65
4.4 Молекулярно-биологические методы 66
4.5 Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизация 68
4.6 Конфокальная микроскопия 69
4.7 Разработка алгоритма SARP для поиска последовательностей, богатых аспарагином и глутамином 70
4.8 Протеомный скрининг и идентификации амилоидов 70
4.8.1 Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке детергентами 71
4.8.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография, совмещенная с масс спектрометрией (HPLC-MALDI) 72
4.9 Предсказание -арок 73
4.10 Статистические методы 73
5. Результаты 74
5.1 Анализ амилоидогенных свойств вариантов N-терминального домена Sup35 с заменами глутамина на аспарагин и фенилаланин 74
5.1.1 Изучение способности вариантов N-терминального домена Sup35 агрегировать 74
5.1.2 Изучение способности вариантов N-домена Sup35 индуцировать прионизацию нативного белка Sup35 77
5.2 Изучение влияния аминокислотных замен в N-домене Sup35 на индукцию
амилоидогенеза других белков в протеоме дрожжей 80
5.2.1 Выявление потенциально амилоидогенных белков методом PSIA-HPLC MALDI 80
5.2.2 Разработка нового алгоритма поиска потенциально амилоидогенных белков in silico 82
5.3 Изучение амилоидных свойств белка Mad1 85
5.4 Влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию QN-богатого фрагмента белка Gln3 89
5.4.1 Изучение влияния [PIN+] и [PSI+] на агрегацию QN-богатого фрагмента белка Gln3 89
5.4.2 Анализ колокализации QN-богатого фрагмента белка Gln3 с белками Sup35 и Rnq1 93
6 Обсуждение 97
6.1 Влияние замен глутамина на аспарагин или фенилаланин в N терминальном домене белка Sup35 на его свойства 97
6.2 Влияние сверхпродукции N-домена Sup35 на индукцию амилоидогенеза других белков в дрожжевом протеоме 100
6.3 Белок Mad1 формирует амилоидоподобные олигомеры не зависимо от присутствия агрегатов N-терминального домена Sup35 102
6.4 Прионы [PSI+] и [PIN+] оказывают различное влияние на агрегацию QN богатого фрагмента белка Gln3 104
7 Заключение 107
8 Выводы 108
9 Список литературы 109
- Определение состава амилоидов
- Плазмиды, полученные в данной работе
- Изучение способности вариантов N-терминального домена Sup35 агрегировать
- Белок Mad1 формирует амилоидоподобные олигомеры не зависимо от присутствия агрегатов N-терминального домена Sup35
Введение к работе
Актуальность проблемы. Амилоиды представляют собой белковые фибриллы, стабилизированные кросс--слоями (по: Greenwald and Riek, 2010). Изначально формирование амилоидов связывали только с патологическими процессами (по: Нижников и др., 2015). К настоящему времени показано, что более 30 заболеваний человека, многие из которых неизлечимы, ассоциировано с образованием амилоидов (по: Sipe et al., 2014). Однако, сравнительно недавно было показано, что амилоидогенез связан не только с патологией, но и играет существенную роль в физиологических процессах у самых разных организмов (по: Нижников и др., 2015). Так, амилоиды необходимы для формирования биопленок у бактерий (Chapman, 2002) и архей (Chimileski et al., 2014), воздушных гифов у грибов (Wsten and Vocht de, 2000), запасания гормонов (Maji et al., 2009) и синтеза меланина (Fowler et al., 2006) у человека, а также вовлечены в еще целый ряд процессов. Стоит отметить, что список функциональных амилоидов продолжает постоянно расширяться.
Важным этапом в изучении амилоидов было открытие инфекционных амилоидов – прионов (Bolton et al., 1982), изначально выявленных у млекопитающих, но позже обнаруженных у одноклеточных грибов – дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Wickner, 1994). Последовательности подавляющего большинства дрожжевых прионных белков содержат участки, богатые аспарагином (N) и глутамином (Q). Показано, что эти участки необходимы для формирования амилоидных фибрилл и эволюционно консервативны (An et al., 2016; Toombs et al., 2010). Известно, что наличие амилоидных агрегатов одного белка может провоцировать агрегацию других белков, или иначе говоря, кросс-индукцию амилоидогенеза. Механизмы таких взаимодействий изучены недостаточно. Богатые аспарагином и глутамином участки белков также вовлечены в кросс-индукцию амилоидогенеза (Derkatch et al., 2001; Derkatch et al., 2004), однако влияние аминокислотного состава взаимодействующих белков на этот процесс неясно.
Настоящее диссертационное исследование посвящено изучению роли участков, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза на моделях прионного домена белка Sup35 (Ter-Avanesyan et al., 1994) и NQ-обогащенного участка транскрипционного фактора Gln3 (Alberti et al., 2009). Поскольку кросс-индукция амилоидогенеза зачастую связана с развитием патологий, исследование актуально как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения.
Степень разработанности темы. На текущий момент накоплен значительный объем данных о прионах дрожжей (по: Нижников и др., 2015), структуре амилоидов (по: Riek, 2016), роли богатых аспарагином и глутамином участков в амилоидогенезе (Derkatch et al., 2004; Toombs et al., 2010), а также о взаимодействии некоторых дрожжевых прионов (Derkatch et al., 2001). В то же время, роль аминокислотного состава белков в регуляции индукции амилоидогенеза на данный момент изучена недостаточно хорошо. Получение новых данных о влиянии богатых аспарагином и глутамином амилоидов на агрегацию других белков в масштабах всего протеома имеет фундаментальное и потенциально прикладное значение.
Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:
1. Провести сравнительный анализ амилоидогенных свойств нативного N-домена Sup35 и его модифицированных вариантов, у которых все глутаминовые остатки замещены на аспарагиновые или фенилаланиновые.
-
Выявить в протеоме дрожжей белки, агрегация которых индуцируется в присутствии нативного N-домена Sup35 и его модифицированного варианта, у которого все глутаминовые остатки замещены на аспарагиновые.
-
Охарактеризовать влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию богатого аспарагином и глутамином домена белка Gln3.
Научная новизна. В ходе данной работы впервые были изучены амилоидные свойства двух вариантов N-домена белка Sup35, у которых все остатки глутамина замещены на остатки аспарагина или фенилаланина. Также изучена способность этих вариантов индуцировать фактор [PSI+]. Показано влияние аминокислотного состава на взаимодействие амилоидогенных белков. Выявлен ряд белков, агрегация которых индуцируется сверхпродукцией нативного N-домена Sup35 и его модифицированного варианта, у которых все глутаминовые остатки замещены на аспарагиновые. Разработан новый алгоритм поиска последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, in silico. Охарактеризованы амилоидоподобные свойства олигомеров белка Mad1. Показано влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию богатого аспарагином и глутамином домена белка Gln3.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в ходе данной работы результаты вносят вклад в понимание механизмов индукции и регуляции амилоидогенеза. Впервые показано, что сходство аминокислотного состава амилоидогенных трактов влияет на кросс-индукцию амилоидогенеза. Установлено, что различие свойств аминокислотных остатков в составе амилоидогенных трактов препятствует взаимодействию белков. Показано, что замены глутамина на аспарагин усиливают способность прион-формирующего белка индуцировать агрегацию других белков. Выявление закономерностей, определяющих «каскады амилоидогенеза», в перспективе может иметь важное значение для разработки подходов к лечению амилоидных заболеваний.
Методология и методы исследования. В ходе выполнения работы были использованы стандартные генетические и молекулярно-биологические методы исследований. Был использован широкий ряд молекулярно-генетических методов (генно-инженерные методы клонирования генов и конструирования плазмид, полимеразная цепная реакция, трансформация дрожжевых и бактериальных клеток), методы лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, выделения белка, белкового электрофореза в полиакриламидном и агарозном геле, Вестерн-блот и ряд статистических методов. В исследовании был применен разработанный на кафедре генетики и селекции СПбГУ метод протеомного скрининга и идентификации амилоидов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, а также разработан и применен биоинформатический алгоритм для выявления участков белков, обогащенных аспарагином и глутамином.
Положения, выносимые на защиту. На основании экспериментов по замене аминокислотных остатков в прионном домене белка Sup35 мы показали, что сходство свойств аминокислотных остатков в составе взаимодействующих амилоидогенных последовательностей является важным фактором для кросс-индукции амилоидогенеза. Установлено, что замена глутамина на аспарагин в амилоидогенных трактах приводит к усилению способности этих последовательностей индуцировать амилоидогенез других белков. Разработанный нами биоинформатический алгоритм для выявления последовательностей, обогащённых амилоидогенными аминокислотами, существенно превосходит имеющиеся аналоги по скорости работы.
Степень достоверности и апробация результатов. Полученные в ходе данной работы результаты являются достоверными, что подтверждается их публикацией в 4
научных статьях в рецензируемых журналах и 6 тезисных сообщениях. Материалы работы были представлены на ряде Всероссийских и международных конференций: «Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 50-летию Вавиловского (ранее Всесоюзного) Общества генетиков и селекционеров», (2016, Москва, Российская Федерация); “International Symposium on Cognitive Sciences, Genomics and Bioinformatics” (CSGB 2016) (2016, Новосибирск, Российская Федерация); международный конгресс “Prion 2016” (2016, Токио, Япония); “27th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology” (2015, Левико-Терме, Италия); «VI Съезд Вавиловского Общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированных генетических симпозиумов» (2014, Ростов-на-Дону, Российская Федерация); “ The Ninth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology” (BGRS-2014) (2014, Новосибирск, Российская Федерация).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». В тексте представлено 27 рисунков и 8 таблиц. Список литературы содержит 283 источника.
Определение состава амилоидов
Амилоиды представляют собой белковые фибриллы, стабилизированные кросс--слоями (по: Greenwald and Riek, 2010). Изначально формирование амилоидов связывали только с патологическими процессами (по: Nizhnikov et al., 2015). К настоящему времени показано, что более 30 заболеваний человека, многие из которых неизлечимы, ассоциировано с образованием амилоидов (по: Sipe et al., 2014). Однако, сравнительно недавно было показано, что амилоидогенез связан не только с патологией, но и играет существенную роль в физиологических процессах у самых разных организмов (по: Nizhnikov et al., 2015). Так, амилоиды необходимы для формирования биопленок у бактерий (Chapman, 2002) и архей (Chimileski et al., 2014), воздушных гифов у грибов (Wsten and Vocht de, 2000), запасания гормонов (Maji et al., 2009) и синтеза меланина (Fowler et al., 2006) у человека, а также вовлечены в еще целый ряд процессов. Стоит отметить, что список функциональных амилоидов продолжает постоянно расширяться.
Важным этапом в изучении амилоидов было открытие инфекционных амилоидов – прионов (Bolton et al., 1982), изначально выявленных у млекопитающих, но позже обнаруженных у одноклеточных грибов – дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Wickner, 1994). Последовательности подавляющего большинства дрожжевых прионных белков содержат участки, богатые аспарагином (N) и глутамином (Q). Показано, что эти участки необходимы для формирования амилоидных фибрилл и эволюционно консервативны (An et al., 2016; Toombs et al., 2010). Известно, что наличие амилоидных агрегатов одного белка может провоцировать агрегации других белков, или иначе говоря провоцируют кросс-индукцию амилоидогенеза. Механизмы таких взаимодействий изучены недостаточно. Богатые аспарагином и глутамином участки белков также вовлечены в кросс-индукцию амилоидогенеза (Derkatch et al., 2001; Derkatch et al., 2004), однако влияние аминокислотного состава взаимодействующих белков на этот процесс не ясны.
Настоящее диссертационное исследование посвящено изучению роли участков, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза на моделях прионного домена белка Sup35 (Ter-Avanesyan et al., 1994) и NQ-обогащенного участка транскрипционного фактора Gln3 (Alberti et al., 2009). Поскольку кросс-индукция амилоидогенеза зачастую связана с развитием патологий, исследование актуально как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения.
Степень разработанности темы
На текущий момент накоплен значительный объем данных о прионах дрожжей (по: Nizhnikov et al., 2015), структуре амилоидов (по: Riek, 2016), роли богатых аспарагином и глутамином участков в амилоидогенезе (Derkatch et al., 2004; Toombs et al., 2010), а также о взаимодействии некоторых дрожжевых прионов (Derkatch et al., 2001). В то же время, роль аминокислотного состава белков в регуляции индукции амилоидогенеза на данный момент изучена недостаточно хорошо. Получение новых данных о влиянии богатых аспарагином и глутамином амилоидов на агрегацию других белков в масштабах всего протеома имеет фундаментальное и потенциально прикладное значение.
Цель и задачи исследования
Целью работы является изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи: 1. Провести сравнительный анализ амилоидогенных свойств нативного N-домена Sup35 и его модифицированных вариантов, у которых все глутаминовые остатки замещены на аспарагиновые или фенилаланиновые. 2. Выявить в протеоме дрожжей белки, агрегация которых индуцируется в присутствии нативного N-домена Sup35 и его модифицированного варианта, у которого все глутаминовые остатки замещены на аспарагиновые. 3. Охарактеризовать влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию богатого аспарагином и глутамином домена белка Gln3.
В ходе данной работы впервые были изучены амилоидные свойства двух вариантов N-домена белка Sup35, у которых все остатки глутамина замещены на остатки аспарагина или фенилаланина. Также изучена способность этих вариантов индуцировать фактор [PSI+]. Показано влияние аминокислотного состава на взаимодействие амилоидогенных белков. Выявлен ряд белков, агрегация которых индуцируется сверхпродукцией нативного N-домена Sup35 и его модифицированного варианта, у которых все глутаминовые остатки замещены на аспарагиновые. Разработан новый алгоритм поиска последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, in silico. Охарактеризованы амилоидоподобные свойства олигомеров белка Mad1. Показано влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию богатого аспарагином и глутамином домена белка Gln3.
Плазмиды, полученные в данной работе
Первые упоминания о заболеваниях, связанных с амилоидозами появились относительно давно, много раньше, чем было возможно открытие самих амилоидов. Предположительно, первое описание органа, пораженного амилоидозом, было сделано еще в 1639 году в книге Николао Фонтано (Fonteyn, 1639; по: Kyle, 2001). В книге рассказывается о сильно видоизмененной селезенке, содержащей белые включения. Позднее сходное описание селезенки было дано Томасом Бартолином (Bartholin, 1641; по: Kyle, 2001). В 1789 Антуан Порталь первым сообщил об амилоидозе печени (по: Kyle, 2001). Позднее, в 1842, Карл фон Рокитанский дал подробное описание «восковой» печени – накопления серой желеподобной субстанции в результате сифилиса, туберкулеза или отравления ртутью (Rokitansky von, 1842).
Помимо описаний поражения внутренних органов, задолго до открытия амилоидов, были описан и важный класс нейродегенеративных инфекционных амилоидозов, впоследствии получивших название прионных болезней. Первая достоверная работа, содержавшая описание прионной болезни овец («скрепи» или «почесуха»), найденная Куртом Шнайдером, датирована 1772 годом (Comber, 1772; по: Schneider et al., 2008). В ней говорится, что почесуха была известна в Англии на протяжении 40 лет, однако работы 1732 года, содержащей описание болезни, найдено не было. Кроме того, высказывались предположения, что временем описания этой болезни следует считать XV или XVII вв. (по: Brown, 2005; Gajdusek and Gibbs, 1976). Ридом Викнером была высказана гипотеза, что почесуха была известна еще в древнем Китае более двух тысяч лет назад (Wickner, 2005), однако это предположение было подвергнуто критике китайскими исследователями (Li and Xing, 2006; Zhang, 2006). Таким образом, единственным достоверно известным описанием почесухи овец остается 1772 год. Важно отметить, что сходные нейродегенеративные амилоидозы человека, такие как «куру» были описаны много позже, только в XX веке (Gajdusek and Zigas, 1959).
Одним из важнейших событий в истории изучения амилоидов является открытие, сделанное в 1859 году Рудольфом Вирховым. Он показал, что corpora amylacea, субстанция из пораженного отдела мозга, сходная с описанной фон Рокитанским, окрашивается йодом и серной кислотой (по: Aterman, 1976). Этот метод был разработан в 1814 году для окраски целлюлозы(по: Aterman, 1976; Colin and Claubry, 1814). Вирхов предполагал, что субстанция является крахмалом, и предложил название амилоид. Это название было первоначально введено Маттиасом Шлейденом в 1838 году для обозначения конгломератов крахмала в растительных клетках и являлось производным от латинского amylum и греческого amylon (по: Aterman, 1976; Schleiden, 1838). Стоит отметить, что уже 1859 Карл Фридрих и Август Кекуле показали, что амилоиды состоят скорее из белка, чем из углеводов (по: Sipe and Cohen, 2000).
Следующим шагом в улучшении диагностики амилоидов была разработка более надежного теста. В 1875 году Корнил в Париже (Cornil, 1875), Хешль в Вене (Heschl, 1875) и Юргенс в Берлине (Jurgens, 1875) одновременно обнаружили изменение цвета при окраске амилоидов некоторыми анилиновым красителями, такими как метиленовый фиолетовый.
В XX веке Беннхольд обнаружил, что амилоиды сильно связываются с красителем для хлопка Конго красным (Bennhold, 1922), который использовался в промышленности с 1884 года (по: Steensma, 2001). Связывание было настолько сильным, что были предложены методы диагностики амилоидов, основанные на этом. Пациентам вводили в кровь Конго красный и оценивали уменьшение концентрации красителя в плазме крови (Ouchi et al., 1976). Механизм связывания остается до сих пор неизвестным, однако он приводит к появлению двойного лучепреломления яблочно-зеленого цвета (Divry and Florkin, 1927). Это явление до сих пор остается одним из основных критериев при доказательстве амилоидной структуры (по: Nizhnikov et al., 2015).
Другой важной группой специфичных красителей является флуоресцентные тиофлавин-Т (по: Hobbs and Morgan, 1963; Naiki et al., 1989; Vassar and Culling, 1959) и –S (Schwarz, 1967). При связывании тиофлавина-S с амилоидами происходит усиление флуоресценции. Однако этот краситель имеет достаточно высокий уровень фоновой флуоресценции, что ограничивает его применение только гистологическими исследованиями. У тиофлавина-Т при связывании с амилоидами происходит сдвиг спектра флуоресценции в красную область. Именно тиофлавин-Т, наряду с Конго красным, используются сейчас для оценки динамики образования амилоидных фибрилл in vitro (Klunk et al., 1989; LeVine, 1999). Открытие красителей, специфично окрашивающих амилоиды, способствовало существенному расширению представлений об амилоидах. Многие методы окраски амилоидов используются до сих пор и являются «золотым стандартом» в диагностике амилоидозов.
Факт связывания различных амилоидов одними и тем же красителями говорит о наличии у них сходной структуры. Благодаря открытию двойного лучепреломления при связывании амилоидов с Конго красным (Divry and Florkin, 1927; по: Sipe and Cohen, 2000), стало понятно, что амилоиды имеют упорядоченную ультраструктуру, а не представляют из себя аморфные белковые агрегаты. Тем не менее, только с появлением электронной микроскопии стало возможным изучать тонкую структуру амилоидов.
Первые работы по структуре амилоидов с применением электронной микроскопии появились в 1959 году. На основе изучения гистологических препаратов различных тканей, Коэн и Калкинс показали, что все амилоидные включения имеют фибриллярную структуру (Cohen and Calkins, 1959). Позже была выработана единая модель амилоидного филамента, состоящего из нескольких тяжей – протофиламентов. Эти протофиламенты соединятся между собой вдоль латеральной оси. Филаменты в свою очередь, взаимодействуя между собой, образуют фибриллу (Shirahama and Cohen, 1967).
Развитие методов очистки амилоидов и работы с ними in vitro способствовало дальнейшему прогрессу в изучении структуры амилоидов. Было открыто, что после выделения из тканей и очистки амилоиды сохраняют свою фибриллярную структуру (Pras et al., 1968). Позднее методом дифракции рентгеновских лучей было показано наличие кросс-бета структуры у всех известных амилоидов (Bonar et al., 1969; Eanes and Glenner, 1968; Glenner et al., 1974; по: Sunde and Blake, 1998).
Существенным препятствием для изучения структуры амилоидов стала их неспособность к формированию кристаллов и плохая растворимость. Из-за этих свойств к амилоидам были неприменимы методы рентгеновской кристаллографии и ядерного магнитного резонанса (по: Tycko and Wickner, 2013). В то же время это не мешало использовать метод криоэлектронной микроскопии, с помощью которой была показана закрученность протофиламентов относительно оси фибриллы и вариабельность в количестве протофиламентов, образующих фибриллу (Goldsbury et al., 2000a; Goldsbury et al., 2000b; Jimenez et al., 2002).
Серьезный сдвиг в исследовании структуры амилоидов произошел после внедрения метода твердофазного ядерного магнитного резонанса. Метод позволил расшифровать структуру ряда амилоидов, хотя в большинстве случаев были получены модели только фрагментов белков (Benzinger et al., 1998; Lansbury et al., 1995; Melckebeke Van et al., 2010; Paravastu et al., 2008; Petkova et al., 2006).
Таким образом, изучение структуры амилоидов прошло долгий путь от предположений о наличии упорядоченной структуры до детальных моделей организации амилоидных фибрилл. Вместе с тем, остается нерешенным целый ряд проблем. В частности, до сих пор не существует методики расшифровки амилоидной структуры, сформированной большими белками, а не короткими пептидами. Также остается неясным, насколько точно полученные in vitro модели соответствуют структурам, формируемым в живых организмах.
Изучение способности вариантов N-терминального домена Sup35 агрегировать
Хотя общие принципы организации амилоидной фибриллы были описаны еще в первой половине XX века, определение точной структуры амилоидных фибрилл оказалось довольно сложной задачей. Одним из наиболее распространенных методов получения структур высокого разрешения является рентгеновская кристаллография, для которой необходимо получение кристаллов исследуемого белка. Однако, протяженные одномерные фибриллы очень плохо формируют трехмерные кристаллы (по: Greenwald and Riek, 2010). Проблему удалось частично решить с использованием коротких пептидов, которые способны формировать микрокристаллы со структурой, отражающей структуру фибрилл. В то же время, это не решает полностью проблему расшифровки структуры амилоидов, поскольку фибриллы, формируемые короткими пептидами, могут отличаться от того, что образуют полноразмерные белки, а микрокристаллы могут отличаться от фибрилл по структуре (Wel van der et al., 2007).
Другим активно используемым методом изучения структур амилоидов является твердотельный ядерный магнитный резонанс. Именно благодаря этому методу была получена модель в высоком разрешении фибриллы, сформированной прионным доменом HET-s (Wasmer et al., 2008; Wasmer et al., 2009).
Кросс--слои являются общим элементом структуры всех амилоидов. -слои объединяются между собой за счет наличия у каждого -слоя «сухих» и «мокрых» поверхностей (Nelson et al., 2005). В составе протофиламента слои расположены «сухая» к «сухой» поверхности и «мокрая» к «мокрой». Расстояние между соседними -слоями, обращенными друг к другу «мокрыми» поверхностями, составляет около 15 , и пространство между ними заполнено молекулами воды. Такая пара -слоев удерживается друг с другом за счет образования водородных связей. Расстояние между слоями, обращенными друг у другу «сухими» поверхностями существенно меньше – около 8,5 , и между ними отсутствуют молекулы воды. «Сухие» поверхности удерживаются вместе за счет ван-дер-Вальсовых взаимодействий. Из-за очень близкого расположения «сухих» поверхностей аминокислотные радикалы, расположенные друг напротив друга и смыкаются наподобие застежки «молния». Эта структура получила название «стерической молнии» (Nelson et al., 2005). Если каждая пара «сомкнутых» -цепей принадлежит одной молекуле белка, то такую стерическую молнию называют «-аркадой», а мотив -цепь-поворот--цепь – «-аркой» (по: Kajava et al., 2010). Таким образом, большинство структур амилоидных протофиламентов можно представить в виде комбинации -аркад.
Не смотря на сходство структуры, амилоидные фибриллы разных белков могут быть устроены по-разному (по: Riek, 2016). В некоторых случаях даже один белок или пептид может формировать несколько разных амилоидных структур. Разнообразие обеспечивается за счет варьирования структуры на разных уровнях организации. -цепи в составе -слоя могут располагаться параллельно и антипараллельно (по: Riek, 2016). Для ряда дрожжевых прионов показано наличие параллельных слоев (по: Wickner et al., 2010), в то же время некоторые фрагменты пептида бета-амилоида склонны формировать антипараллельные -слои (Colletier et al., 2011). Помимо этого, внутри самих -слоев -цепи могут располагаться с разным смещением друг относительно друга: «в регистре» (когда -цепи в составе одного -слоя точно выровнены друг относительно друга) и не в регистре (когда -цепи идут с некоторым смещением) (Colletier et al., 2011). Также, разные участки пептида или белка могут образовывать -цепи при индукции формирования кросс--слоев (Colletier et al., 2011). На уровне образования фибриллы протофиламенты могут быть расположены по-разному друг относительно друга.
Отдельно стоит отметить, что некоторые белки формируют амилоидные фибриллы, сильно отличающиеся по своей структуре от классической модели. К примеру, прионный домен HET-s формирует особую структуру – бета-соленоид (Wasmer et al., 2008; Wasmer et al., 2009). В бета-соленоиде каждая молекула формирует два спиральных витка с двумя парами -цепей. Таким образом, большое количество вариантов построения фибрилл порождает разнообразие амилоидных структур.
Все амилоиды имеют общую структуру, основанную на образовании кросс--слоев. В то же время, благодаря различным способам формирования этих -слоев, существует много вариаций амилоидных фибрилл.
Белок Mad1 формирует амилоидоподобные олигомеры не зависимо от присутствия агрегатов N-терминального домена Sup35
Важным свойством QN-богатых последовательностей является их способность к кросс-индукции агрегации, явлении, когда амилоидная форма одного белка может индуцировать агрегацию другого, как в случае [PIN+] и Sup35. Мы решили проверить, будут ли варианты N-домена Sup35 с заменами глутамина на аспарагин или фенилаланин индуцировать состояние [PSI+] у белка Sup35 дикого типа. С этой целью штамма GT159 [psi-][PIN+] трансформировали плазмидами pUCup-Sup35Nwt-YFP, pUCup-Sup35NN-YFP, pUCup-Sup35NF-YFP или pUCup-YFP (отрицательный контроль). Трансформанты пассировали на среде с концентрацией CuSO4 150 мкМ для сверхпродукции соответствующих белков. Затем дрожжи высевались серией последовательных десятикратных разведений на среду, не содержащую аденин, для селекции клонов, в которых произошла индукция фактора [PSI+]. В четырех повторностях было показано, что сверхпродукция белка Sup35NN-YFP приводила к появлению клонов c Ade+ фенотипом с большей частотой (р=0,043), чем в отрицательном контроле (Таблица 6). В то же время эта частота была меньше, чем на фоне сверхпродукции белка Sup35Nwt-YFP (Рисунок 16). Клоны, трансформированные плазмидой pUCup-Sup35NF-YFP,
Индукция Ade+ клонов в тестах на разведение после сверхпродукции разных вариантов N-домена Sup35 не отличались от отрицательного контроля.
Частота индукции фенотипа Ade+ в контроле и на фоне сверхпродукции Sup35Nwt-YFP, Sup35NN-YFP и Sup35NF-YFP Повторность, № YFP, [PIN+] Sup35Nwt-YFP, [PIN+] Sup35NN-YFP, [PIN+] Sup35NF-YFP, [PIN+] 1 0 0,697 0,00003 0 2 0 0,471 0,00003 0 3 0 0,632 0,00007 0 4 0 0,718 0,00006 0 Чтобы убедится, что при сверхпродукции Sup35NN-YFP происходит индукция именно фактора [PSI+], а не мутации в гене ADE1, мы проверили способность полученных клонов с фенотипом Ade+ терять этот фенотип после пассирования на среде с хлоридом гуанидина. Трансформантов штамма GT159 [psi-][PIN+], содержащие плазмиды pUCup-Sup35Nwt-YFP, pUCup-Sup35NN-YFP, pUCup-Sup35NF-YFP или pUCup-YFP пассировали на среде с концентрацией CuSO4 150 мкМ. Затем дрожжи переносили на среду без аденина с помощью метода отпечатков. Каждый полученный от независимого трансформанта клон с фенотипом Ade+ был проверен на способность стабильно поддерживать этот фенотип в ряду клеточных делений на полной среде YPD. Каждый клон, стабильно поддерживающий статус Ade+ пассировали на среде с хлоридом гуанидина (Таблица 7). Клоны с фенотипом Ade+, полученные при сверхпродукции Sup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP, теряли этот фенотип при пассировании на среде с хлоридом гуанидина (Таблица 7). Таблица 7. Изгнание фенотипа Ade+ при пассировании на среде с хлоридом гуанидина (GuHCl) Отобранные Ade+ Стабильные Ade+ Стабильные Ade+, которые лечатся GuHCl Sup35Nwt-YFP [PIN+] 18 17 17 Sup35NN-YFP [PIN+] 17 16 12 Таким образом, N-домен Sup35 с заменами глутамина на фенилаланин неспособен индуцировать прион [PSI+] у нативного Sup35, а вариант с заменами на аспарагин индуцирует [PSI+], хотя и менее эффективно, чем Sup35Nwt.
Выявление потенциально амилоидогенных белков методом PSIA-HPLC-MALDI Сверхпродукция амилоидогенных белков с последовательностями, богатыми аспарагином и глутамином, может вызывать агрегацию других белков с такими участками. Например, ранее в лаборатории М.Д. Тер-Аванесяна было показано, что сверхпродукция в дрожжах S. cerevisiae фрагмента белка хантингтина, содержащего протяженный полиглутаминовый участок, вызывала агрегацию ряда дрожжевых белков с QN-богатыми участками (Nizhnikov et al., 2014). Мы решили проверить, не вызывает ли сверхпродукция Sup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP сходного эффекта. Были взяты варианты N-домена Sup35Nwt и Sup35NN, так как они взаимодействуют с двумя дрожжевыми NQ-богатыми прионами. Rnq1 в прионной форме индуцирует их агрегацию, а агрегация Sup35Nwt-YFP и Sup35NN-YFP, в свою очередь, индуцирует переход белка Sup35 в прионное состояние. Для идентификации белков, которые могут формировать детергент-устойчивые агрегаты, была использована модификация метода PSIA, в котором для разделения и идентификации белков применялась жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией (HPLC-MALDI) (Antonets et al., 2016; Nizhnikov et al., 2014). Этот метод базируется на универсальном свойстве амилоидных агрегатов – их устойчивости к обработке детергентами. При обработке тотального лизата детергентами, такими как додецил-сульфат натрия большинство белковых комплексов разрушается до мономеров и остается в надосадочной фракции, тогда как устойчивые крупные агрегаты выявляются в осадке. Так можно получить фракцию, обогащенную амилоидными белками, которые затем идентифицируются с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией (HPLC-MALDI).
Для анализа использовали штамм GT159 [psi-][PIN+], который трансформировали плазмидами pUCup-Sup35Nwt-YFP и pUCup-Sup35NN-YFP. В трансформантах с помощью метода PSIA-HPLC-MALDI были идентифицированы 5 белков, которые не были выявлены в контроле (штамм GT159 [psi-][PIN+], трансформированный плазмидой pU-CUP1-YFP) (Таблица 8). В каждом случае анализ проводили в двух повторностях. Примечательно, что почти все идентифицированные белки, за исключением одного, были выявлены только в клонах, продуцировавших Sup35NN-YFP, но не Sup35Nwt-YFP.