Введение к работе
Актуальность проблемы. "Незаконная" или негомологичная рекомбинация является одним из видов генетической рекомбинации. Как и все рекомбинационнке события, "незаконная" рекомбинация вызывает разного рода нестабильность в генно-инженерных конструкциях. Ввиду многообразия форм и шханизиов саа процесс "незаконной" рекомбинации изучен в недостаточной степени. Исследования "незаконной" рекомбинации в клетках Bacillus subtilts обусловлены евдЗ и тем, что сенная палочка всё шире используется в генетических работах, так как обладает рядом преимуществ (отсутствие патогенности, широкое пришиение в биотехнологии и др.) по сравнению с такий традиционно объектом, каким является Escherichia coll.
При изучении механизмов негоыологичиоя рекомбинации у R subtil is до сих пор остаётся открытым вопрос о влиянии длины участков гомологии на соотнопение систеи гомологичной и "нега* конной" рекомбинации, не установлен нимшй предел гомологии, кебходимый для работы RecE белка;
С другой стороны, некоторые события "незаконной" рекомбинации у В.subtilts,. видимо, вызваны ошибками функции белков, вносящих в молекулы ДНК одно-и двунитевыз разрызы (Bashkirov ot al., 1937,1988; Peijnenburg et al.. 1988). К таким белкам относится и ДНК-гираза В.subtilts. Однако до сих пор ничего не известно о характере взаимодействия этого фермента с молекулами ДНК, о степени его сайт-специфичности по сравнение с аналогичным энзимом из Е.СОІ1. Нэ изучался и вопрос участия ДНК-гираэы Rsubtilis в процессе "незаконной" рекоьйинации.
Дели и задачи исследования. Целью работы было изучение некоторых аспектов "незаконной" рекомбинации у В.subtilts. В сея-.
- г -
зи с этим в работе решались следующие задачи:
-
создание удобной системы, позволяющей изучить, как влияет длина участков гомологии на соотношение процессов гомологичной и негомологичной рекомбинации в клетках B.subtllis;
-
определение минимально;, длины участка гомологии, необходимой для работы RecE белка;
-
изучение степени сайт-специфичности ДНК-гиразы В.subtllls;
-
оценка вклада ДНК-гиразы В.subtllls в процесс "незаконной" игж&юлекулярной рекомбинации.
Научная новизна Установлена зависимость частоты рекомбинации от длины участков гошлогии при интеграции плазмиды в хромосому В. subtil is. Впервые определена усредненная последовательность сайта разрезания ДНК-гиразы В. subtil is. Показано, что сусествует некоторые отличия в сайтах разрезания ДНК-гираз Rsubtllis и Е.СОІ1. Обнаружено, что координаты некоторых сайтов ДНК-гиразы Rsubtilis in vivo совпадают с сайтами "незаконной" кеЕлэлзкуляркой рекомбинации.
Практическая ценность. Создана тест-система для изучения рекоибинацкониых процессов у В. subtil is. Показана роль ДНК-ги-рьаы Rsubtllis в процессе "незаконной" межмолекулярной рекомбинации, что позволяет понять некоторые случаи нестабильности генно-юшгнерных конструкций в клетках В. subtllls.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуж
дены на конференции молодых ученых ИОГен АН СССР (1990), на VII
Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических про-
цессов" (Москва, 1.990), втором международном семинаре "Gene
manipulations in Bacilli" (Holzhau, ГДР,1990), межлабораторном
семинаре "йэлекулярные и клеточные механизмы генетических про
цессов" ИОГен АН СССР (1991). ' ' "
Публикации. Во материалам диссертации опубликовано 6 работ.
-з-.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 97 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, быеодов и списка литературы. В работе 20 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемой литературы включает 116 наименований.