Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время одной из главных задач молекулярной генетики растений является изучение механизмов активации генов стрессового ответа высших растений. Непосредственно в процессе такого изучения возникает проблема адекватного моделирования стрессового ответа растений. Наряду с различными химическими активаторами стрессового ответа большой интерес представляет нетрадиционный способ активации генов стрессового ответа, заключающийся в индукции экспрессии в растениях бактериальных генов, родственных стрессс-генам растений. К числу таких генов относятся гены, кодирующие li-1,4 гликозидазу и /5—1.3 глюканазу. Показано, что в растениях при стресс-ответе в результате атаки патогена ( вирусного, грибного или растительного) происходит значительное увеличение экспрессии генов, кодирующих ферменты с ферментативной активностьи гликозидаз и глвжаназ. В соответствии с этим большой интерес представляет работа по получению трансгенных растений с эффективно экспрессируищимися генами генами ^-гликозидаз и а -глвконаз гетерологичной природы.
В качестве объектов для переноса в растения большой интерес представляют гены Р-1,4 гликозидазы и р- 1,3 глюканазы из термофильной бактерии Clostridium theriocelluu. Существенной особенностью этих двух бактериальных генов является высокая терыостабильность соответствующих ферментов, что позволяет легко отличить их активность от активности нетермостабильных гликозидаз и глюканаз в трансгенных растениях.
Цель и конкретные задачи исследования. В свзи с вышесказанным представляется актуальной работа по получению трансгенных растений с экспрессируищимися генами р-гликозидазы и р-глюканазы. Задача настоящей диссертационной работы
заключалась в модификации выбранных генов bgl и eel, конструированию векторных плазмид для экспрессии гликозидазы и глюканазы в E.coli а также в сравнительном анализе характеристик ферментов, синтезируемых в E.coli и растении N.tabacum.
Научная новизна и практическая значимость работы. Получены экспрессионные векторные плазмиды с модифицированными копиями генов (3 -гликозидазы и З-глкжаназы ранее клонированных из С.. thermocellum. Проведено изучение экспрессии клонированных генов в клетках E.coli. где в случае (Ь-гликозидазы синтезировался полноразмерный белок а в случае fi-глюканазы - гибридный белок LacZ'-'Cel. Получены характеристики термостабильностей бактериальных ферментов и проведено сравнение аналогичных параметров с глюканазами и гликозидазами N.tabacum.
Полученные рекомбинантные плазмиды могут быть непосредственно использованы в дальнейшей работе по получению трансгенных растений. Полученные результаты по экспрессии гетерологичных генов bgl и eel, а такие полученные в работе делеционные варианты N-концевой части гена eel могут быть использованы для изучения синтеза и функционирования белков целлолитического комплекса _С_. Иіегшосеїїиш.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы. Результаты исследования докладывались на 15 -ом ежегодном симпозиуме ЕМВО (FRG, 1989), на Международном симпозиуме по биотехнологии растений (Женева, 1991) и на Юбилейном симпозиуме Индийского общества генетиков (Индия,1991).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего цитируемых работ. Работа изложена на страницах машинописного текста и содеряит рисунков и таблиц.