Введение к работе
Актуальность темы. Производство биологических средств борьбы с насекомыми-вредителями является в настоящее время одним ив наиболее перспективных направлений биотехнологии. 95% всего объема выпускаемых в мире бактериальных биоинсектицидов созданы на основе различных штаммов Bacillus thuringiensis. Инсектицидные свойства В. thuringiensis определяются, в основном, присутствием параспоральных включений, состоящих из белковых эндотоксинов, способных к кристаллизации. Оснозными достоинствами биоинсектицидов в сравнении с традиционными химическими препаратами являются: высокая избирательность действия (эндотоксины активны только в отношении определенных видов насекомых и безвредны для растений или животных), экологическая безопасность производства и применения. Природное разнообразие эндотоксинов В. thuringiensis создает возможность их применения против широкого спеїстра насекомых-вредителей. В настоящее время создан ряд коммерческих препаратов ка основе различных природных штаммов В. thuringiensis. Однако, вследствие высокой себестоимости таких препаратов доля биоинсектицидов в общем объеме производства средств защиты растений остается незначительной. В связи с этим многие биотехнологические фирмы развивают новые направления в создании биологических пестицидов с использованием методов генетической инженерии. Одним из таких направлений является создание штаммов-продуцентов дельта-эндотоксинов В. thuringiensis на основе микроорганизмов, обладающих биотехнологическими преимуществами в срзвнении с природными штаммами В. thuringiensis.
В настоящей работе исследованы возможности экспрессии генов синтеза двух классов дельта-эндотоксинов с различной специфичностью инсектицидного действия (crylAa и crylVB) в облигатных ме-тилотрофных бактериях Methylobacillus flagellatum. Выбор данного объекта обусловлен следующими свойствами Ы. flagellatum непато-генность; способность расти на простых средах, используя относительно дешевые и доступные субстраты (метанол); рост при повышенной температуре культиЕирования; отсутствие фагов. Облигатная зависимость от присутствия метанола в среде исключает выливание клеток в неселективных условиях, что позволяет рассматривать эти бактерии в качестве экологически безопасных продуцентов.
Цель к задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение возможности экспрессии генов дельта-эндотоксинов с различной биологической специфичностью действия (СгуІАа активен в отношении отряда чешуекрылых насекомых, CrylVB - в отношении двукрылых) в облигатных метилотрофных бактерия* и оптимизация условий их экспрессии.
Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи:
-
Скрининг коллекции изолятов й. thuringiensis с целью поиска штаммов, наиболее активных в отношении представителей двукрылых насекомых. Изучение их физиологических, биохимических, серологических свойств.
-
Конструирование эффективной векторной системы широкого круга хозяев, позволяющей изучение ' экспрессии клонированных в ее составе генов в грамотрица ?льных микроорганизмах.
-
Изучение экспрессии гена сгуІАа В. thuringiensis ku'rstakl HD1 в составе сконструированных векторов широкого круга хозяев в различных грамотрицатедьных микроорганизмах.
-
Клонирование гена москитоцидного эндотоксина В. thuringiensis lsraelensis штамма 1-5, продукт которого токсичен для личинок комаров Aedes и Anopheles,
5. Определение нуклеотидной последовательности клонированного гена, сравнительный анализ с нуклеотидныш последовательностями ранее клонированных генов других штаммов В. thuringiensis. israelensis со сходным спектром инсектицидного действия.
-
Клонирование гена москитоцидного дельта-эндотоксина в составе векторов широкого круга хозяев и изучение его экспрессии в клетках Escherichia col і и метилотрофных бактерий М. flage 1 latum,
-
Разработка эффективной системы экспрессии гена москитоцидного эндотоксина в метилотрофных микроорганизмах с использованием регуляторных областей гесА гена М. flagellation.
Научная новизна и практическая значимость работы. Проведен скрининг коллекции изолятов В. thuringiensis с целью поиска новых штаммов, наиболее активных в отношении личинок комаров различных видов. Отобрано 2 штамма, обладающих наибольшим токсическим эффектом на личинки комаров. Из одного из отобранных штаммов клони-
- 5 -рован ген дельта-эндотоксина, продукт которого токсичен для личинок комаров видов Anopheles stephensi и Aedes aegypti. Определена полная нуклеотидная последовательность структурной и прилегающих областей гена синтеза москитоцидного эндотоксина. Сравнение нук-леотидной последовательности [тонированного гена с ранее опубликованными последовательностями генов мооотгоцидных эндотоксинов В. thuringiensis позволило отнести клонированный ген к CrylVB классу. Выявлены нуклеотидные замены, приводяидае к отличию первичной структуры белка в сравнении с другими белками CrylVB класса. Для изучения экспрессии генов эндотоксинов в грамотрица-тельных хозяевах сконструирована серия векторов широкого крута хозяев различного функционального назначения, позволяющих: 1) PNGM130, pNGM131, pNGMlSOK, pNGM131K- вести прямой визуальный отбор рекомбинантов на индикаторных средах; 2) pNGM130rec - получать высокую продукцию интересующего белка в клетках облигатных метилотрофных бактерий М. riagellatum. В составе вектора pNGMlSOK клонированы гены энодоксинов В. thuringiensis crylAa и crylVB с различной инсектицидной специфичностью действия. Изучена экспрессия генов в клетках Е. сої і и М. riagellatum. Максимальная продукция CrylAa белка в клетках E.coli и М. flagel 1 atum получена при экспрессии гена cryІАа в составе единой рамки считывания с N-концевой частью гена В-галактозилазы. Максимальная продукция CrylVB белка в клетках М. riagellatum выявлена при экспрессии гена под контролем промотора гена гесА М. riagellatum в составе единой рамки считывания с N-концевой частью гена гесА. Наблюдаемая продукция CrylVB белка в клетках М. riagellatum позволяет рассматривать сконструированный штамм М. flagellatum в качестве перспективного для биотехнологии продуцента москитоцидного эндотоксина. Впервые определен спектр инсектицидного действия индивидуального CrylVB белка на личинках комаров 7 видов. Показано, что видом, наиболее чувствительным к воздействию CrylVB белка, является A. stephensi.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разде^ лов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждения, выводы, список литературы (128 наименований). Содержит 18 рисунков и И таблиц. Обьем работы. 113 сгр.