Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Этиология и патогенез язвенной болезни 15
1.2. Генетические основы язвенной болезни
1.2.1. Гены цитокинов и их рецепторов 26
1.2.2. Гены матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов 34
1.2.3. Гены, кодирующие ферменты пищеварения 38
1.3. Факторы патогенности и вирулентности Helicobacter pylori и их
роль в развитии хеликобактер-ассоциированной гастродуоденальной
патологии 41
Глава 2. Материалы и методы исследования 47
2.1. Материалы исследования 48
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение геномной ДНК 47
2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 49
2.2.3. Рестрикционный анализ 50
2.2.4. Метод электрофореза 51
2.2.5. Статистическая обработка полученных результатов 51 3.
Глава 3. Результаты и обсуждение 5 9
3.1.Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов цитокинов с язвенной болезнью в Республике Башкортостан 59
3.1.1. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов семейства IL1 и VNTR-полиморфизма (rs71941886) гена IL1RN с ЯБ 59
3.1.2. Анализ ассоциации полиморфного варианта rs1800629 гена TNFA с ЯБ 71
3.1.3. Анализ ассоциаций полиморфного варианта rs1800795 гена IL
3 6 с ЯБ 74 89
3.1.4. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов IL-8 и генов IL-8RA с ЯБ
3.1.5. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена IL-10 с ЯБ
3.2. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов матриксных
металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов вариантов генов с ЯБ в Республике Башкортостан
3.2.1. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов MMP-1 с ЯБ
3.2.2. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов MMP-2 и MMP-3 с ЯБ 105
3.2.3. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов MMP-9 и ММP-12 с ЯБ
3.2.4. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов ТIMP-2 и ТIMP-3 с ЯБ
3.3. Анализ ассоциации инсерционно-делеционного полиморфизма гена PGC с ЯБ 128
3.4. Мета-анализ исследованных полиморфных вариантов 132
3.5.Анализ межгенных взаимодействий в формировании
наследственной предрасположенности к развитию язвенной болезни .
Заключение
Выводы .
Список литературы
- Гены цитокинов и их рецепторов
- Выделение геномной ДНК
- Анализ ассоциации полиморфного варианта rs1800629 гена TNFA с ЯБ
- Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов IL-8 и генов IL-8RA с ЯБ
Гены цитокинов и их рецепторов
Язвенная болезнь – это хроническое рецидивирующее заболевание, протекающее с чередованием периодов обострения и ремиссии, при котором в результате нарушения нервных и гуморальных механизмов, регулирующих секреторно-трофические процессы, под воздействием соляной кислоты и пепсина в желудке и двенадцатиперстной кишке образуются язвы (Бебурешвили и др., 2007).
Язвенной болезнью страдает огромное число людей. К примеру, в благополучной Европе число язвенников составляет 2—3% населения (Жерлов и др., 2003). В России распространенность данной патологии среди всего населения составляет около 12 % (Маев и др, 2011). Результаты патологоанатомических исследований дают более высокие цифры (28 %), что может свидетельствовать о латентном течении заболевания у многих больных (Ивашкин и др., 2005, Маев и др., 2001). По данным ФГУ «ЦНИИОИЗ Минздравсоцразвития РФ» данной патологией в России страдают приблизительно 3 миллиона человек в 2011 году. Всего с диагнозом, установленном впервые в жизни, регистрируются больных: в Центральном Федеральном Округе – 89.5 на 100000 всего населения; Приволжском Федеральном Округе – 134 на 100000 всего населения (http://www.mednet.ru).
В США, по статистике, ежегодно регистрируются примерно от 500 до 800 тыс. новых случаев язвенной болезни (Kalyanakrishnan et al., 2007). Среди причин инвалидности заболевания желудочно-кишечного тракта занимают 5-е место (2,3% от первичной инвалидности), причем к стойкой утрате трудоспособности в 50,6% из них приводит язвенная болезнь (из них 2/3 после оперативного лечения) (Пустынкина и др., 2000). По мнению 4
Бебурешвили, язва двенадцатиперстной кишки у пациентов моложе 15 лет встречается редко, а язва желудка встречается даже у пятилетних детей. Возможно, язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки развивается только у тех пациентов, которые были инфицированы Helicobacter pylori в позднем детском или в зрелом возрасте, так как с этого времени количество обкладочных клеток не меняется (Бебурешвили и др., 2007). Schubert же считает, что ЯБДПК обычно диагностируется в молодом возрасте, у мужчин, и у пациентов с высокой секрецией соляной кислоты, а ЯБЖ чаще встречается у пожилых, не связан с гендерными различиями, у пациентов с нормальной или пониженной кислотной секрецией (Schubert et al., 2008).
За всю историю изучения язвенной болезни существовало достаточно много теорий её этиологии и патогенеза: воспалительная, гастритическая, пептическая, сосудистая, спастическая, инфекционная, механическая, нарушения вегетативной иннервации желудка, нейротрофическая, кортико-висцеральная, теория Селье о влиянии стресса. Однако большинство из них были умозрительными, объясняли какую-либо одну сторону механизма образования гастродуоденальных язв и в определённой мере отражали бессилие врачей и безрезультативность попыток лечения язвенной болезни различными методами (Бебурешвили и др., 2007).
Этиология ЯБ достаточно сложна и механизмы ее формирования на сегодняшний день до конца не ясны. К факторам риска развития ЯБ относят нейропсихические и алиментарные причины, прием нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), инфицирование бактерией Helicobacter pylori (H.pylori), наследственную предрасположенность (Rosenstock et al., 2003; Castano-Rodrguez et al., 2013).
Для запуска механизма развития язвенной болезни должно включиться достаточное количество клинических и генетических факторов (Беликов и др.,2000). Однако, также различают язвенную болезнь, укладывающуюся в моногенный (чаще аутосомно-доминантный) тип наследования (Бабцева и 5 др.,2002). В последние годы доказана генетическая предрасположенность к патологическим изменениям протеолитических свойств желудочного сока у детей, родители которых страдают дуоденальной язвой. Установлено, что повышение содержания пепсиногена А в 3 раза увеличивает риск развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, в то время как повышение концентрации пепсиногена С — в 3 раза риск развития язвы желудка. Гиперпепсиногенемия А обнаруживается у 57% кровных родственников, у 50% больных дуоденальной язвой, наследуется по аутосомно-доминантному типу и в 8 раз повышает риск возникновения гиперпепсиногенемической формы язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (Белоусов и др., 2003).
Клинические проявления ЯБ бывают разными. У некоторых пациентов ЯБДПК протекает бессимптомно. Исследование, проведенное в 2011 году в Тайване, показало, что распространенность бессимптомной ЯБДПК составляет 9.4%, и выявлено, что пациенты с низким уровнем образования имеют более высокий риск развития данной формы ЯБ. Это объясняется повышенным риском инфицирования H.Pylori среди менее образованных групп населения, что, вероятно, связано с низким уровнем гигиены. Тяжелый физический труд также могут быть важным этиологическим фактором риска развития ЯБДПК у людей с низким уровнем образования (Wang et al., 2011). Некоторые факторы образа жизни, такие как употребление табака, алкоголя, чая, кофе и пряных продуктов, как полагают, стимулируют секрецию желудочного сока, однако, результаты предыдущих перекрестных эпидемиологических исследований были противоречивыми. Курение увеличивает риск возникновения язвы двенадцатиперстной кишки и снижает эффективность лечения (Li et al., 2014; Kim et al., 2015), что связано со снижением секреции бикарбонатов поджелудочной железой и ускоренной эвакуацией желудочного содержимого, которые создают необходимые условия для инфицирования Helicobacter pylori. На секрецию соляной кислоты в желудке курение не влияет (Бебурешвили и др., 2007). Wang F. и его коллеги показали, что курение самостоятельно предсказывало развитие ЯБДПК у людей с бессимптомным течением болезни, что совпадает с ранее полученными в Японии результатами, где было обнаружено, что у курящих мужчин в возрасте от 45 лет и старше повышен риск развития ЯБЖ и ЯБДПК по сравнению с некурящими (Kato et al., 1992; Wang et al., 2011). Однако, эти исследования не соответствуют выводам Talamini G. и его коллег, которые не выявили статистически достоверных ассоциаций с риском развития ЯБ у курильщиков по сравнению с некурящими (Talamini et al., 2008). Норвежские ученые показали, что 58 из 104 (56%) всех пациентов с перфорированной язвенной болезнью (ПЯБ) были курильщиками. Примечательно, что в 2011 году количество ежедневных курильщиков в Норвегии уменьшилось на половину по сравнению с количеством курильщиков в 2001 году, и, следовательно, этот фактор резко снизился за десятилетие. Так как ПЯБ более распространена у пожилых людей, чем у молодежи, сокращение числа курильщиков среди населения должно повлиять на показатели распространенности ПЯБ в будущем (Thorsen et al., 2013).
Выделение геномной ДНК
ДНК выделяли из периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew C.C., 1984). Кровь набирали в пробирки с консервантом, в качестве которого использовался глюгицир в соотношении с кровью 1:4.
Для выделения ДНК к 5 мл крови добавляли 30 мл лизирующего буфера (320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl, pH 7,6) и центрифугировали при 40С и 4000 об./мин. в течение 20 минут. 9
Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 20 мл лизирующего буфера и центрифугировали при тех же условиях в течение 10 минут. К полученному осадку добавляли 800 мкл буфера Soline ЭДТА (25 мМ ЭДТА, рН 8,0, 75 мМ NaCl). Затем ресуспензировали полученный раствор и переносили его в двухмиллилитровые стерильные пластиковые пробирки, добавляли 80 мкл 10% SDS, 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубировали при 370С в течение 16 часов. Экстракцию ДНК проводили в три этапа: раствором забуференного фенола (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола – Трис-HCI, pH 7,8), смесью фенола – хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) в равных объемах (1000 мкл) с плавным перемешиванием на ротаторе в течение 10 мин., центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждали из раствора в стеклянных плоскодонных конических колбах объёмом 50 мл 96% раствором охлажденного этанола в соотношении 1:3. Сформированную ДНК промывали 70% раствором этилового спирта, подсушивали на воздухе, растворяли в деионизированной воде и хранили при -200С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Амплификацию изученных локусов проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе “Терцик” производства компании «ДНК-технология» (г. Москва) и Gene Amp 2700 (Applied Biosystems, США).
Перечень исследованных локусов, последовательности специфичных олигонуклеотидных праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов представлены в табл. 2. Для амплификации использовали реакционную смесь объёмом 25 мкл, которая содержала 2,5 мкл 10хTaq-буфера (67 мМ трис-HCl 0 (pH 8,8), 16,6 мМ (NH4)2 SO4,, 2,5мМ MgCl2, 0,01% Тween-20), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP по 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «Cилекс», г.Москва) и 5-10 пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Режим амплификации был следующим: предварительная денатурация (940С, 4 мин.), 27-30 циклов амплификации: денатурация – 940С, 45 сек.; отжиг – t0С, 45 сек.; синтез – 720С, 45 сек., завершающий синтез (720С, 7-10 мин.). В табл. 2 приведены индивидуально подобранные конкретные показатели температуры отжига для каждого из исследованных локусов.
Для определения нуклеотидных замен проводили гидролиз амплифицированных фрагментов соответствующей рестриктазой. Данные о рестрикционных локусах, названия рестриктаз и длины продуктов расщепления представлены в табл (табл.2). Рестрикцию полиморфных локусов rs494379 и rs1799750 гена ММР-1, полиморфного варианта гена ММР-2 (rs2285052), rs3025058 гена ММР-3, двух полиморфных вариантов гена ММР-9 (rs3918242, rs17576), rs2276109 гена ММР-12, полиморфных вариантов rs8179090 и rs9619311 генов TIMP-2 и TIMP-3 (481С Т, 857G A), проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции KpnI, BslI, Hinf I, PsyI (Tth111I), Sph I, Sma1, Pvu I I, Eco88I (AvaI), AluBI, соответственно, при температуре 37С согласно рекомендациям фирм-производителей.
Разделение фрагментов ДНК размером менее 600 п.о. после амплификации и рестрикции проводили при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном геле (ПААГ) (исходное соотношение акриламида и 1 метиленбисакриламида - 29:1). Электрофорез проводили в 1ХТБЕ буфере (0,089 М трис-НС1; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, рН=8,0) при напряжении 300В. Перед нанесением на гель пробы смешивали в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 15% фикола. Разделение фрагментов размером более 500 п.о. проводили в 2% агарозном геле. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Документирование результатов электрофореза проводили с использованием видеосистемы «Quantum».
Результаты электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов исследованных полиморфных ДНК-локусов показаны на рис. 1-12 при л.
Полиморфные локусы rs2227306 и rs2227307 гена IL8, rs2234671 гена IL8RA, rsl800896 гена IL10 изучали с помощью амплификации и флуоресцентной детекции с помощью амплификатора «CFX» (BioRad, США) и набора ООО «ТестГен» (г. Ульяновск, Россия). Наборы включают все реагенты, достаточные для постановления 400/600/1200 реакций амплификации в Юмкл реакционной смеси по одному локусу.
Анализ ассоциации полиморфного варианта rs1800629 гена TNFA с ЯБ
Частоты встречаемости аллелей и генотипов представлены в таблицах 9,10. Обнаружено, что аллель rs1800872 С изученного ДНК-локуса встречался в 58.33-74.51% хромосом у больных и 65.05-75.00% хромосом в контроле в трех исследуемых популяциях. Частота встречаемости генотипа С/С по распространенному аллелю составила 29.63-56.86% случаев – у пациентов с ЯБ, и 43.01-54.17% случаев у здоровых доноров. Гомозиготный по релевантному аллелю генотип rs1800872 А/А обнаруживался редко: от 4.08% в группе татар до 12.96% хромосом у башкир обеих исследуемых групп. На рисунке 9 показан сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов выявил, что гомозиготный генотип rs1800872 А/А является маркером пониженного риска развития ЯБ у татар (2=4.81; p=0.01; OR=0.28; 95%CI 0.08-0.92). Не было обнаружено статистически достоверных результатов сравнительного анализа распределения частот и генотипов полиморфизма rs1800872 в общей выборке для башкир и русских.
По литературным данным аллель rs1800872 А встречается с частотой 63.37-76.19% случаев – в популяции Азии, 23.96% случаев – у жителей Европы. Аллель rs1800872 С наоборот распространен у европейцев (76.04%), а у азиат встречается реже (23.81% и 36.63% случаев) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=1800872).
В отдельную группу были включены лица, страдающие язвой 12-перстной кишки без сочетания с ЯБЖ. При сравнении их с выборкой здоровых доноров, показано, что маркером пониженного риска развития язвы ДПК для татар является генотип А/А полиморфного варианта rs1800872, выявленный в 3.66% случаев у пациентов и 12.90% случаев – у индивидов контрольной группы (2=4.72; p=0.01; OR=0.25; 95%CI 0.06-0.94). Для пациентов с дуоденальной язвой башкирской и русской принадлежности не было обнаружено достоверно значимых различий в распределении частот генотипов и аллелей при сравнении со здоровой выборкой (p 0.05). Также в отдельную подгруппу были выделены пациенты, страдающие ЯБЖ и 1 ЯБДПК, у которых на момент забора материала было обнаружено инфицирование бактерией H.pylori.
При сравнении их с группой контроля было установлено, что гомозиготный генотип rs1800872 А/А также является маркером пониженного риска развития ЯБ в группе татарского этноса (2=4.14; p=0.02; OR=0.15; 95%CI 0.01-1.19). Сравнение распределения частот аллелей и генотипов описываемого ДНК-локуса между выборкой больных и здоровых доноров русских и башкир не выявило статистически значимых различий (p 0.05).
При изучении полиморфного локуса rs1800896 (рис.10) было обнаружено, что чаще встречался аллель A у больных татар и башкир (63.03% и 66.15% случаев, соответственно), тогда как у русских больных ЯБ достоверно чаще, чем в группе контроля встречался аллель rs1800896 G – 2=2.73; p=0.04; OR=1.39; 95%CI 0.94-2.05, а аллель rs1800896 А наоборот, является маркером пониженного риска развития патологии ЖКТ (2=2.73; p=0.04; OR=0.71; 95%CI 0.48-1.06). Также обнаружено, что для пациентов русской этнической принадлежности маркером пониженного риска развития является гомозиготный по протективному аллелю генотип rs1800896 А/А -2=4.19; p=0.02; OR=0.51; 95%CI 0.27-0.97.
В отдельную группу были включены лица, страдающие язвой ДПК без сочетания с ЯБЖ. При сравнении их с объединенной выборкой здоровых доноров, показано, что маркером пониженного риска развития язвы ДПК для татар является генотип А/А полиморфного варианта rs1800896, выявленный в 20.31% случаев у пациентов и 34.88% случаев – у индивидов контрольной группы (2=4.29; p=0.01; OR=0.47; 95%CI 0.23-0.96), тогда как гетерозиготный генотип rs1800896 А/G – является маркером повышенного риска развития дуоденальной язвы (2=2.81; p=0.04; OR=1.67; 95%CI 0.91-3.06).
Также в отдельную подгруппу были выделены пациенты, страдающие ЯБЖ и ЯБДПК, у которых на момент забора материала было обнаружено 2 инфицирование бактерией H.pylori. Сравнение распределения частот аллелей и генотипов описываемого ДНК-локуса между данной выборкой больных и выборкой здоровых доноров не выявило статистически значимых различий (р 0.05).
Анализ неравновесия по сцеплению сцеплению полиморфных локусов гена IL-10 в изученных нами выборках выявил сильное сцепление полиморфных вариантов rs1800872 и rs1800896 D =0,59 у татар; значительное сцепление в этнических группах русских и башкир (D =0,47 и D =0,38, соответственно) (рис.11). Изучение распределения частот гаплотипов показало достоверное снижение частоты гаплотипа rs1800872 А/rs1800896 А в группе больных ЯБ русской этнической принадлежности (12.5% против 24.0% в контроле; 2=3,28; p=0.03; OR=0.42; 95%CI 0.16-1.08). Также для русских показана тенденция увеличения частоты гаплотипа rs1800872 А/rs1800896 G в группе больных ЯБ (11,6% у больных ЯБ, 3.5% - в контроле) - 2=3,59; p=0.03; OR=3,61; 95%CI 0.89-14.62. (табл.13). Гаплотипичсекий анализ не выявил достоверно значимых различий в распределнии частот гаплотипов у татар и башкир (р 0.05).
Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов IL-8 и генов IL-8RA с ЯБ
В таблице (Табл. 14) представлены распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов rs3918242 (c.-1590C T), rs17576 (c.836 A G, p.Gln279Arg) гена ММP-9 среди больных ЯБ и здоровых доноров из РБ. Более распространенным оказался аллель rs17576 А полиморфного локуса rs17576 гена ММP-9, выявленный на 61.24-65.48% хромосом у пациентов в различных этнических группах и на 51.85-69.08% хромосом – в контроле. Среди генотипов, гомозиготный по распространенному аллелю генотип rs17576 А/А и гетерозиготный генотип rs17576 А/G полиморфного варианта rs17576 гена ММP-9 встречались с примерно одинаковой частотой, гомозиготный по редкому аллею генотип rs17576 G/G описываемого полиморфного варианта встречался с частотой 11.90-13.95% в группе больных и 15.46-22.22%- у здоровых индивидов без признаков патологии ЖКТ.
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов rs17576 (рис.17) гена ММP-9 показал, что у пациентов с ЯБ татарской этнической принадлежности по отношению к аналогичной группе лиц здоровых индивидов выявлена тенденция к снижению частоты аллеля rs17576 G (38.75% и 39.92%, соответственно) и, как следствие, тенденция к увеличению частоты аллеля rs17576 A (61.24% и 69.08%, соответственно) – p=0.05. Установлено, что у татар, чаще, чем в остальных этнических группах, встречается аллель rs17576 A гена ММP-9 (69.08%, 66.37%, 51.85%, соответственно). Для татар гомозиготный по частому аллелю генотип rs17576 A/А является маркером пониженного риска развития ЯБ, тогда как rs17576 A/G - маркером повышенного риска развития данной патологии (2=5.95, p=0.007; OR=0.49; 95%CI 0.29-0.84 и 2=7.20, p=0.003; OR=2.19; 95%CI 1.26-3.81, соответственно). 1
При сравнении лиц, страдающих ЯБДПК, с объединенной выборкой здоровых доноров, обнаружено, что генотип rs17576 A/G встречается с достоверно большей частотой у пациентов, чем у здоровых доноров (2=5.42, p=0.009; OR=1.57; 95%CI 1.08-2.27), тогда как гомозиготный генотип rs17576 A/А с приблизительно равной частотой (p=0.05).
Обнаружены ассоциации полиморфного варианта rs17576 гена ММP-9 с риском развития ЯБ на фоне инфицирования H. pylori. У представителей татарской этнической принадлежности выявлена взаимосвязь между наличием генотипа rs17576 A/G и риском развития исследуемой патологии (2=5.44, p=0.009; OR=2.23; 95%CI 1.18-4.21), тогда как частота встречаемости генотипа rs17576 A/А у татар, больных ЯБ на фоне инфекции, меньше чем в контроле (38.57% и 53.61%, соответственно; =3.10, р=0.03; OR=0.54; 95%С1 0.29-1.01).
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs17576 гена MMP9 в выборках больных ЯБ и индивидов контрольной группы у татар Наиболее распространенным аллелем полиморфного варианта rs3918242 гена ММP-9 оказался аллель rs3918242 С, который определялся у больных 2 различных этнических групп с частотой 88.79-91.66% и в контроле – с частотой 86.36-89.79%. Среди генотипов с большей частой выявлялся гомозиготный генотип rs3918242 С/С (больные – 77.59-83.33%, здоровые доноры – 73.48-82.14%), а гомозиготный по редкому аллею генотип rs3918242 Т/Т описываемого полиморфного локуса у пациентов нашей выборки не встречался, в группе здоровых индивидов выявлен с частотой менее 4%. Анализ распределения частот аллелей и генотипов данного ДНК-локуса не показал статистически достоверных различий между изученными выборками пациентов разных этнических групп с ЯБ и контроля (p 0.05).
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs2276109 (c.-124A G) гена ММP-12 среди пациентов больных ЯБ и индивидов без признаков ЖКТ- патологии показал, что частота встречаемости гомозиготного генотипа rs2276109 А/А варьирует от 79.59%-81.34% случаев в группе больных, и 74.74%-90.31% - в группе контроля, тогда как, гомозиготный по редкому аллелю генотип rs2276109 G/G описываемого полиморфного локуса определялся у пациентов и в группе здоровых индивидов с частотой менее 4% (Табл.14). При разделении групп испытуемых на подгруппы согласно этнической принадлежности не были выявлены ассоциации данного локуса с риском развития ЯБ (p 0.05). Также не обнаружено ассоциаций полиморфного варианта rs2276109 гена ММP-12 с риском развития ЯБДПК или с риском развития ЯБ на фоне инфицирования H. pylori.
Был проведен анализ неравновесия по сцеплению. При анализе неравновесия по сцеплению полиморфных локусов гена ММP-9 было обнаружено, что SNPs rs3918242 и rs17576 находятся в значительном сцеплении в общей выборке русских и в слабом сцеплении в общей выборке татар и башкир (рис 18). Не смотря на то, что было обнаружено значительное сцепление между аллелями rs17576 А/rs17576 G и rs3918242 С/ 3 rs3918242 Т гаплотипический анализ не обнаружил статистически достоверных различий в распределении частот гаплотипов полиморфных вариантов rs3918242 и rs17576 гена MMP9 в группах больных ЯБ и здоровых доноров у русских (табл.13).
В связи с тем, что гены ММР1, ММР12 и MMP3 находятся в одном кластере на хромосоме 11q22-q23, представлялось логичным провести анализ частот гаплотипов полиморфных локусов данных генов в изученных нами группах.
При анализе неравновесия по сцеплению полиморфных локусов генов MMP12c.-124A G (rs2276109), MMP1n.682+357A G) (rs494379), MMP1c.-1719delG (rs1799750) и MMP3g.13452_13453insA (rs3025058) выявлены значительные сцепления между полиморфными вариантами гена MMP1rs494379/MMP12rs2276109 (D =0,25) у татар и полиморфными вариантами гена MMP3rs2276109/MMP12rs2276109 у индивидов русской этнической принадлежности - D =0,33. На рисунке 19 показана структура LD между исследованными локусами в двух популяционных выборках татар и русских.