Введение к работе
Актуальность темы. Установлено, что повышенная чувствительность к возникновению и развитию опухолей определённого гистогенеза генетически детерминирована и передаётся по наследству. Опухоли различного происхождения отличаются друг от друга и от нормальных клеток генетически (мутациями определённых генов, хромосомными и геномными перестройками) и фенотипически, в частности, изменением спектра экспрессируемых антигенов. Развитие специфического иммунологического ответа организма на опухоль является одним из доказательств антигенного отличия опухоли от нормальной ткани и существования иммунологического контроля за опухолевым ростом. Параметры, характеризующие иммунологическую специфичность - это фенотипический признак, отражающий генетические и антигенные отличия опухолей друг от друга и от нормальных тканей. Кроме того, антигены, продуцируемые опухолевыми клетками в большем количестве, чем гомологичными нормальными клетками, используются как маркерные для диагностики опухолей. Это, в частности, эмбриоспецифиче-ские антигены (раково-эмбриональный антиген, ос-фетопрогеин и др.), а также антигены-маркеры, не относящиеся к эмбриоспецифическим (СА 15-3, СА 125, ТРА и др.) (Клиническая иммунология и аллергология, Т.2, 1990; Nonura et.al., 1992; Minamoto et.al., 1994; Haseman et.al., 1992; Yoong et.al., 1990 и др.). Однако одни и те же маркеры могут встречаться при опухолях разного гистогенеза, а также при некоторых неопухолевых заболеваниях, воспалительных процессах, при беременности, регенерации. Поэтому такие маркеры не пригодны для точной диагностики опухолей. Опухолевая ткань, как и нормальная, характеризуется ассоциацией антигенов, определяющих её индивидуальность (Красковский, 1990; 1994; 1996). К настоящему времени не удалось установить маркер, строго специфичный для опухоли определённого гистологического типа и локализации.
Комплекс белков, продуцируемый опухолевыми клетками, не только характеризует происхождение опухоли и является индуктором иммунного ответа, но также может рассматриваться как кейлон - тканеспецифический ингибитор клеточной пролиферации (Красковский, 1994). С помощью кейлонов поддерживается тканевый гомеостаз на местном уровне. Показано, что экстракты из опухолевых клеток и их оболочек обладают кейлонной активностью, введение этих экстрактов способствует торможению роста соответствующей опухоли (Романов и др., 1976; 1980; 1984; Городжа и др., 1981; Красковский и др., 1982). Однако наблюдаемый эффект в большинстве случаев временный, опухоль способна адаптироваться к росту в избытке кейлона. Иммуногенетическими исследованиями показано, что развитие резистентности опухолевых клеток к кейлону обусловлено эпигеномной изменчивостью и сопряжено с утратой или снижением концентрации некоторых опухолеспецифических антигенов на поверхности опухолевых клеток (Красковский, 1989). Нечувствительность опухолевых клеток к кейлонам также может быть обусловлена фиксированными на поверхности опухолевых клеток антителами (Красковский, 1994). Для понимания механизма этого явления важное
значение имеет дальнейшее выяснение характера вариации компонентов белковс структуры опухолевых клеток при их адаптации к кейлонам.
Наряду с определением изменений в сыворотке и тканевых жидкостях урові свободных, характеризующих специфичность опухоли антигенов представляет иі терес изучение изменений концентрации иммунных комплексов антиген - антит ло (ИК). Получены данные о роли ИК в подавлении иммунной реакции на onyxoj и в "ускользании" опухоли от иммунного контроля (Петров, 1987; Клиническ; иммунология и аллергология, 1990; Hellstrem et.al., 1985 и др.). Установлено, ч-по мере роста опухоли, при рецидиве удалённой опухоли количество ИК в сыв ротке возрастает и имеет прогностическое значение (Билынский и др., 198 Вельбри и др, 1984; Chester Samuel et.al., 1990; Dass et.al., 1992 и др.). Однако в р де работ не установлено связи между прогрессированием процесса и количестве ИК или такую связь наблюдали не всегда (Denaro et.al., 1985; Chester Kerry Begei 1984; Ghjsh, Roholt, 1984). Следовательно, концентрация ИК, как и отдельнь маркерных антигенов, не может служить надёжным показателем для диагностиі и прогнозирования опухолевого роста. Не установлена зависимость изменен! этих показателей от генетических особенностей организма и опухоли, генетич ских отличий между опухолями.
В работах Г.В.Красковского (1970; 1994) развито положение о том, что асе циация факторов - ИК + специфический для опухоли комплекс свободных антиг нов - является онкотолерогеном и патогенетическим признаком опухолевого рост При использовании изоантисыворотки против всего набора специфических д. асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) антигенов было показано, что в процес опухолевого роста количество ИК и опухолевых антигенов в сыворотке повышас ся (Красковский, Войтович, Мельнова, 1989).
Является актуальным дальнейшее изучение закономерностей противоопух левой иммунной реакции как способа поддержания генетического гомеостаза opt низма, особенностей её протекания при росте опухолей разных генотипов, исег дование иммуногенетических механизмов преодоления опухолью систем иммунн го и кейлонного контроля, выяснение патогенетической роли ИК опухолевый ант ген - противоопухолевое антитело, опухолевых антигенов, разработка методе пригодных для диагностики - определения типа опухоли и прогнозирования or холевого роста.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Представлю ные в диссертации материалы вошли в программу фундаментальных исследован "1.2.34.6. Генетические основы злокачественного роста" по теме "Изучение геї тических закономерностей изменчивости чувствительности опухолевых клеток кейлонам" (1987 - 1991 гг) и в программу "Изучение механизмов регуляции фуі ций организма человека и животных с целью разработки методов управления nf цессами жизнедеятельности" (Регуляция) по теме "Изучение иммуногенетическ закономерностей возникновения комплексов антиген-антитело в сыворотке м шей-опухоленосителей для разработки метода диагностики и прогнозирован опухолевого роста" (Регуляция 07) (1991 - 1995гг).
Цель и задачи исследования. Целью работы является установление зако-іомерностей экспрессии признаков, характеризующих наличие (или отсутствие) )пухолевого роста и иммунологический статус организма опухоленосителя концентрации в сыворотке и асцитической жидкости специфического для опухоли сомплекса свободных опухолевых антигенов, иммунных комплексов антиген - антитело, противоопухолевых антител) при росте опухолей разного генотипа в усло-іиях анергии (толерантности) и при удалении опухоли, изучение возможности ис-юльзования для распознавания признака опухолевого роста (диагностики опухо-іи) антисывороток, полученных у мышей после полного удаления опухолей, а так-ке установление особенностей фенотипических (структура белково - антигенного сомплекса) изменений опухолевых клеток при адаптации их к росту в избытке кей-юна.
Основные задачи исследования:
-
Исследовать специфичность ассоциации опухолевых антигенов, характер-іьіх для опухолей разного генотипа (асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) и гепато-ш 22а (ГЕП 22а)), в сыворотке и асцитической жидкости опухоленосителей и изменение уровня свободных опухолевых антигенов и иммунных комплексов в провесе опухолевого роста.
-
Охарактеризовать изменения антигенного спектра опухолевых клеток, іроисходящие при адаптации этих клеток к росту в избытке кейлона.
-
Изучить закономерности изменения концентрации и общего количества щухолеспецифических антигенов, противоопухолевых антител и ИК в сыворотке і асцитической жидкости мышей при росте опухолей разного генотипа в норме и в словиях иммунодепрессии и иммуностимуляции при введении противоопухоле-ых и иммуностимулирущих препаратов, при полном удалении опухоли и росте ецидива; исследовать состояние противоопухолевого иммунитета после удаления пухолей разного генотипа.
-
Установить специфичность сывороток, полученных при удалении опухо-ей разного генотипа и возможность с их помощью выявить гомологичный им пецифический для каждой опухоли комплекс свободных опухолевых антигенов в ыворотке опухоленосителей - признак, характеризующий наличие и тип опухоли.
Объект и предмет исследования. Объектом исследования являются зако-омерности экспрессии характеризующих генотип опухоли и иммунологический татус опухоленосителя признаков (специфический для опухоли комплекс свобод-ых антигенов, иммунный комплекс антиген - антитело, противоопухолевые анти-ела) при росте опухолей разного генотипа в условиях анергии в динамике, при оздействии иммуномодуляторов, и при удалении опухолей (отмена онкотолерант-ости); взаимодействие антител сывороток, полученных при полном удалении опу-олей разного генотипа с сыворотками носителей гомологичных и негомологич-ых им опухолей; структура белкового антигенного комплекса опухолевых клеток, цаптированных к росту в условиях избытка кейлонов. Для исследования исполь-эвали сыворотки и асцитические жидкости мышей, экстракты опухолевых клеток.
Гипотеза. Исследования, приведенные в диссертации, выполнены на осно генетической теории раковой анергии (Красковский Г.В., 1970, 1994-1996). Реш ние поставленных в диссертации задач построено на следующих гипотезах:
-
В связи с тем, что онкотолерогенная ассоциация (ИК + специфический д. опухоли комплекс антигенов) рассматривается как фактор, индуцирующий и по держивающий раковую анергию (онкотолерантность), предполагается, что при и менениях иммунологического статуса организма опухоленосителя, обусловлена иммуностимуляцией, иммунодепрессией или генотипом растущей опухоли, при к торых не происходит отмены онкотолерантности, онкотолерогенная ассоциаці будет присутствовать в сыворотках и асцитических жидкостях. При этом измен ние компонентов онкотолерогенной ассоциации, соответствующее характеру изм нения иммунологического статуса организма опухоленосителя и генотипа опухол будет носить количественный характер. Качественные изменения - исчезновені онкотолерогенной ассоциации - будут происходить только при качественном изм нении иммунологического статуса организма опухоленосителя: отмене онкотол рантности при полном удалении опухоли любого генотипа.
-
При специфичности для каждого генотипа опухоли ассоциированых с н< антигенов при проведении прямых и перекрёстных иммунологических реакций сі воротки (асцитической жидкости) носителей разных опухолей с антисывороткам содержащими полный набор антител против всего специфического комплекса с ответствующих каждой опухоли антигенов, уровень образующихся в результа прямой иммунологической реакции иммунных комплексов будет отличаться I уровня иммунных комплексов, образующихся при перекрёстных реакциях.
-
Адаптированные к росту в присутствии избытка кейлона опухолеві клетки (в отличие от чувствительных к кейлону - контрольных) не абсорбируй все антитела против комплекса антигенов клеток исходного чувствительного кейлону штамма опухоли. Предполагается, что это обусловлено утратой в процес адаптации некоторых антигенов и (или) снижением концентрации отдельных ант генов в адаптированных к росту в избытке кейлонов опухолевых клетках, ч' должно быть выявлено при электрофоретическом анализе их белкового спектра.
-
В связи с тем, что иммунологическая реакция на опухоль носит специф ческий характер и при полном удалении опухоли развивается противоопухолевь иммунитет, предполагается, что вырабатывающийся при этом набор противооп холевых антител может быть использован для иммунологической диагностиі опухолевого роста и типа опухоли.
Методология и методы проведенного исследования. При проведении р боты использованы следующие методы экспериментальных исследований: имм низация животных опухолевыми клетками и путём полного удаления растущі опухолей разных генотипов с целью получения противоопухолевых иммунных С1 вороток; абсорбирование иммунных сывороток опухолевыми клетками; определ ние количества опухолеспецифических антигенов и противоопухолевых антител сыворотке и тканевых жидкостях; осаждение ИК 3,5% ПЭГ 6000; гел
фильтрация; электрофорез; метод получения адаптированного к кейлону субштам-ла опухоли и др.
Научная новизна и значимость полученных результатов. Впервые прове-іен детальный анализ изменения в динамике количества опухолевых антигенов и циркулирующих ИК в сыворотке и асцитической жидкости животных при росте )пухолей разных генотипов. Показано, что в сыворотке и асцитической жидкости >пухоленосителей выявляется онкотолерогенная ассоциация: повышенное количе-:тво ИК и специфический для каждой опухоли набор свободных антигенов, коли-ієство которых возрастает по мере роста опухоли. Установлено, что генотип опу-соли в значительной мере определяет количественную вариацию этих показателей.
Введение различных препаратов, изменяющих функцию системы иммунологической реактивности (уретана, циклофосфана, иммуностимуляторов), изменяет :корость опухолевого роста и влияет на уровень компонентов онкотолерогенной іссоцпации. При полном хирургическом удалении опухолей из сыворотки исчеза-:т специфический комплекс свободных опухолевых антигенов, появляются проти-юопухолевые антитела, возникает противоопухолевая резистентность, прояв-іяющаяся в регрессии повторно привитых гомологичных опухолей.
Впервые установлена возможность выявления специфического для опухоли сомплекса антигенов в сыворотке опухоленосителей с помощью набора изологич-іьіх иммунных сывороток, полученных у животных после полного хирургическо-о удаления опухолей разного генотипа.
Впервые показано, что адаптация опухолевых клеток к росту в избытке кей-юна сопровождается изменением композиции белковой структуры этих клеток, гоусловленным изменением функциональной активности генома. Установленные іакономерности создают предпосылки для дальнейших исследований характера шмуногенетических взаимоотношений между опухолью и организмом, для раскрытия механизмов преодоления опухолью иммунного и тканевого контроля, раз-иботки методов клинической иммунологической диагностики опухолей.
Практическая значимость полученных результатов. Установленные за-юномерности изменения количества ИК, противоопухолевых антител, специфиче-:кого для опухоли комплекса антигенов и некоторых других показателей при рос-е опухолей разных генотипов, применении различных препаратов, полном удале-ши опухоли и развитии рецидива могут быть использованы для диагностики и ірогнозирования роста опухолей. На основе полученных результатов разработан швый метод специфической иммунологической диагностики и прогнозирования шухолевого роста с помощью набора изологичных антнсывороток, полученных юсле полного хирургического удаления разного типа (генотипа) опухолей.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. В сыворотке и асцитической жидкости носителей опухолей разного гено-"ипа присутствует ассоциация - повышенное количество ИК + специфический іля опухоли комплекс свободных антигенов. Эта ассоциация является признаком и іиагностическим маркером типа опухоли и опухолевого роста.
-
Установленные закономерности экспрессии признаков, характеризуют опухолевый рост и состояние противоопухолевого иммунитета (количество И специфического для опухоли комплекса антигенов, наличие противоопухолев антител) имеют одинаковую направленность для опухолей разного генотипа. Геї тип опухоли влияет на количественные характеристики изучаемых признаков.
-
Предложенный новый метод специфической иммунологической диап стики рака позволяет более точно, чем существующие методы, определить нш чиє опухоли в организме и её тип.
Личный вклад соискателя. Результаты исследования получены, обрабо ны и проанализированы лично автором под научным руководством д.б.н., щ фессора Г.В.Красковского. В работе по исследованию белковой структуры опуз левых клеток при адаптации к росту в избытке кейлона также принимали участ В.С.Лукашевич, Т. В. Пашацкая, в отдельных исследованиях по изучению иммуі логического статуса при росте и удалении опухоли - Е.Ю.Манина, Т.В.Пашацк О.Я. Галючек.
Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации доложень обсуждены на рабочем совещании "Морфоген-3", Пущино, 1992; II Пленуме Bej русского научного общества иммунологов и аллергологов, Могилев, 1993; съезде Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов, Гроді 1995; IX съезде Белорусского общества физиологов, Минск, 1996; I Итоговой і учно-практической конференции "Современные проблемы инфекционной naTOJ гии человека", Минск, 1998.
Опубликованностъ результатов. По теме диссертации опубликовано 9 ] бот (3 статьи в журналах, 2 статьи и 3 тезисов в сборниках научных работ, 1 і тент). Общее количество страниц опубликованных результатов - 32.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, < щей характеристики работы, обзора литературы, главы "Материалы и методы", глав собственных исследований, заключения, списка литературы, включаюіщ 287 источников, и приложения. Объём работы (без приложения и списка испо. зованных источников) - 117 страниц машинописи, включая 14 таблиц и 28 рис; ков. Приложение включает 1 рисунок, 46 таблиц и копию патента.