Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследования структуры и функции транскрипционных факторов, играющих ключевую роль в процессах регуляцші экспрессии генов, находятся в ряду самых актуальных направлений развіггия современной молекулярной биологии. Особое внимание в последнее время уделяется изучению транскрипционных факторов, вовлеченных на начальных этапах регуляции транскрипции во взаимодействие с хроматином, что приводит к изменению степени доступности регуляторных последовательностей ДНК для последующего специфического связывания с другими белками.
Одним из таких факторов, осуществляющих эту важнейшую функцию перестройки и поддержания необходимой конформации хроматина у D. melanogaster, является ГАФ ( GAGA factor или GAF). Первоначально ГАФ был обнаружен благодаря его способности связываться с (ОА)о-богатыми последовательностями и активировать транскрипцию генов ЦЪх неп [ Soeller et al, 1988, Biggin,Tjian,1988]. Позднее было выявлено множество друпгх геноз-мшпеней ГАФ, контролирующих жизненно важные этапы в процессе развития дрозофилы (гомеозисные гены, гены сегментации, экдизон-индуцируемый ген Eip74EF). Также он необходим для активации генов белков теплового шока (hsp26, hsp27, hsp70) и "генов домашнего хозяйства" ( his3, his4, acti)i5C, al-tubuliri) [ Granok et al, 1995, Wilkins,Lis, 1997].
Молекулярная функция ГАФ в настоящий момент достаточно подробно исследованы. Он действует как «антирепрессор», т.е. участвует в процессе перестройки и расформирования нуклеосом и тем самым способствует в составе комплексов, перестраивающих хроматин, преодолению подавляющего действия, которое нуклеосомы и пістон Ні оказывают на транскрипцию [см. обзоры Caims, 1998, Varga-Weisz,Becker, 1998, Travers,1999]. Было показано, что ГАФ участвует также в создании и поддержании в течение клеточного цикла хроматиновой конформации таких регуляторных структур, как "глушители" (silencers) [Strait et al., 1997, Hagstrom,Schedl,1997, Cavalli et oZ,1998], "изоляторы" (insulators) [Gerasimova, Corces,1998, Ohtsuki, Levine, 1998, Bell,Felsenfeld, 1999] или "граничные элементы" ( boundary elements) [ Sun,Elgin, 1999].
Представление о биологической значимости функции ГАФ дополнилось после того, как было показано, что он кодируется геном Trithorax-like (Trt) [ Farkas et al, 1994], мутации которого проявляются как усилители эффекта положения мозаичного типа [Farkas et al, 1994, Wallrath,1998]. Ген ТИ по характеру взаимодействий с гомеозисными генами был отнесен к trx-группе генов [Simon,1995, Hagstrom,Schedl,1997, Gellon,McGinnis,1998]. Известные четыре мутации гена Ш охаракгершованы поверхноано, поэтому поиск и исследования других мутаций представляют собой актуальную задачу.
Выявление гена Trl, кодирующего ГАФ, и получение соответствующей кДНК позволили выяснить доменную структуру белка. ДНК-связывающий домен представлен одним "цинковым пальцем" [ Pedone et aL, 1996, Omichinski et aL, 1997]. Домены, ответственные за белок-белок взаимодействия, представлены амино-концевым BTB/POZ доменом [ Espinas et aL, 1999, Katsani et aL, 1999] и карбокси-концевым глутамин-богатым доменом [ Agianian el a!., 1998, Wilkins,Lis,1999]. Исследования продуктов гена Trl показали, что сам ГАФ представлен несколькими шоформами [ Biggin,Tjian,1988, Soeller etaL, 1993, Benyajati et a!.. 1997], а спектр мРНК гена Trl состоит из нескольких транскриптов, причем спектр меняется в течение развития [ Soeller etaL, 1993, Benyajati et aL, 1997], а также различается в некоторых органах [Перелыгана и др.,1993]. Однако многие аспекты экспрессии гена Trl, в частности его транскрипционной активности, до сих пор остаются не исследованными Становится ясно, что без подробных исследований молекулярных механизмов генерирования разнообразия продуктов гена Trl невозможно полностью охарактеризовать функциональные активности ГАФ. Однако, исследования в этом направленіш существенно сдерживаются из-за отсутствия геномной последовательности гена и данных о его молекулярной структуре.
Цель и задачи исследования. Целью представляемой работы являлось исследование молекулярной структуры гена Trl и новых аспектов его экспрессии. В ходе работы планировалось решіггь следующие конкретные задачи: 1) Построить молекулярную карту гена Trl на основе сравнения геномной последовательности гена (AJ225042) с относящимися к нему последовательностями из баз данных (кДНК, EST и последовательности, фланкирующие Р-элементные встройки), определить экзон-интронную структуру и выявить места для событий альтернативного сплайсинга, выявить существующие встройки Р-элементов; 2) Исследовать экспрессию гена Trl D. melanogaster на транскрипционном уровне, провести сравнение спектров транскриптов в разных органах/тканях и выявить специфические различия; 3) Выяснить зависимость транскрипционной активности гена Trl от температурного режима содержания дрозофил; 4) Изучить жизнеспособность и другие фенотипические характеристики у мутаций гена Trl, включая вновь выявленные Р-элементные встройки, провести комплементаїшонньїй анализ мутаций по признаку жизнеспособности на разных стадиях развития; 5) Провести контекстный анализ регуляторной области гена Trl, определить расположение его промотора и тип, к которому он может быть отнесен.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые установлена экзон-интронная структура большей части транскрипщюнной единицы гена Trl. Выявлено, что в 5' нетранс-лируемом районе гена транскрипты формируются в результате использования альтернатив-
ных донорных сайтов сплайсинга. Применение экзон-специфических проб для аналша спектров транскрштгов гена Trl позволило обнаружить, что у личинок Ш возраста D. melanogaster между спектром транскрштгов гена Trl из мозговых ганглиев и аналогичным спектром из слюнных желез наблюдаются различия по составу. Показано, что состав спектра транскриптов гена Trl меняется в зависимости от температурных условий развития дрозофил. Впервые исследованы четыре новых мутации в гене Trl по пршнакам жизнеспособности и фертильности. Построена карта комплементации восьми мутаций гена Trl. С помощью контекстного анализа проведено комплексное исследование промоторных и нуклеосомных свойств ДНК в 5' области гена Trl, на основании чего его промотор был локализован и определен как TATA- и DPE-несодержащий.
Полученные результаты по анализу молекулярной структуры гена Trl, особенностей его транскрипционной активности и проявлений мутаций закладывают основу для более детальных исследований механизмов структурного преобразования продуктов гена и раскрытия всего многообразия проявления гена Trl.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на отчетной сессии Инслггута цитологии и генетики СО РАН (1999г.).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей.
Структура и объем работы. Диссертация содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы (250 ссылок). Работа изложена на 122 страницах, содержит 13 рисунков и 4 таблицы.