Введение к работе
Актуальность проблемы. Слюнные желеэы хирономид являются одной ив удобных моделей для исследования тканеспецифической экспрессии генов- у эукариот. В клетках слюнных желез интенсивно нарабатывается тканеспецифический продукт - секрет, образованный семейством родственных белков (Pustell et. al., 1984; Hoog et. al., 1988). Гены, кодирующие секреторные белки, расположены в кольцах Бальбиани - гигантских пуфах в политенных хромосомах слюнных желез хирономид и обьедішенн в мультигенное семейство. Молекулярная структура колец Бальбиани, постоянно присутствующих в кариотипе, изучена достаточно хорошо, однако у ряда видов хирономид в нескольких клетках слюнных желез появляется дополнительное кольцо Бальбиани, продуцирующее специфический для этих клеток белок.
Так, особый интерес представляет изучение генов кольца Бальбиани BRa Chironomus thummi. BRa представляет собой пуф, расположенный в районе А2Ь хромосомы IV C.thunmi, который активно функционирует только в 4-х клетках специальной доли слюнной желевы (Себелева, Кикнад8е, 1972). Эту активность связывают с появлением в спектре секрета слюнной желевы дополнительной фракции - белка с массой 160 кДа (Себелева и др., 1981). Для BRa описаны 2 гена - F6.2 и С1.2, обладающие на уровне структурной организации гомологией с генами других КБ - они содержит в своем составе константные и повторяющиеся единицы (Богачев и др., 1986, 1987). Было показано также, что ген F6.2 кодирует минорный полипептид размером 67 кДа , не обладающий тканевой специфичностью (Bogachev et. al, 1990). Таким образом, BRa представляет собой, по-видимому, сложную структуру, изучение которой как модели тканеспецифической . активности генов остается актуальным. Очевидно, только полная картина молекулярно - цитологической организации кольца Бальбиани BRa C.thunmi даст возможность строить аргументированные гипотезы о тканеспецифической экспрессии BRa в 4 клетках специальной доли слюнной железы.
Цель и вадачи исследования. Цель настоящей работы -молекулярно-цитологическое изучение BRa Chironomus thummi, выявление кодирующих последовательностей, расположенных в BRa, установление полной структуры исследованного ранее гена F6.2 и первичной структуры других обнаруженных кодирующих
[
последовательностей, а также построение общей схемы организации BRa. В конкретные вадачи работы входило :
-
Скрининг геномной библиотеки C.thummi с использованием в качестве бондов описанные ранее клоны F6.2 и С1.2, содержащих в своем составе последовательности ДНК из района BRa. Для расширения исследуемой области провести второй этап скрининга, используя в качестве зондов краевые фрагменты отобранных гибридных фагов.-
-
Поиск в отобранных клонах кодирующих последовательностей ДНК и установление их отношений с F6.2 и С1.2.
-
Установление полной нуклеотидной последовательности гена F6.2, нуклеотидных последовательностей ДНК, входящих в состав других кодирующих районов BRa.
-
Анализ и сравнение выведенных аминокислотных последовательностей.
-
Геномный блот - анализ кодирующих фрагментов ДНК и построение общей схемы организации групп геномных клонов из района Кольца Бальбиани a C.thummi.
Научная новизна работы. В процессе проведенного исследования была установлена полная последовательность гена F6.2 И8 района BRa, кодирующего неткакеспецифический белок р67. Установлена структурная организация других кодирующих последовательностей из района BRa и показано. что они представляют собой ген С1.2, состоящий из четырех зкзонов, разделенных тандемными повторами - нитронами. Показана высокая гомология выведенных аминокислотных последовательностей экзонов генов F6.2 и С1.2.
Научно - практическое значение. Полученные в работе результаты дополняют и расширяют существующую информацию о структурной организации тканеспецифических локусов геномов хирономид - кольцах Бальбиани. ' Обнаружение кодирующих последовательностей в BRa C.thummi, принадлежащих двум гомологичным генам, подтверждает сложившееся представление о кольцах Бальбиани, как о сложных структурных локусах, где наряду с генами гигантских секреторных белков могут присутствовать гены других белков.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались, на
8 двустороннем симпоаиуме СССР - ФРГ "Органивация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989), 11 международном совещании по клеточному ядру (Суэдаль, 1989), 6 международном совещании по структуре и функции Колец Бальбиани (Джексон, США, 1993).
Публикации. Основные результаты работы изложены в шести научных публикациях.
Структура и объем работы. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, включающих 15 рисунков и одну таблицу. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы.