Содержание к диссертации
Введение
2. Основная часть 12
2.1. Обзор литературы 12
2.1.1. Локусы количественных признаков (QTL) репродуктивных качеств (фертильности) крупного рогатого скота 12
2.1.1.1. QTL признаков фертильности коров (женская фертильность) 14
2.1.1.2. QTL признаков фертильности быков (мужская фертильность) 20
2.1.2. Рецессивные генетические дефекты, ассоциированные с фертильностью коров голштинской породы 24
2.1.2.1. Гаплотипы фертильности голштинского скота 28
2.1.2.1.1. Гаплотип фертильности HH1 (OMIA: 000001-9913) 33
2.1.2.1.2. Гаплотип фертильности HH3 (OMIA: 001824-9913) 35
2.1.2.1.3. Гаплотип фертильности HH4 (OMIA: 001826-9913) 37
2.1.3. Анализ и выбор методов идентификации полиморфизмов изучаемых генов 39
2.2. Материалы и методы исследования 45
2.2.1. Объекты и материалы исследования 46
2.2.2. Выделение ДНК из образцов биоматериала 47
2.2.3. Теоретическое и экспериментальное моделирование тест-систем анализа полиморфизма изучаемых генов 48
2.2.4. Исследование влияния изучаемых полиморфизмов на племенную ценность быков-производителей по селекционным признакам 50
2.3. Результаты собственных исследований 55
2.3.1. Создание серии референтных образцов с известными генотипами по изучаемым генам 55
2.3.1.1. Референтные образцы по гену APAF1 56
2.3.1.2. Референтные образцы по гену SMC2 58
2.3.1.3. Референтные образцы по гену GART 61
2.3.2. Разработка тест-систем анализа изучаемых генов, содержащих LoF-мутации .65
2.3.2.1. Тест-система анализа полиморфизма APAF1 на основе ПЦР-ПДРФ .65
2.3.2.2. Тест-система анализа полиморфизма SMC2 на основе АС-ПЦР 67
2.3.2.3. Тест-система анализа полиморфизма GART на основе ПЦР-ПДРФ 69
2.3.3. Исследование распространения мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART, ассоциированных с гаплотипами фертильности HH1, HH3 и HH4, в российской популяции голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота 72
2.3.4. Влияние генотипа быков по APAF1, SMC2, GART и FANCI на степень проявления хозяйственно-полезных признаков 76
2.3.4.1. Показатели молочной продуктивности 78
2.3.4.2. Воспроизводительные качества 82
3. Заключение 85
3.1. Выводы 86
3.2. Практические предложения .88
Список сокращений и условных обозначений 89
Список литературы
- QTL признаков фертильности коров (женская фертильность)
- Теоретическое и экспериментальное моделирование тест-систем анализа полиморфизма изучаемых генов
- Разработка тест-систем анализа изучаемых генов, содержащих LoF-мутации
- Влияние генотипа быков по APAF1, SMC2, GART и FANCI на степень проявления хозяйственно-полезных признаков
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Генетические факторы
рассматриваются сегодня в качестве основных в наблюдаемом снижении
воспроизводительной способности коров (Dobson H. et al., 2007, Oltenacu P.A., Broom D.M., 2010). Исследования генома человека показали наличие более 100 вариантов последовательностей с потерей функций (LoF, loss-of-function) (MacArthur D.G. et al., 2012), которые в гомозиготном состоянии могут быть летальными, приводя к эмбриональной гибели. Аналогичная вариабельность генома крупного рогатого скота позволяет предположить аналогичное
количество LoF-мутаций в его геноме (Bickhart D.M. et al., 2012). Для обозначения LoF-мутаций, обуславливающих эмбриональную смертность, и поэтому не встречающихся у животных в гомозиготном состоянии, был предложен термин «гаплотипы фертильности». Диагностика гаплотипов фертильности является одним из ключевых элементов в системе генетического мониторинга популяций сельскохозяйственных животных (Столповский Ю.А.,
2010; Марзанов Н.С. и др., 2012; Селионова М.И., Антоненко Т.И., 2012; Косовский Г.Ю., 2015).
Степень разработанности темы. Основной породой, используемой для
производства молока, во всем мире является голштинская, которая разводится в
161 стране (FAO DAD-IS, 2016). На долю голштинской и голштинизированной
черно-пестрой пород в общем поголовье молочного скота в России приходится
более 65% (Лабинов В.В., 2016). В настоящее время в голштинской породе
регистрируется 10 селекционно-значимых гаплотипов фертильности,
ассоциированных с эмбриональной и ранней постэмбриональной смертностью,
– HCD (дефицит холестерина), HH0 (Брахиспина), HH1, HH2, HH3, HH4, HH5, HHB (BLAD), HHC (CVM) и HHD (DUMPS) (Cole J.B. et al., 2016). Российская
популяция голштинского и голштинизированного скота активно исследована на наличие только четырех генетических дефектов - Брахиспина, BLAD, CVM и DUMPS, ассоциированных, соответственно, с гаплотипами HH0, HHB, HHC и HHD (Игнатьев В.М., 1998, Эрнст Л.К. и др., 2007, Жигачев А.И. и др., 2008, Никифорова Е.Г., 2010, Эрнст Л.К. и др., 2011, Валиуллина Э.Ф., 2012, Зиновьева Н.А. и др., 2012, Крюков В.И. и др., 2012, Кураж О.П., Грибанова Ж.А., 2012, Эрнст Л.К. и др., 2012, Дементьева Н.В. и др., 2014, Марзанова С.Н. и др., 2014, Шайдуллин Р.Р. и др., 2015). Было установлено, что причиной эмбриональной смертности, ассоциированной с гаплотипами HH1, HH3 и HH4, являются LoF-мутации в генах, соответственно, апоптотического протеаза-активирующего фактора 1 (APAF1), белка структурной поддержки хромосом 2 (SMC2) и глицинамид-рибонуклеотид-трансформилазы (GART) (Adams H.A. et al., 2012;
McClure M.C. et al., 2014; Daetwyler H.D. et al., 2014; Fritz S. et al., 2013).
Основным фактором, лимитирующим проведение генетического мониторинга популяций на наличие данных гаплотипов, является то, что известным на сегодня способом их диагностики является использование ДНК-чипов. Однако применение ДНК-микроматриц сопряжено с высокими материальными затратами и не исключает получения ошибочных как ложноположительных, так
и ложноотрицательных результатов (Зиновьева Н.А. и др., 2015; 2016). В этой
связи, разработка молекулярно-генетических тест-систем, основанных на
прямом анализе LoF-мутаций, ассоциированных с генетическими дефектами,
проведение скрининга российской популяции голштинского и
голштинизированного скота, а также изучение влияния LoF-мутаций на продуктивные показатели является актуальной задачей популяционной генетики и генетики количественных признаков сельскохозяйственных животных.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось исследование полиморфизмов в генах APAF1, SMC2 и GART, ассоциированных с гаплотипами фертильности голштинского скота HH1, HH3 и HH4 в российской популяции голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота.
Для достижения цели работы были решены следующие задачи:
-
Создать серию референтных образцов с известными генотипами по LoF-мутациям в генах APAF1, SMC2 и GART, ассоциированным с гаплотипами фертильности голштинского скота HH1, HH3 и HH4.
-
Выполнить теоретическое моделирование и разработать тест-системы анализа LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART, ассоциированных с гаплотипами фертильности голштинского скота HH1, HH3 и HH4.
-
Изучить распространение исследуемых мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART в выборке быков-производителей и племенных коров голштинской и голштинизированной черно-пестрой пород.
-
Изучить влияние генотипов по APAF1, SMC2, GART и FANCI на
племенную ценность быков-производителей по показателям молочной продуктивности.
5. Изучить влияние генотипов по APAF1, SMC2, GART и FANCI на
племенную ценность быков-производителей по репродуктивным показателям.
Научная новизна работы. Впервые выполнено исследование
распространения LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART, ассоциированных с гаплотипами фертильности HH1, HH3 и HH4, в российской популяции голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота. Изучено влияние наличия в генотипе быков-производителей мутаций в генах APAF1, SMC2, GART и FANCI, ассоциированных с гаплотипами фертильности HH1, HH3, HH4 и HH0, на показатели молочной продуктивности дочерей: уровень удоя (кг), содержание жира и белка в молоке (%), выход молочного жира и белка (кг), а также репродуктивные показатели дочерей: количество осеменений, необходимых для достижения стельности (ед.), продолжительность периода от отела до первого осеменения (дн.), продолжительность периода от отела до первого продуктивного осеменения - сервис-период (дн.), продолжительность межотельного периода (дн.), продолжительность лактации (дн.).
Теоретическая и практическая значимость работы. Выполнено теоретическое и экспериментальное моделирование тест-систем анализа LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART, ассоциированных с гаплотипами фертильности голштинского скота HH1, HH3 и HH4. Определены частоты встречаемости исследуемых LoF-мутаций в выборке быков-производителей и племенных коров, разводимых в предприятиях РФ. Выявлены различия в
показателях молочной продуктивности и репродуктивных качествах дочерей в зависимости от наличия в генотипе быков-производителей LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2, GART и FANCI. Определена племенная ценность быков-производителей - носителей LoF-мутаций по вышеназванным признакам.
Методология и методы исследования. Выбор LoF-мутаций для исследований осуществляли на основании анализа родословных быков-производителей, используемых в племенных стадах. Серию референтных образцов с известными генотипами по исследуемым LoF-мутациям получали методом прямого анализа последовательности ДНК в области мутации посредством пиросеквенирования. Разработанные тест-системы идентификации LoF-мутаций были основаны на использовании методов полимеразной цепной реакции (ПЦР), анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), аллелеспецифической ПЦР. Племенную ценность быков-производителей по продуктивным показателям рассчитывали методом BLUP Sire Model с использованием моделей смешанного типа. Для обработки данных использовали биометрические методы.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Предложены тест-системы выявления LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART, ассоциированных с гаплотипами фертильности голштинского скота НН1, ННЗ и НН4.
-
Определены частоты встречаемости исследуемых LoF-мутаций в выборке быков-производителей и племенных коров.
-
Установлены различия в уровне молочной продуктивности и репродуктивных качествах дочерей быков-производителей - носителей LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2, GART и FANCI.
-
Определена племенная ценность быков-производителей - носителей LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2, GART и FANCI.
Степень достоверности и апробация результатов. Промежуточные и итоговые результаты работы были доложены и обсуждены на следующих научных конференциях:
7-я региональная научно-практическая конференция «Молодежные научно - инновационные проекты Московской области», г. Черноголовка, п. Дубровицы Подольского р-на, 27-28 мая, 2014 г.
II Международная научная конференция «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы», г. Минск, Республика Беларусь, 13-16 октября 2015 г.
XXIII международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», г. Москва, 11-15 апреля 2016 г.
20-я международная Пущинская школа-конференция «Биология - наука XXI века», г. Пущино, 18-22 апреля 2016 г.
Личное участие. Непосредственно автором проанализировано современное состояние проблемы, определены цели и задачи исследований, разработана программа и определены методы их проведения; выполнены лабораторные исследования, обработка, обобщение и анализ полученных результатов. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в т.ч. 2
– в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК (Достижения науки и техники АПК), подано 2 заявки на получение патента РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 108
страницах, содержит 23 таблицы, 17 рисунков и состоит из следующих разделов:
введение; основная часть, включая обзор литературы, материалы и методы
исследований, результаты собственных исследований и обсуждение;
QTL признаков фертильности коров (женская фертильность)
Эффективность животноводства в существенной степени зависит от генетического благополучия племенных животных. Особую важность контроль репродуктивной функции приобретает в условиях нарастающего антропогенного загрязнения, а также широкого использования интродукции животных высокопродуктивных пород в новые эколого-географические условия. Нарушение воспроизводительной функции животных сельскохозяйственных видов, смертность новорожденных в настоящее время составляет одну из основных проблем дальнейшего повышения продуктивности животноводства. Существенный вклад в такие негативные явления вносит нестабильность генетического аппарата производителей, которая может иметь как генетическую, так и паратипическую обусловленность (Косовский Г.Ю., 2014).
Исследования на человеке показали, что его геном несет более 100 вариантов последовательностей с потерей функций (LoF, loss-of-function) (Pelak K. еt al., 2010, Durbin R.M. et al., 2010, MacArthur D.G., et al., 2012), которые в гомозиготном состоянии могут быть летальными, приводя к эмбриональной гибели. Аналогичная вариабельность геномов человека и крупного рогатого скота позволяет предположить наличие приблизительно равного числа LoF-мутаций в геноме последнего (Bickhart D.M. et al., 2012). Возрастание роли LoF-мутаций в снижении фертильности коров связывают с постоянным ростом уровня гомозиготности. Так, средний коэффициент инбридинга у голштинского скота США в 1970 году составлял 0,4% (USDA-AIPL, 2012). В 2015 году средний коэффициент инбридинга в американской и канадской популяциях голштинской породы оценивался, соответственно, на уровне 6,53% (VanRaden P., Null D., 2015) и 6,81% (Inbreeding Update, 2016). Причинами этого является относительно низкий исходный уровень генетического разнообразия в большинстве молочных пород как следствие их происхождения от ограниченного числа родоначальников; практикуемое в течение более 50 лет интенсивное использование посредством искусственного осеменения относительно небольшого числа выдающихся быков-производителей и жесткая селекция по ограниченному числу признаков. Так, некоторые голштинские быки, используемые в системе искусственного осеменения, имеют более 250000 лактирующих дочерей и более 5000 сыновей, оцененных по качеству потомства. Кроме того, из приблизительно 5000 быков, оцениваемых ежегодно по качеству потомства, почти 50% являются потомками 10 наиболее популярных быков (Weigel K.A., 2001, Кузнецов В.М., Вахонина Н.В., 2010). В этой связи, диагностика LoF-мутаций, ассоциированных с летальными наследственными заболеваниями, является одним из ключевых элементов в системе генетического мониторинга популяций сельскохозяйственных животных (Столповский Ю.А., 2010, Марзанов Н.С. и др., 2012).
Негативное влияние роста гомозиготности подтверждается результатами молекулярно-генетических исследований, проведенных Bjelland D.W. с соавторами (2013). Проведенная оценка влияния геномной степени инбридинга, рассчитанной по показателям FPH (процент гомозиготности, Xср=60.5±1.1%), FROH (инбридинг, рассчитанной по длине гомозиготных гаплотипов, Xср=3.8±2.1%) и FGRM (инбридинг, рассчитанный на основании геномной матрицы родства, Xср=20.8±2.3%) на основе 33025 SNP (отобранных из 54001 SNP после удаления SNP с низкой результативностью анализа, SNP с низкой частотой минорных аллелей и результатов анализа равновесия по Харди-Вайнбергу), показала, что на каждый процент повышения геномного инбридинга, оцененного по FPH, FROH и FGRM, отмечалось увеличение сервис-периода, соответственно, на 1,76, 1,72 и 1,06 дней и матернальной трудности отелов на 0,09, 0,03 и 0,04 пункта по 5-и бальной шкале (Bjelland D.W. et al., 2013). У крупного рогатого скота LoF мутации, обуславливающие наследственные аномалии и вызывающие эмбриональную смертность, проявляются практически во всех молочных породах скота, при этом регулярно регистрируются случаи появления новых дефектов. Так, в голштинской породе идентифицированы LoF мутации, вызывающие такие наследственные заболевания как: дефицит уридинмонофосфатсинтазы – DUMPS (Shanks R.D. et al., 1984), дефицит лейкоцитарной адгезии – BLAD (Shuster D.E. et al., 1992), комплексный порок позвоночника – CVM (Agerholm J.S. et al., 2001), брахиспинальный синдром – BY (Agerholm J.S. et al., 2006, Charlier C. et al., 2012). Экономический вес таких дефектов обусловлен, в большей степени, их влиянием на фертильность коров.
Для идентификации LoF мутаций, ассоциированных с фертильностью, был предложен новый подход, получивший название картирования гомозиготности. Он основан на генотипировании десятков тысяч SNP с помощью чипов средней плотности (например, BovineSNP50beadChip (Illumina, San Diego, CA)), и последующей идентификации регионов, характеризующихся отсутствием одного из гомозиготных генотипов, что позволяет рассматривать их в качестве кандидатов локализации генов, ответственных за проявление летальных генетических дефектов. ДНК-биочип представляет собой подложку с нанесенными на нее ячейками, в которых помещено вещество-реагент. Как правило, исследуемый материал помечают различными метками (чаще флуоресцентными красителями) и наносят на ДНК-биочип. Вещество-реагент (олигонуклеотид) при классической ПЦР-реакции связывает в исследуемом материале ДНК только комплементарный фрагмент. В результате в той ячейке, где произошла реакция, регистрируется свечение. Таким образом, в 50 тысячах локусов можно выявить присутствие или отсутствие желательного для селекции аллеля (Cелионова М.И., Айбазов А.М., 2014). Предложенный метод позволяет осуществлять идентификацию таких дефектов в течение очень короткого периода времени и при наличии ограниченного числа случаев их проявляется (Charlier C. et al., 2008).
Теоретическое и экспериментальное моделирование тест-систем анализа полиморфизма изучаемых генов
Распространению вышеназванных гаплотипов среди племенного скота способствует то, что их носителями зачастую являются активно используемые быки-производители (Зиновьева Н.А. и др., 2016). Так, например, широкое распространение гаплотипов HHB и HHC произошло вследствие активного использования знаменитого быка Carlin-M Ivanhoe BELL, являющегося скрытым носителем данных дефектов. Только в США от него было получено более 79000 лактирующих дочерей и более 1200 оцененных сыновей (Olson T., 2001). Носителями гаплотипа HCD оказались быки HARTLINE TITANIC (1998 г.р.),
Comestar STORMATIC (1997 г.р.) и Ladino Park TALENT (1998 г.р.), от которых только в Канаде было получено, соответственно, более 100,74 и 52 тыс. лактирующих дочерей. В качестве носителя HH1 были идентифицированы два известных быка-производителя американского происхождения: Pawnee Farm Arlinda CHIEF (1962 г.р.) и его сын Walkway Chief MARK (1978 г.р.), от которого было получено более 60 тысяч дочерей и целый ряд сыновей, ставших в последующем активно используемыми быками-производителями (Vierhout C.N. et al., 1999). Было установлено, что каждый из двух указанных быков отвечает за около 7% генома современной североамериканской популяции голштинов (Larkin D.M. et al., 2012). От последнего было получено более 60 тыс. дочерей и целый ряд активно используемых сыновей, среди которых Shoremar MASON (1990 г.р.) с более 70 тыс. лактирующих дочерей. Распространение гаплотипа HH2 произошло, во многом, вследствие активного использования быка канадского происхождения Comestar OUTSIDE (1994 г.р.) и его сына England-Ammon MILLION (2003 г.р.), от которых было получено, соответственно, более 100 и 70 тысяч оцененных дочерей. В качестве скрытого носителя HH3 был выявлен известный бык OMAN-O-Bee-Manfred Justice (1998 г.р.), имеющий более 100 тыс. дочерей, и несколько оцененных сыновей, ставших отцами суммарно более 800 тыс. лактирующих коров. Среди носителей HH3 - бык Macomber-O-Man BOGART (2004 г.р.) с 23 тыс. дочерей. Широкому распространению гаплотипа HH4 способствовал бык французского происхождения JOCKO BESNE, от которого было заморожено более 1,7 млн. доз семени. В базах данных голштинского скота в 21 стране имеются учетные записи о продуктивности его более 160 тыс. дочерей. Во Франции дочери JOCKO BESNE используются более чем на 23000 фермах (Holstein World, 2012). Носителем HH5 оказался известный бык-производитель английского происхождения Picston SHOTTLE (1999 г.р.) с более 100 тысяч дочерей. От его сыновей только в Канаде было получено более 800 тыс. оцененных дочерей. Принимая во внимание широкое распространение гаплотипов фертильности, ассоциациями по голштинской породе большинства стран принято решение об обязательном молекулярно-генетическом тестировании быков-производителей (Зиновьева Н.А. и др., 2016).
В качестве еще одной причины распространения гаплотипов фертильности можно рассматривать их возможную ассоциацию с продуктивными показателями. Например, анализ 3 млн. записей продуктивных параметров 1,7 млн. дочерей быков с известными генотипами по HHC показал, что дочери быков - скрытых носителей HHC имели в среднем на 160 кг более высокий удой и на 4 и 5 кг более высокий выход молочного жира и белка соответственно (Kuhn M. et al., 2005).
В настоящее время установлены гены и точная локализация соответствующих LoF-мутаций для девяти гаплотипов фертильности голштинского скота (таблица 5). Таблица 5 – Гены и соответствующие LoF-мутации, ассоциированные с гаплотипами фертильности голштинского скота Гапло-тип OMIA ID1 Ген Полиморфизм Ссылка Символ Наименование (дефект) Позиции Тип HCD 001965 АРОВ Аполипопротеин B (Дефицит холестерина,CDH) 11 958 994 1,3 kb Ins(G135Vfs10X) Kipp S. et al, 2015 Menzi F. et al, 2016 Charlier C, 2016 нно 000151 FANCI Анемия Фанкони, комплементарная группа I (Брахиспина,BY) 21 184 869 -21 188 198 Del (V877L fs27X) Agerholm J.S. et al, 2006 Charlier C. et al, 2012 HH1 000001 APAF1 Апоптотический протеаза-активирующий фактор 1 63 150 400 (Q579X) Adams H.A. et al., 2012 HH2 001823 - - 94 860 836 96 553 339 - VanRaden P.M. et al., 2011, McClure M.C. et al., 2014 Продолжение таблицы Гапло-тип OMIA ID1 Ген Полиморфизм Ссылка Символ Наименование (дефект) Позиции Тип ннз 001824 SMC2 Белок структурной поддержки хромосом 2 95 410 507 (F1135S) McClure М.С. et al, 2014, Daetwyler H.D. et al, 2014 НН4 001826 GART Фосфорибозилглицинами дсинтетаза 1 277 227 (N290T) Fritz S. et al., 2013 НН5 001941 TFB1M Митохондриальный транскрипционный факторB1 93 232 651 93 370 998 138 kb Del Cooper T.A.et al., 2013 ННВ 000595 ITGB2 Бета-интегрин (Дефицит лейкоцитарной адгезии,BLAD) 145 119 004 AG Shuster D.E. et al, 1992 ННС 001340 SLC35A3 Член А3 семейства транспортеров растворенных веществ 35 (Комплексный порок позвоночника, CVM) 43 411 473 (V180F) Agerholm J.S. et al, 2001 HHD 000262 UMPS Уридинмонофосфат-синтаза (Дефицитуридинмонофосфат-синтазы, DUMPS) 69 757 801 тC Shanks R.D. etal., 1984 Примечание: 1Идентификационный номер в базе данных Online Mendelian Inheritancein Animals (OMIA).
Используя данные о показателях фертильности десятков тысяч североамериканских голштинов, генотипированных с помощью BovineSNP50 BeadChip, VanRaden P.M. с соавт. (2011) идентифицировали новые летальные гаплотипы, которые не встречались в гомозиготном состоянии. Один из гаплотипов, локализованных на BTA5, в области 58-66Mb (UMD 3.0 genome assembly), получил название гаплотипа фертильности HH1 (OMIA: 000001-9913). Наличие и локализация данного гаплотипа была позже подтверждена Fritz S. с соавторами (2013). Ген, обуславливающий снижение фертильности и ассоциированный с HH1 (апоптотический протеаза-активирующий фактор 1, APAF1, GeneID: 537782), а также нонсенсная мутация CT была идентифицирована Adams H.A. с соавторами (2012). Функциональный пептид APAF1 необходим для нормального эмбрионального развития. Мутация в гене APAF1 приводит к спонтанным абортам и, как следствие, к снижению фертильности. Генотип CC соответствует здоровым животным, генотип CT – скрытым носителям и генотип TT (летальный) – носителям. Телята – носители HH1 погибают на различных стадиях стельности. Анализ происхождения выявленных скрытых носителей показал, что наиболее ранним известным родоначальнтком мутации является известный бык-производитель USA1427381 Pawnee Farm Arlinda CHIEF (1962 г.р.). Распространению мутации, ассоциированной с HH1, в популяциях коров способствовали его потомки, активно использующиеся в системе искусственного осеменения голштинского и голштинизированного скота (таблица 6).
Разработка тест-систем анализа изучаемых генов, содержащих LoF-мутации
Таким образом, разработанная тест-система определения полиморфизма GART по результатам проведенных исследований была признана пригодной для проведения исследования животных на носительство LoF-мутации в гене GART.
Как следует из данных, представленных в разделе 2.3.2 нами были смоделированы и экспериментально апробированы молекулярно-генетические тест-системы анализа LoF-мутаций в трех генах – APAF1, SMC2 и GART, ассоциированных с гаплотипами фертильности, соответственно, HH1, HH3 и HH4. В отличие от используемых сегодня систем диагностики вышеназванных гаплотипов с использованием ДНК-микроматриц (VanRaden P.M. et al., 2011) предложенные нами тест-системы основаны на прямом анализе причинных мутаций, что позволяет практически полностью исключить получение ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Учитывая, что разработанные тест-системы основаны на использовании рутинных методов молекулярно-генетического анализа, они могут быть использованы для массового скрининга LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART в популяциях голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота.
Исследование распространения мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART, ассоциированных с гаплотипами фертильности HH1, HH3 и HH4, в российской популяции голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота
Исследование распространения мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART, ассоциированных с гаплотипами фертильности HH1, HH3 и HH4, проводили в выборке быков-производителей и племенных коров (таблицы 15, 16). Исследования животных на предприятиях 1 и 2 проводили в рамках апробации разработанных тест-систем, в то время исследования быков-производителей на предприятиях 3-10 и коров на предприятиях 3-6 проводили в рамках внедрения разработок.
Примечание: доля быков - скрытых носителей равна двукратной частоте LoF-мутаций.
В таблице 16 представлены данные распространения LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART в выборке коров из племенных заводов и племенных репродукторов России.
Как показано в таблице 16, в выборке коров частоты LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART варьировали, соответственно, от 0 до 5,00, от 0 до 7,69 и от 0 до 1,26% и в среднем составили 1,83, 2,98 и 0,64%, что соответствует доле скрытых носителей в исследуемой выборке коров, соответственно, 3,65, 5,96 и
Таким образом, проведенные нами исследования быков-производителей и племенных коров, разводимых в России, показали наличие LoF-мутаций во всех трех изучаемых генах. Сравнительный анализ частот встречаемости LoF-мутаций в исследованной нами выборке быков-производителей, используемых в системе искусственного осеменения в РФ, с распространением мутаций в североамериканской популяции голштинов (Cole J.B. et al., 2016) показал сопоставимые частоты LoF-мутации в гене APAF1, ассоциированной с гаплотипом фертильности HH1: 2,04 против 1,92%. LoF-мутация в гене SMC2, ассоциированная с гаплотипом фертильности HH3, в исследованной нами выборке встречалась с заметно меньшей частотой: 1,14 против 2,95%, в то время как LoF-мутация в гене GART, ассоциированная с гаплотипом фертильности HH4, - с меньшей частотой: 0,76 против 0,37%. Анализ родословных идентифицированных нами быков-производителей – носителей LoF-мутаций показал, что скрытые носители мутации в гене APAF1 принадлежат трем широко распространенным генеалогическим линиям -Рефлекшн Соверинга, Монтвик Чифтейна и Уэс Идеала, мутации в гене SMC2 – к линиям Рефлекшн Соверинга и Уэс Идеала, мутации в гене GART – к линии Уэс Идеала (таблица 17).
Учитывая, что в исследуемой выборке быков-производителей была установлена относительно высокая частота встречаемости LoF-мутации в гене FANCI, ассоциированной с гаплотипом фертильности ННО, при изучении влияния LoF-мутаций на хозяйственнополезные признаки дочерей наряду с генотипами по APAF1, SMC2, GART дополнительно учитывали генотип по FANCI.
Характеристика исследуемой выборки коров-первотелок, лактирующих в предприятиях Московской области, являющихся дочерями быков с известными генотипами по APAF1, SMC2, GART и FANCI, ассоциированным с гаплотипами фертильности ННО, НН1, НН3 и НН4, дана в таблице 18.
Как показано в таблице 18, молочная продуктивность первотелок в изученной популяции голштинского и черно-пестрого скота составила более 6300 кг молока при содержании массовой доли жира и белка, соответственно, 4,03 и 3,22%. Показатели фертильности дочерей быков при сравнительно хорошем уровне организации осеменения в стаде (количество осеменений не более 2 раз), не позволяют проводить ремонт стада в полной мере, т.к. продолжительность сервис-периода значительно превышает оптимальные 120 дней. Однако это может быть обусловлено породноспецифической особенностью голштинского скота, для которого характерен высокоинтенсивный тип производства молока.
В целом, уровень продуктивности животных в популяции достаточно высок, чтобы оценить, как средовые эффекты, так и генетическую составляющую родительского влияния (отцов-быков) вместе с вычленением эффекта генотипа по рецессивным мутациям.
Влияние генотипа быков по APAF1, SMC2, GART и FANCI на степень проявления хозяйственно-полезных признаков
Как и по показателям молочной продуктивности, воспроизводительные качеств дочерей быков свободных от мутаций, имели показатели величин, приближающихся к популяционным. Установлено на 0,02-0,24 ед. более высокий расход спермодоз в группах носителей LoF-мутаций по сравнению с контролем. Более высокая на 12,6 (р 0,001) и 10,5 дн. (р 0,01) продолжительность сервис-периода и на 9,0 (р 0,001) и 7,2 дн. (р 0,05) большая продолжительность межотельного периода ассоциировались с LoF-мутациями в генах SMC2 и GART, что, вероятно, является следствием ранней эмбриональной смертности плодов-носителей. В группе носителей мутации в гене FANCI, напротив, отмечалась наименьшая продолжительность межотельного периода (-6,0 дн., р 0,001), что, по всей видимости, связано с мертворожденностью плодов-носителей на последних сроках стельности (таблица 22).
Анализ результатов по наилучшим линейным несмещенным оценкам в целом уточнил влияние эффекта гаплотипов и вычленил генетическую составляющую без учета влияния паратипических факторов, чего нельзя сказать о средних показателях (таблица 23). Для осеменения потомков носителей гаплотипа ННЗ тратилось на +0,026 ед. семени больше, чем для их сверстников из других групп, при этом большей продолжительностью периода от отела до первого осеменения и сервис-периода обладали потомки быков по гену GART (НН4) на +1,9…3,9 дн.
Наилучшие линейные несмещенные оценки (BLUE) репродуктивных качеств эффекта генотипа быка по изучаемым генам в сравнении с производителями, свободными от носительства
Примечание: КО - количество осеменений, необходимых для получения стельности (ед.), ДПО - период от отела до первого осеменения (дн.), СП - сервис-период (дн.), МОП -межотельный период (дн.), ДД - продолжительность лактации (дн.). LoF-мутация в гене FANCI сопряжена с получением мертворожденного приплода, что и отражается в отрицательных оценках эффектов по репродуктивным признакам. LoF-мутация в гене APAF1 связана с потерей стельности на всех стадиях пренатального периода, в частности после плодотворного осеменения (оценка эффекта по показателю ДПО: –0,9 дн.), поэтому зафиксировать однозначно причины нарушений достаточно сложно. LoF-мутация в генах SMC2 ассоциирована с эмбриональной смертностью до 60-о дня стельности, в связи с чем наблюдается повышение числа осеменений до получения результата плодотворного осеменения. Связь LoF-мутации в гене GART с эмбриональной стельностью проявляется в увеличении продолжительности технологических параметров репродуктивного цикла.
В исследовании, проведенном Cole J.B. с соавт. (2016b) в
североамериканской популяции голштинов, также было показано снижение репродуктивных показателей у носителей LoF-мутаций. Так, было установлено, что прямые геномные оценки по показателю степени оплодотворяемости телок (HCR) были ниже у носителей LoF-мутации в гене FANCI, ассоциированной с гаплотипом фертильсности HH0 (-0,07±0,02%). Носители LoF-мутации в гене APAF1, ассоциированной с гаплотипом фертильности HH1, имели достоверно меньшие значения DGV по показателю степени стельности дочерей (DPR). Носители LoF-мутации в гене SMC2, ассоциированной с гаплотипом фертильности HH2, по сравнению с не носителями характеризовались меньшими значениями показателей фертильности: степени стельности дочерей (DPR), степени оплодотворяемости коров (CCR) и степени оплодотворяемости телок (HCR). Для LoF-мутации в гене GART, ассоциированной с гаплотипом фертильности HH4, достоверных различий между носителями и не носителями выявлено не было. 3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Развитие полногеномных методов открыло новые возможности в идентификации участков генома, ассоциированных с генами наследственных заболеваний. С использованием нового подхода, получившего название «картирования гомозиготности» (VanRaden P.M. et al., 2011), в голштинской породе крупного рогатого скота было идентифицировано, по крайней мере, пять регионов, ассоциированных с ранней эмбриональной смертностью и получивших название гаплотипов фертильности (HH1-HH5) (VanRaden P.M. et al., 2011, Fritz S. et al., 2013, Cooper T.A. et al., 2013). Было показано, что такие гаплотипы персистируют в региональных популяциях голштинского скота с частотой от 0,37 до 0,95% (Cole J.B. et al., 2016). Российская популяция голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота до настоящего времени не была исследована на наличие вышеназванных гаплотипов.
В рамках выполнения диссертационной работы нами были разработаны молекулярно-генетические тест-системы идентификации LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2 и GART, ассоциированных с гаплотипами фертильности HH1, HH3 и HH4. Исследование быков-производителей и племенных коров, разводимых в сельскохозяйственных предприятиях в России, показало наличие LoF-мутаций всех трех изучаемых генов. В исследованиях, проведенных на популяции голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота Московской области, установлены достоверные различия в уровне молочной продуктивности и воспроизводительных качеств дочерей быков-носителей LoF-мутаций в генах APAF1, SMC2, GART и FANCI по сравнению с дочерями быков – не носителей.
Принимая во внимание распространение изучаемых LoF-мутаций как среди быков-производителей, так и среди племенных коров, в селекционно-племенной работе необходимо учитывать генотип животных по LoF-мутациям в генах APAF1, SMC2 и FANCI, и с целью снижения генетически обусловленных эмбриональныхq