Введение к работе
Актуальность проблемы. В исследовании организации и изменчивости геномов растений большое значение приобретают молекулярно-генетические маркеры. Использование молекулярных маркеров на основе ДНК открывает большие перспективы для подробного картирования хромосом, идентификации генов, обеспечивающих важные свойства растений, их клонирования и генетического конструирования новых сортов. С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появляются новые возможности для установления видовой и сортовой специфичности, а также для определения таксономических взаимоотношений между отдельными видами.
Существенно ускоряет и упрощает задачу выявления молекулярных ДНК-маркеров использование методов, основанных на полихмеразной цепной реакции. В последние годы наиболее широко применяется вариант амплификации ДНК с произвольными праймерами - RAPD (random amplified polymorphic DNA) (Williams et al., 1990). С его помощью можно быстро обнаружить вариабельность сразу большого числа локусов по всему геному. Полиморфизм, возникающий из-за различий в сайтах связывания праймера, а также в результате инсерций и делеций, выявляется при электрофорезе как присутствие или отсутствие отдельного фрагмента.
Показано, что с помощью RAPD-анализа можно изучать полиморфизм ДНК у высших растений (Joshi et al., 1993; Brummet et al., 1995; Журавлев и др., 1996; Дорохов и др., 1997), конструировать генетические карты (Reiter et al., 1992), осуществлять генотипирование (Welsh et al., 1990), видовую и сортовую идентификацию (Mackill et al., 1996), устанавливать филогенетические связи (Jacobsen et al., 1996; Сиволап и др., 1998).
В изучении генома гороха, который является классическим объектом генетических исследований, еще недостаточно использовались молекулярные методы анализа, поэтому новым этапом анализа генома гороха является поиск
молекулярных маркеров, позволяющих проводить генотипирование, картирование и идентификацию сортов и разновидностей.
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлись анализ генетического полиморфизма различных сортов, линий, мутантов и сомаклональных вариантов гороха (Pisum sativmn) при помощи полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами (RAPD-метод) и выявление ДНК-маркеров в геноме гороха.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами для сортов, линий, мутантов и сомаклональных вариантов гороха и подбор праймеров, наиболее эффективно выявляющих полиморфизм у данных объектов.
-
Проведение сравнительного анализа и количественной оценки полиморфизма различных сортов, линий, мутантов и сомаклональных вариантов гороха по RAPD-спектрам.
-
Анализ наследования RAPD-маркеров в Fi, F2 и F5 поколениях.
-
Клонирование и секвенирование полиморфных RAPD-фрагментов и использование их нуклеотидной последовательности для создания специфических маркеров для дальнейшего анализа генома гороха.
Научная новизна работы. Впервые в данной работе были проведены внутривидовые сравнительные исследования генетического полиморфизма гороха с анализом генетических дистанций и определением уровней дивергенции по данным RAPD-анализа. Показана возможность использования RAPD-спектров для паспортизации сортов гороха.
Впервые выявлен и количественно оценен полиморфизм ДНК у сомаклональных вариантов гороха, полученных с помощью культуры тканей.
Обнаружен RAPD-маркер, сцепленный с определенным морфологическим признаком.
Определены нуклеотидные последовательности некоторых фрагментов RAPD-спектра у гороха и степень их гомологии с известными последовательностями из других растений.
Практическая значимость. Полученные в настоящем исследовании результаты вносят определенный вклад в изучение генома гороха. Экспериментально подтверждена возможность использования молекулярных маркеров, выявленных с помощью RAPD-метода, для картирования генома гороха.
Установлено, что RAPD-маркеры можно применять для идентификации сортов гороха и исследования их генетического родства. Впервые получены клонированные RAPD-маркеры гороха.
Оптимизированный нами RAPD-анализ полиморфизма ДНК введен в учебный практикум подготовки студентов кафедры генетики Биологического факультета МГУ и может быть рекомендован для практических занятий в других учебных заведениях с биологическим профилем.
Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ленинские горы - 95», Москва, 1995; на IV Международной конференции «Геном растений», Сан-Диего, США, 1996; на Российско-Германской конференции по биотехнологии, Санкт-Петербург, 1996; на VII Международной конференции по биотехнологии и сохранению генофонда, Москва, ] 997; на конференции молодых ученых и аспирантов Учебно-научного центра по генетике, Москва, 1997; на научных семинарах кафедры генетики и селекции МГУ и на научном семинаре Института общей генетики РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликованы две статьи и тезисы трех международных конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 43Ц страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа