Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы при проведении генетического и молскулярно-генетичсского анализа всё большее значение преобретает метод шісерционного мутагенеза. Это и понятно, поскольку в данном случае мутантный ген оказывается маркированным инсернией, которая представляет собой хорошо охарактеризованную последовательность ДНК и, кроме того, может нести маркерные гены, экспрессиругощпеся как в клетках растений, так и в клеткач E.coli. Это существенно облегчает проведение генетического и молекулярно-генетического анализа, в частности, процесс клонирования мугантных генов. В результате, в настоящее время в качестве реальной, по крайней мере, в случае растений стоит задача получения представительной коллекции инсершюнных мутантов и, соответственно, исследования структуры и функций всех генов, составляющих геном растительной клетки. В силу особенностей организации генома, ею малых размеров и небольшой доли повторяющихся последовательностей ДНК особое место в этих исследованиях занимает Arabidopsis thaliana. В случае этого объекта коллекция мутантов, в которой с 95% вероятностью будут представлены мутации в каждом гене, по оценкам составляет величину порядка 50000 т 100000 независимо полученных трансформированных растений. К созданию такого рода коллекций приступили в ряде лабораторий мира. Понятно, что успех в решении проблемы исследования организации генома высших растений на примере Arabidopsis с помощью йнсерционного мутагенеза в значительной степени связан с решением таких проблем, как конструирование удобных для проведения янсерционного мутагенеза и последующего клонирования мутантных
генов векторов, повышение эффективности процесса трансформации и, соответственно, выхода мутантных трансгенных растений и, наконец, создание системы селекции, позволяющей отбирать не только рецессивные, но и доминантные мутации, в частности, мутации в генах, участвующих в коїпроле морфогенеза растений. Решению этих задач посвящена данная работа и этим определяется её актуальность.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в разработке метода проведения инсерциошюго мутагенеза в клетках АгаЫ-dopsis и получении трансгенных растений с использованием специально сконструированных векторов для агробактериальной трансформации, которые облегчают процедуру последующего клонирования мутантных генов.
В процессе работы решались следующие задачи:
-
Конструирование векторов для агробактериальной трансформации, облегчающих процедуру последующего клонирования мутантных генов.
-
Разработка метода селекции с целью отбора не только рецессивных, но и доминантных инсерциошшх мутаций, связанных с развитием растений и формированием генеративных органов.
-
Получение устойчивых к канамицину морфологически изменённых вариантов растений и исследование их возможной трансгенной природы.
4.Увеличение эффективности инсерционного мутагенеза на этапе трансформации клеток прорастающих cemaArabidopsis.
Научная новизна. В работе на базе вектора рВП21, являющегося элементом бинарной векторной системы для генетической трансформации двудольных растений, получена серия модифицированных векторов. Эти векторы существенно облегчают процедуру клонирования мутантных генов за счет включения в Т-область исходного вектора фрагментов ДНК,
имеющих в своём составе маркерные гены, экспрессирующиеся в клетках E.coli и обеспечивающие последним устойчивость к одному из трёх антибиотиков - ампициллину, хлорамфениколу, тетрациклину. Впервые разработан метод, позволяющий проводить отбор и последующее клонирование генов, мутации в которых влияют на морфогенез и приводят к гибели либо стерильности трансформированных растений.
Практическая значимость. Сконструированные векторы могут применяться для агробактериалыюй трансформации не только Arabidopsis, но и других двудольных растений. Модифицированный метод генетической трансформации прорастающих семян Arabidopsis, дающий увеличение выхода трансформированных растений по сравнению с оригинальной методикой, может быть использован в дальнейших экспериментах по проведению инсерционного мутагенеза с целью получения полпоразмерной коллекции инсерционных мутаций в геноме Arabidopsis.
Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы был» представлены на Международном симпозиуме " Plant Biotechnology and Genetic Engineering"' (Киев, 1994), Первом съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (БОФБ) (Минск, 1994). научном межлабораторном семинаре ИОГен РАН "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" (Москва, 1996).
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, 3-х глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, а также выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц и 26 рисунков,
содержит 1 приложение. Список использованных источников включає 341 наименование.