Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Природа повреждений, возникающих в ДНК . 8
1.2. Генетический контроль репарации ДНК 14
1.3. Механизмы и ферменты репарации 18
1.3.1, Фотореактивация , 18
1.3.2, Эксцизионная репарация ,20
1.3.3, Пострепликативная репарация, 26
1.3.4, Индуцибельная репарация ,31
1.3.5, Адаптивный ответ..... .35
1.4. Мутанты стрептомицетов, дефектные по репарации
ДНК 38
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
2.1. Генетическая номенклатура, штаммы, питательные среды .41
2.2. Индукция мутаций и выделение мутантов чувствительных к действию 45
2.3. Изучение чувствительности Uvs+- и Uvs-штаммов к различным повреждающим ДНК-тропным агентам..... .46
2.4. Определение доверительных интервалов кривых выживаемости .48
2.5. Изучение способности Uvs+- и Uvs-штаммов к фотореактивации 49
2.6. Определение антибиотической активности Uvs-му-тантов 50
2.7. Процедуры скрещиваний и генетический анализ гаплоидных рекомбинантов 50
ГЛАВА З, ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДВНИЕ 53 '
3.1. Получение и фенотипическая классификация мутантов 53
3.1.1. Частота индукции uvs-мутаций 53
3.1.2. Чувствительность Uvs-мутантов к действию повреждающих ДНК-тропных агентов 53
3.1.3. Способность Uvs+- и Uvs-штаммов к фотореак-тивации 68
3.1.4. Сравнительный анализ наиболее чувствительных к УФ-свету мутантов стрептомицетов и кишечной палочки 71
3.1.5. Заключение.... 74
3.2. Фертильность скрещиваний и рекомбинационная
способность Uvs-мутантов ..... 77
3.2.1. Способность Uvs-мутантов к образованию антибиотика и фертильность скрещиваний. 77
3.2.2. Ингибирование Uvs-мутантами спорообразования штаммов 24-14 и 24-І4апіГв смешанной культуре.81
3.2.3. Рекомбинационная способность Uvs-мутантов....84
3.2.4. Заключение........ 88
3.3. Генетический анализ Uvs-мутантов.... 90
3.3.1. Картирование мутаций uvs-2, uvs-з, uvs-4 и uvs-5 90
3.3.2. Анализ штамма 22с как двойного Uvs-мутанта,. 99
3.3.3. Мутации uvs и возможное количество затронутых генов репарации 106
3.3.4. Заключение НО
ВЫВОДЫ ИЗ
ЛИТЕРАТУРА 115
- Природа повреждений, возникающих в ДНК
- Генетическая номенклатура, штаммы, питательные среды
- Получение и фенотипическая классификация мутантов
Введение к работе
Естественная способность клеток любого происхождения сохранять целостность генома в изменяющихся условиях окружающей среды обеспечивается эффективной работой системы репарации, восстанавливающей ДНК от- различных повреждений. Репарация - общебиологическое явление. Она играет также важную роль в процессах репликации и генетической рекомбинации ДНК.
Как известно, клетка может инактивироваться после облучения Уі-светом по причине возникновения в ДНК пиримидиновых димеров. Эти повреждения могут быть причастными к злокачественной трансформации клеток животных и человека /Setlow , 1978/. Однако, ин-активирующее действие УФ-света можно снять у организмов, способных к фотореактивации /Werbin , 1977/. Кроме фотореактивации, в клетке функционирует сложная система темновой репарации ДНК, успешное и качественно новое изучение которой началось с момента выделения в 1958 г. первого мутанта, чувствительного в УФ-свету /Hill , 1958/. Получение и изучение Uvs -мутантов у многих организмов и, особенно у кишечной палочки /у которой к настоящему времени известно около 70 генов, имеющих отношение к репарации/, оказало ^решающее влияние на формирование современных представлений о природе этого жизненноважного для клетки процесса. Так, уже в 1964 г. была сформулирована теория эксцизионной репарации - основного пути ферментативного восстановления ДНК от пиримидиновых димеров путем их удаления из поврежденной нити и последующей застройки возникших пробелов с использованием интактной комплементарной нити в качестве матрицы /Setlow , Carrier , 1964; Воусе , Howard -Flanders , 1964/. Другой механизм репарации пробелов, возникающих против пиримидиновых димеров, функционирующий в слу— чае репликации поврежденной ДНК, получил название пострепликатив-ной репарации / Rupp, Howard - Flanders, 1968/. Работа этих конститутивных путей репарации дополняется особым индуцибельным состоянием репарационной системы клетки, которое заключается в индуцированной депрессии ряда репарационных генов / Witkin, 1976; Walker , 1984/.
За последние годы в изучении системы репарации кишечной палочки достигнут значительный прогресс: выделены различные ферменты репарации и изучены их свойства, расшифрована последовательность гена RecA и установлена его главная роль в индуцибельных процессах, открыт индуцибельный белок гена ssb, кооперативно работающий с белком RecA, открыт и изучается путь воостановления ДНК от метиллирования - адаптивная репарация. Не менее важными представляются достижения в области практического применения знаний о механизмах репарации ДНК для оценки степени загрязнения внешней среды. Ведь клетка, кроме УШ-света, подвергается также воздействию ионизирующей радиации и многих химических веществ, вызывающих широкий спектр повреждений ДНК. Кроме того, на клетку начинают действовать продукты новых технологий, обычно не существующие в природе. Последствия антропогенного загрязнения трудно предсказать без специальных исследований. Для своевременного обнаружения повреждающих ДНК-тропных агентов на модели кишечной палочки уже разработан так называемый SOS-хромотест. Он заключается в колориметрическом измерении индукции функции sfiA/suiA/, связанной с остановкой клеточного деления / Quillardet е. а., 1982/.
Первые шали в изучении системы репарации ДНК сделаны у стреп-томицетов. Так, ys. coelicolor A3 /2/ HS. clavuligerus получены и охарактеризованы uvs-мутанты, ys. coelicolor A3 /2/ они оказались чувствительными только к УФ-свету и по этому признаку на- поминают мутанты типа Uvr кишечной палочки. Картировано шесть Uvs-локусов. Мутанты, чувствительные к УФ-свету и ионизирующей радиации у этого вида пока не обнаружены /Harold, Hopwood, 1970/. Uvs-мутанты s. clavuligerus оказались более разнообразными. По спектрам чувствительности к УФ-свету и радиации, а также по уровням мутабильности после действия УФ-света, радиации, нитрозогуа-нидина и метилметансульфоната, они были распределены на три фено-типические группы Uvr, Lex и Rec / Saunders , Holt , 1982/.
Необходимо отметить, что ряд неудобств, к которым прежде всего следует отнести особенности морфологии и дифференциации, проявление ингибирующей способности одних штаммов по отношению к другим, а также самоингибирование /Стенчук, 1974/, необходимость анализировать большие выборки рекомбинантного потомства для получения статистической достоверности результатов скрещивания и другие причины, сдерживают быстрое развитие генетических исследований у этих объектов. И все же стрептомицеты обладают неоспоримым преимуществом перед другими микроорганизмами, лучше изученными генетически. Они являются продуцентами более, чем 1000 различных антибиотиков, широко использующихся в медицине и народном хозяйстве. Практическая значимость стрептомицетов с одной стороны и возросшая возможность методов генетической инженерии - с другой, в последнее время привлекают большое внимание генетиков и эти объекты становятся перспективными для исследований. Streptomycea olivaceus VKX - второй генетически наиболее изученный штамм стрептомицетов. Для него разработаны методы генетического анализа и построена кольцевая карта генома /Мацелюх, 1979/. Привлечение S. olivaceus VKX для изучения системы репарации ДНК дает возможность выявить и картировать новые гены на ге- нетической карте, а также получить дополнительную информацию о системе репарации ДНК у стрептомицетов.
Целью настоящей работы было получение мутантов, чувствительных к УФ-свету, их фенотипическая классификация и картирование uvs-мутаций на генетической карте s. olivaceus VEX.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Под действием УФ-света или нитрозогуанидина получены Uvs -мутанты s. olivaceus VKX, которые распределены на фенотипические группы типа Uvr , Lex и Rec . Обнаружены Uvs -мутанты, устойчивые к ионизирующей радиации или нитрозогуанидину. Установлена способность Uvs+- и Uvs-штаммов к ферментативной фотореактивации. Показано ингибирующее действие Uvs -мутантов на образование спор Uvs+ -штаммами в смешанной культуре. Обнаружено влияние мутации uvs-6 на частоту генетической рекомбинации. Мутации uvs-I -uvs-б картированы в четырех районах генетической карты, є Результаты настоящей работы вносят определнный вклад в изучение генетического контроля системы репарации ДНК yS. olivaceus VKX . Наличие Uvs-мутантов, принадлежащих к разным фенотипи-ческим группам, представляет возможность проводить дальнейшее расширение работ в этом направлении. Особо чувствительные мутанты Uvs могут представлять интерес для использования их в качестве тестеров для определения радиоактивноро и химического загрязнения внешней среды и особенно интенсивного УФ-излучения солнца. Мутанты TffliaRec могут использоваться для изучения механизма рекомбинации, а также для конструирования штаммов типа F' кишечной палочки. Знания о системе репарации ДНК у стрептомицетов йудут полезными при изучении стабильности и жизнеспособности промышленных продуцентов антибиотиков, прошедших длительный путь селекции после действия радиации и химических мутагенов. ~ 8 -
Природа повреждений, возникающих в ДНК
УФ -свет. Облучение ДНК бактерий УФ-светом вызывает фотохимическую реакцию ковалентного связывания соседних пиримидинов с образованием циклобутанового кольца /Beukers , Berends , I960/. Наиболее часто при этом возникают димеры тимина /рис.Іа/. В меньшем количестве образуются димеры тимин-цитозин, цитозин-ци-тозин /Setlow е. a. , 1965/. Тиминовые димеры очень стабильны. Даже незначительные количества этих повреждений можно обнаружить в ДНК, содержащей радиоактивную метку /Wulff , 1965/.
Кроме пиримидиновых димеров, УФ-свет вызывает появление в ДНК і»-продуктов-5,6-диокситимина и других тиминовых гликолей, гидратов пиримидинов, сшивок ДНК-белок /Сигаева и соавт., 1981/. При облучении спор высокими дозами УФ-света до 30% тимина может превратиться в так называемый споровый продукт типа циклобутано-вых димеров /рис. 16/. Споровый продукт вызывает в 10 раз меньший летальный эффект, чем тиминовые димеры /Смит, Хенеуолт, 1972/. Все эти повреждения так или иначе искажают конфигурацию двойной спирали ДНК и должны в дальнейшем устраняться репарационными системами /Жестяников, 1979/. Наиболее изученными в этом отношении являются пиримидиновые димеры. Их количество в ДНК Е. coli по отношению к другим фотопродуктам может достигать 30%. Образовавшийся димер вызывает нарушение спаривания с двумя комплементарными основаниями, которые находятся напротив него. С каждой стороны от димера также нарушается спаривание, которое захватывает еще четыре пары оснований. Нарушение связей между шестью комплементарными основаниями вызывает остановку репликации /Helene , Charlier , 1978/, При полном выключении работы эксцизионного и пострепликативного путей репарации один димер, возникший в хромосоме, может вызвать гибель клетки /Howard -Flanders , Воусе , 1966/.
Генетическая номенклатура, штаммы, питательные среды
Для обозначения генетических маркеров различных мутантных штаммов s. oiivaceus VKX в работе использовались общепринятые символы генов /табл. I./.
Примечание: УФ - ультрафиолетовые лучи;
НГ - н-метил- -нитро- -нитрозогуанидин; спонт. - получен спонтанно, без обработки мутагеном. Все рабочие мутантные штаммы, представленные в таблице 2 происходят от streptomyces oiivaceus VKX. Штамм 585 получен от Д.А.Холвуда /Англия/, происходит от streptomyces coelico-lor АЗ/2/.
Маркеры ауКСОТрофНОСТИ ade-1, his-1, leu-1, met-1, rib-1 и ura-1, использованные в работе по генетическому анализу мутаций, картированы ранее /Мацелшх, 1979/. Расположение их на генетической карте s. oivaceus VKX дано на рис. 5.
Для выращивания, хранения и проведения скрещиваний ауксот-рофных мутантов использовали полноценную среду следующего состава: NaCi - 0,5 г., MgS04.7H2o- 0,5 г., К2НРО4 - 1,0 г., кукурузный экстракт /сухой вес/ - 10,0 г., дрожжевой экстракт -1,0 г. /или дрожжевой автолизат - 3,0 мл/, гидролизат нуклеиновых кислот - 3 мл, раствор витаминов - I мл, гистидин - 50 мг, глюкоза - 20,0 г., агар - 20,0 г., вода дистиллированная - I л, рН среды - 7,2 - 7,4.
Гидролизат нуклеиновых кислот готовили следующим образом:навеску из 4 г. нуклеиновой кислоты /ДНК или РНК Олаинский з-д химреактивов/ делили на две равные части, одну из которых кипятили в течении 10 мин. в 15 мл 1НаОН,а другую - 10 мин. в 15 мл 1H.HG1:. После гидролиза смешивали оба раствора, смесь фильтровали через бумажный фильтр и ее объем доводили до 40 мл дистиллированной водой.
Раствор витаминов содержал рибофлавин /0,01$/, никотинамид /0,1$/» парааминобензойную кислоту /0,01$/, солянокислый пиридок-син /0,05$/, солянокислый тиамин /0,05$/ и биотин /0,02$/.
Для селекции и идентификации генотипов гаплоидных рекомбинан-тов использовали селективные и диагностические среды, представлявшие собой минимальную среду с добавлением соответствующих факторов роста.
В качестве минимальной среды применяли среду Чапека с глюкозой: Nam 3 - 2,0 Г., К2НРО4 - 1,0 Г., КС1 - 0,5 Г., MgS04 7 Н20 -0,5 г., Fesc 4 7 Н20 -0,01 г., глюкоза 20,0 г., агар 20,0 г., вода дистиллированная - I л, рН среды 7,2 - 7,4.
Получение и фенотипическая классификация мутантов
В таблице 3 суммированы результаты опытов по выделению мутантов S. olvaceus VKX, чувствительных к УФ-свету. После облучения УФ-светом спор штаммов 52-132 и 81-64 выделено шесть УФ-чув-ствительных мутантов. Частота индукции составила 0,026 и 0,048%, соответственно. После действия нитрозогуанидина на споры штамма 196 выделено восемь мутантов, чувствительных к УФ-свету. Частота индукции составила 0,032%. Таким образом, из 45780 колоний,проверенных методом отпечатков, выделено 14 Uvs -мутантов, что в среднем составило около 0,03%. Питательная потребность и способность к споруляции у полученных мутантов не нарушены. Как видно из рис.7, Uvs -мутанты в значительной степени отличаются между собой по чувствительности к УФ-свету. Наименее чувствительными к действию УФ-света оказались мутанты, полученные под действием нитрозогуанидина. ВЦутант 22с, полученный под действием УФ-света, охарактеризован нами как сверхчувствительный, поскольку облучение спор этого мутанта на репликах даже небольшими дозами УФ-света приводит практически к полному отсутствию роста, в то время как реплики со средним и незначительным уровнем чувствительности еще дают хороший рост /рис. 7/.