Иммуногенетический анализ активации клеток-регуляторов как механизма фармакологической модуляции иммуногенеза Писарев, Владимир Митрофанович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Широкое распространение в настоящее время таких заболеваний, как аллергические, острые и хронические инфекционные и неинфекционные болезни с выраженными проявлениями воспалительных реакции, первичные и вторичные иммунодефицитные состояния [Петров Р.В., Орадовская И.В., 19883, аутоиммунные и онкологические болезни, во многом обусловлено нарушениями регуляторних механизмов иммунной системы человека [Петров Р.В. и др.,19843.

Можно выделить по крайней мере три группы причин, которые лежат в основе иммунологических нарушений, определяющих изменение структуры заболеваемости населения и тенденцию к хронизации патологических процессов.

1. Ослабление естественного отбора, который у человека происходил в основном по признаку устойчивости к инфекции и на протяжении веков совершенствовал иммунную систему [Фогель Ф., матульски Ф.,19903.

2. Снижение специфической и неспецифической (адыовантноподоб-ной) стимуляции клонов Т- и В-лимфоцитов, других клеток иммунной системы антигенами микрофлоры вследствие широкого применения антибиотиков.

3. Расширение ареала и интенсивности воздействия на организм человека антропогенных неблагоприятных экологических факторов, обладающих иммунотоксическим эффектом.

Возникающие иммунодефицитные состояния не только меняют характер и течение широко распространенных заболеваний, но и могут способствовать увеличению цитогенетических нарушений в лимфоцитах человека [Ilyinskikh N.N., Ilyinskikh I.N., 1983; Ильинских H.H., 19843. Имеются основания полагать, что в условиях иммунодепрессии вирусоподобные элементы СХесин Р.В., 19843 и вирусы в большей степени являются причиной нестабильности генома [Ильинских Н.Н., 19843. Кроме того, поскольку иммунная система контролирует генетический гомеостаз клеток организма [Вернет Ф., 1971; Петров Р.В., 19763, то при иммунологической недостаточности нарушается способность элиминировать мутантно измененные клетки.

Многие наследственные и врожденные заболевания характеризуются нарушениями иммунной системы. Проявления иммунологической недостаточности характерны для синдромов Блюма, Дауна, Олбраита, болезней Адьцгеймера, Рейно, нейрофиброматоза Реклингаузена, пигментной хсе-

родермы, атаксии-телеангиэктазии и генетически гетерогенных первичных иммунодефицитных состояний [обзоры: Ильинских Н.Н.,1986; Писарев В.М., Лесков В.П., 1980].

Приведенные данные свидетельствуют о значении для медицинской генетики и иммунологии исследований,связанных с разработкой средств и способов фармакологической коррекции иммунологических нарушений.

Конечный аффект использования иммуноыодулирующих препаратов в определенной мере обусловлен генетическими особенностями фармакоки-нетики, метаболизма препарата, чувствительности к нему клеток-мишеней, т.е. фарыакогенетическими факторами [Телегин Л.Ю., Певницкии Л.А.,19793. С другой стороны, результат действия препарата на иммунную систему может зависеть от его способности влиять на отдельные генетически детерминированные ключевые компоненты иммунорегуля-торных механизмов, в том числе на продукцию и акцепцию медиаторов иммуногенеза [Писарев В.М. и соавт., 1985; Пухальский А.Л.,1992].

Значение генетических факторов в иммуностимулирующем действии фармакологических иммуномодудяторов было продемонстрировано на мышах в отношении левамизола [Renoux G. et al.,1979] и тимозина [Ка-rekgyarto С. et al.,19873. Показано также, что генетические различия в чувствительности к шмуномодуляторам могут выражаться в различной продукции медиаторов иммуногенеза после импульсного воздействия фармакологических препаратов [Писарев В.М. и др.,19853.

Вместе с тем неиэученность клеточных и молекулярных механизмов, обеспечивающих фармакологическую коррекцию нарушений иммуноре-гуляции при патологии человека, тормозит как более детальное исследование иммуногенетических закономерностей, определяющих взаимодействие в системе "лекарство-организм", так и разработку новых подходов к иммунофармакотерапии. Это определяет актуальность исследования не только механизмов фармакологической иммуномодуляции, но и изучения генетического контроля процессов, определяющих воздействие препарата на иммунную систему.

В связи с гетерогенностью популяций иммунокомпетентных клеток, отличающихся друг от друга как особенностями дифференцировки, так и состоянием активации, воздействие фармакологических препаратов на лимфоциты может иметь неоднозначный характер. Поскольку пул циркулирующих лимфоидных клеток в крови человека составляет есєго лишь 1Z от их общего содержания в организме, а концентрация иммунотроп-ного препарата в крови строго лимитирована генетически детерминиро-

ванными процессами его метаболизма, следует полагать, что только некоторая часть клеток будет активирована препаратом-иммуномодуля-тором.

В 1984 гг. нами совместно с В.П.Лесковым [Лесков В.П., Писарев В.М., Аршинова С.А.,1984: Писарев В.М., Лесков В.П.,1985] были получены экспериментальные данные, свидетельствущие о возможности усиления иммунного ответа мышей ка антиген введением небольшого (5*10^б) количества сингенных иммуноцитов, инкубированных in vitro с иммуномодулятором диуцифоном. Результаты позволили предположить, что в случае активации различными препаратами, иммуноциты могут приобрести способность функционировать в качестве клеток-регуляторов иммуногенеза и опосредовать эффект препарата в зависимости от генетически контролируемых процессов их активации. Такой механизм фармакологической иммуномодуляции предполагал не только необходимость его доказательства, но и мог иметь значение для разработки новых подходов к иммунофармакотерапии.

Цада и задачи кесЕакаванкл. Целью настоящей работы явилось исследование иммуногенетических закономерностей и механизмов фармакологической модуляции иммуногенеза, лежащих в основе генетических различий в чувствительности к природным и синтетическим препаратам с иммуномодулирующей активностью, для разработки новых средств и способов иммунокоррекции.

В процессе работы была сформулирована новая научная концепция о значении фармакологически активированных клеток-регуляторов иммуногенеза как генетически контролируемых посредников в системе "лекарство-организм" .

В соответствии с целью работы решались следующие задачи.

4. Выявить новые химические и природные соединения, модулирующие продукцию цитокинов иммунной системы, перспективные для создания на их основе новых лекарственных иммуномодуляторов, и определить значение генетических факторов в контроле чувствительности им-мунокомлетентных клеток к их воздействию.

5. Установить значение генов главного комплекса гистосовмести-мости человека и мышей в контроле фармакологической иммуномодуляции.

6. Определить участие фармакологически активированных Т-кле-ток- регуляторов в опосредовании действия иммуномо;цулмрующих препаратов и выяснить, какие генетические факторы контролируют процессы

активации клеток-регуляторов.

4. Изучить молекулярные механизмы действия Т-клеток-регуляторов, роль межклеточных взаимодействий и участие мембраноассоциированных продуктов генов главного комплекса гистосовместимости человека в осуществлении эффекта клеток-регуляторов.

5. Обосновать использование ряда иммуномодуляторов для фармакологической активации клеток-регуляторов in vitro с целью последующего их введения в аутологичный организм (экстракорпоральная имму-нофармакотерапия) для лечения тяжелых иммунодефицитных состояний и других иммунологических нарушений.

6. На основании полученных данных сформулировать новую научную концепцию фармакологической регуляции иммуногенеза, предполагающую участие генетически контролируемых Т-клеток-регуляторов в опосредовании воздействия различных иммуномодуляторов на процессы пролиферации, дифференцировки и коммитирования лимфоцитов к программированной клеточной гибели.

Научная исшвиа. В работе предложено новое решение актуальной проблемы, связанной с изучением молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе генетических различий в чувствительности к фармакологическим препаратам-иммуномодуляторам, а также с разработкой новых подходов к лечению иммунодефицитных состояний. Это решение заключается в том, что фармакологически активированные клетки-регуляторы иммуногенеза используются и как объект при изучении механизмов генетических различий в чувствительности к иымуномодуля-торам, и как инструмент исследования закономерностей фармакологической иммуномодуляции в целях разработки способов иммунокоррекции.

Впервые экспериментально обоснована научная концепция, позволяющая объяснить механизмы генетических различий в чувствительности к различным иммуномодулирующим препаратам и установить новые закономерности фармакологической иммуномодуляции. Сущность предлагаемой концепции заключается в следующем. Лишь некоторая часть иммуноком-петентных клеток может быть активирована фармакологическими препа-ратами-иммуномодуляторами. Активированные клетки - Т-лимфоциты выступают в качестве Т-клеток-регуляторов, являющихся посредниками в системе "лекарство-организм". Фармакологически активированные Т-клетки-регуляторы в процессе межклеточных вааимодействий, происходящих с участием мембраноассоциированных продуктов локусов DJ? и

DQ комплекса HLA человека, высвобождают в ранние сроки после активации регуляторные факторы, опосредующие воздействие фармакологических кммуномодуляторов на иммунную систему.

Впервые показано, что межлинейные различия в чувствительности к действию иммуномодулирующих соединений связаны с особенностями активации клеток-регуляторов иммуногенеза.

Впервые установлено, что целый ряд химических соединений и препаратов с иммуномодулирующей активностью реализуют свое действие на клетки иммунной системы посредством активации Т-клеток-регулято-ров, контролирующих процессы пролиферации, дифференцировки, антите-лообразования, продукции различных цитокинов иммунокомпетентными клетками.

Впервые установлена роль генов главного комплекса гистосовмес-тимости в контроле активации клеток-регуляторов иммуногенеза имму-номодулкрующими препаратами.

Впервые показана возможность фармакологического контроля препаратом- шмуномодулятором кортикостероид-индуцированных процессов коммитирования лимфоцитов к программированной клеточной гибели. Выявлены механизмы этого контроля, связанные с высвобождением под воздействием фармакологически активированных клеток-регуляторов растворимых факторов с молекулярной массой 75-90 кД.

Практическая зкачкыоста.

1. Обнаружение большей чувствительности к иммунокорригирующему воздействию разных иммуномодулирующих препаратов у лиц с фенотипами HLA-B5 и HLA-DR5 позволяет рекомендовать использование HLA-типиро-вания в целях индивидуализации иммунофармакотерапии.

2. Полученные экспериментальные данные легли в основу разработки нового подхода к коррекшш иммунологических нарушений, в том числе - иммунодефицитных состояний, эутологичнши клетками-регуляторами, активированными in vitro фармакологическими препаратами (метод экстракорпоральной иммунофармакотерапии - ЭИФТ). Разработан упрощенный вариант ЭИФТ и обосновано использование различных лекарственных препаратов с иммуномодулирующей активностью с целью индукции клеток-регуляторов in vitro. Проведена клиническая апробация нового варианта ЭИФТ при лечении больных с тяжелыми поражениями фагоцитарной системы.

3. Изучение иммуномодулирующей активности и механизмов дейс-

твия синтетического гексапептида тимогексина способствовали разработке на его основе нового лекарственного препарата имунофан и проведению предварительных клинических испытаний. Результаты экспериментальной работы использованы в качестве материалов по препарату имунофан, представленных для его утверждения в качестве лекарственного средства в Фармакологическом комитете России. Экспериментально обосновано использование препарата имунофан в клинической практике при иммунодефицитных состояниях, включая первичный селективный IgA-иммунодефицит, а также с целью снижения уровня продукции фактора некроза опухоли (ФНО) и дезинтоксикации при заболеваниях, сопровождающихся гиперпродукцией данного цитокина.

4. Обнаружение среди группы оригинальных производных рибонук-леотидов, подавляющих репликацию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), соединений, ингибирующих продукцию ФНО, открывает перспективы соадания эффективных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции.

Освошшз псштоанкя.вшсхааизз на защиту.

4. Гены главного комплекса гистосовместимости участвуют в контроле иммуномодулирующего эффекта препаратов с разной химической структурой.

5. Межлинейные различия в чувствительности к действию иммуно-модудирующих препаратов проявляются на уровне активации Т-клеток-регуляторов иммуногенеза.

6. Гены главного комплекса гистосовместимости мышей контролируют процессы активации клеток-регуляторов различными фармакологическими препаратами.

7. Действие фармакологически индуцированных клеток-регуляторов на клетки иммунной системы опосредовано как их мембраноассоцииро-ванныыи структурами, так и высвобождением растворимых факторов в ранние сроки после воздействия препарата. Продукты генов главного комплекса гистосовместимости участвуют в проявлении активности клеток-регуляторов .

8. Клетки-регуляторы, активированные фармакологическими имму-номодулягорами, способны контролировать процессы пролиферации и дифференцировки иммуноцитов, антителообразование, продукцию цитоки-нов, ингибировать процессы активации Ca/Mg-зависимой эндонуклеазы в моноиукдеарах человека и могут быть использованы для коррекции им-мунодефицитных состояний и других нарушений иммунной системы.

9. Предложена концепция, согласно которой фармакологически ак-

тивированные клетки-регуляторы иммуногенеза выступают в качестве ранних посредников воздействия иммуномодулирущих препаратов на иммунную систему.

Внедрение.

Совместно с коллективом авторов получено авторское свидетельство N 1797894 (1992), проводятся клинические испытания разработанного нового иммуномодулирущего фитопрепарата. Предложенный вариант метода ЭИФТ с использованием препарата милдронат для активации клеток-регуляторов внедрен в практику работы областной клинической больницы N 1, г. Курск, для лечения больных с иммунологической недостаточностью. Метод позволил достигнуть быстрого и устойчивого клинического эффекта, в том числе в случаях, когда другие способы лечения были неэффективны. Автор, как участник работы по экспериментальному обоснованию метода ЭИФТ, внедренного в практику в Институте иммунологии МЗМП РФ, отмечен Серебряной медалью ВДНХ СССР (1987).

Апробация работы. Материалы исследования докладывались: 1) в виде устных сообщений - на Всесоюзной конференции по проблемам профилактики, диагностики и лечения аутоиммунных заболеваний и кммуно-дефщитов (Новосибирск, 1985); республиканской конференции "Механизмы шмуностимудяции"(1985); конференции "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной аллергологии и иммунологии" (Каунас, 1986); конференции "Актуальные проблемы иммунологии. Иммунодефицигы и иммунокоррекция" (Владивосток, 1987); IX межинститутской конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1988) , рабочем совещании "Иммуномодуляторы природного происхождения" (Владивосток, 1990); Международном симпозиуме "Проблемы шмунофармаколо-гки" (Тбилиси, 1990); международной конференции "Синтетические оли-гонуклеотиды: проблемы и перспективы практического применения" (Москва,1991); LXII сессии общего собрания АМН СССР (Москва, 1991); научной конференции по проектам, выполняемым в рамках ГНТПР "Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении" (Москва, 1992); I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); I Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1992); III межреспубликанской конференции по медицинской ботанике (Киев, 1992); VIII Международном конгрессе по иммунологии (Будапешт, 1992); I Международном конгрессе по ишунореабилитации ( Дагомыс, 1994); 2) в виде

стендовых сообщений - на республиканской конференции "Механизмы им-муностимуляции" (Киев, 1985); Всесоюзной конференции по экодогичес-, кой безопасности (Иркутск, 1991); на международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата, 1992); конференции по проблемам экологической медицины (Алма-Ата, 1993); на международном симпозиуме Фалька "Цитокины и печень", Фрайбург,1994).

Публикации. Соискатель имеет 85 печатных работ, 46 из них (39 в отечественных изданиях и 7 в зарубежных) по теме диссертации.

Объем и структура исследования. Диссертация написана по типу монографии, ее материал изложен на 284 страницах машинописного текста, содержит 60 графических иллюстраций и 82 таблицы. Диссертация состоит из введения, изложения собственных результатов исследований с обсуждением (4 главы), заключения и выводов, а также библиографического указателя.