Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Значение иммуногенетических факторов в развитии болезни Крона
1.2. Значение иммуногенетических факторов в развитии язвенного колита
Глава 2. Материал и методы исследования 33
2.1. Материал исследования 33
2.2. Методы исследования 43
2.3. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Полиморфизм генов системы HLA при язвенном колите и болезни Крона у взрослого населения Московского региона (Результаты и обсуждение)
3.1. Распределение групп аллелей HLA I и II классов в контрольных группах
3.2. Особенности полиморфизма генов системы HLA при язвенном колите
3.3. Особенности полиморфизма генов системы HLA при болезни Крона
3.4. Особенности полиморфизма генов системы HLA при воспалительных заболеваниях кишечника
Заключение 101
Список сокращений 104
Список литературы 105
- Значение иммуногенетических факторов в развитии язвенного колита
- Методы исследования
- Особенности полиморфизма генов системы HLA при язвенном колите
- Особенности полиморфизма генов системы HLA при воспалительных заболеваниях кишечника
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК) относятся к воспалительным заболеваниям кишечника (ВЗК), при которых наблюдаются комплексные расстройства организма.
Распространенность язвенного колита в мире составляет от 5 до 500, болезни Крона – от 2 до 300 случаев на 100 тыс. населения [Белоусова Е.А., 2006; Ekbom A., 1991, 2004; Long, M., 2014; Molodecky N.A., 2012; Ponder A., 2013; Thia K., 2008], причем наиболее высокая встречаемость ЯК и БК отмечается в экономически развитых странах, низкая – в странах Азии и Южной Америки [Ekbom A. et al., 1991, 2004; Long, M. et al., 2014; Molodecky N.A. et al., 2012; Ponder A. et al., 2013; Thia K. et al., 2008].
В России, согласно немногочисленным исследованиям, данный показатель колеблется в диапазоне 3 – 20 случаев на 100 тыс. населения [Бодрягина Е.С. и др., 2013; Никулина И.В., 1997; Белоусова Е.А., 2006; Николаева Н.Н. и др., 2004; Ткачев А.В. и др, 2009].
Как известно, важная роль в иммунном ответе в целом, и в возникновении ЯК и БК в частности, принадлежит главному комплексу гистосовместимости (MHC), причем развитие обоих заболеваний носит мультифакториальный характер. К настоящему времени проведено значительное количество исследований, связывающих указанные заболевания с определенными генами HLA-системы. Так, исследователями из разных стран, в числе которых США et al., 2003], Канада [Silverberg M.S. et al., 2003], Испания [Fernandez, L. et al., 2004], Финляндия [Lappalainen M. et al., 2008], была подтверждена связь аллеля HLA-DRB1*0103 как с развитием БК и ЯК в целом, так и с характером течения заболеваний и их осложнений. Во многих работах показано существование ассоциации HLA-DRB1*1502 с развитием ЯК [Fisher S.A. et al., 2008; Stephen A. et al., 2011].
В Израиле установлена взаимосвязь развития БК с DR15 [GulwaniAkolkar B. et al., 2006], в Германии – с HLA-DRB1*0701 [Адлер Г., 2001], в Китае – с HLA-Cw*12 et al., 2011], в Японии – с HLA-DRB1*0405 и 0410 [Kawasaki A. et al., 2000]. В Великобритании ЯК ассоциирован с HLA-DRB1*103, HLA-DRB1*12 et al., 1996], в Голландии - с HLA-DRB1*15 [Bouma G. et al.,1997], в Китае - с HLA-DRB1*07 и HLA-Cw*07 et al., 2003; et al., 2011], в Корее – с HLA-DR2 и DRB1*1502 [Stephen A. et al., 2011]. В ряде исследований оценивалась не только предрасположенность к заболеванию, но и к определенным его формам. Так, в Италии установлена ассоциация DRB1*0304, DRB1*0305, DRB1*0307, DRB1*0309 с тотальным поражением толстой кишки et al., 2005], в Испании HLA-DRB1*07 – с терминальным илеитом при БК и HLA-DRB1*0103 – с колитом [Fernandez, L. et al., 2004].
В России подобного рода исследований крайне мало, и они, в основном, проводились с использованием серологических методов типирования. Согласно полученным результатам, развитие ЯК ассоциировано с Cw4, DR3, DR5 [Морозова Н.А.,1997], B13 и Cw4 [Белоусова Е.А., 1998], DRB1*01 [Лоранская И.Д. и др., 2001], A29, B13, DR3 [Павленко В.В., 2003], БК – с B14 и A3 [Морозова Н.А.,1997], В18 и DRB1*01 [Лоранская И.Д. и др., 2001]. При исследовании ЯК и БК были выявлены общие положительные ассоциации с B14, DR3 и DR5 [Морозова Н.А., 1997; Белоусова Е.А.,1998].
Степень разработанности темы
Несмотря на многочисленные исследования иммуногенетической
предрасположенности к возникновению ЯК и БК, сведения о роли антигенов HLA в патогенезе данных заболеваний противоречивы и требуют дальнейшего изучения, причем обращает на себя внимание тот факт, что полученные данные имеют выраженную этническую специфичность. В этой связи следует отметить, что недостаточно полно охарактеризованы частота среди больных ВЗК Московского региона различных аллельных групп системы HLA, их связь с клиническими формами ЯК и БК, тяжестью течения указанных заболеваний, с возрастом и полом пациентов и ответом на проводимую терапию.
Цель исследования
Изучить иммуногенетические маркеры предрасположенности и протекции к развитию язвенного колита и болезни Крона у взрослого славянского населения Московского региона.
Задачи исследования
-
Изучить встречаемость различных аллельных групп генов HLA среди проживающих в Московском регионе славян, страдающих язвенным колитом.
-
Выявить ассоциации между группами аллелей HLA и предрасположенностью к развитию ЯК, клинической формой, степенью тяжести заболевания и ответом на проводимую терапию, полом и возрастом пациентов.
-
Изучить встречаемость различных аллельных групп генов HLA среди славян с болезнью Крона, проживающих в Московском регионе.
-
Исследовать распределение групп аллелей HLA в зависимости от клинической формы БК, степени тяжести заболевания и ответа на проводимую терапию, пола и возраста пациентов.
-
Выявить HLA-маркеры предрасположенности и протекции к развитию ВЗК у взрослого славянского населения Московского региона.
Научная новизна работы
Впервые с применением технологии генотипирования проведено изучение полиморфизма генов HLA I и II классов у пациентов с ЯК, БК и в общей группе больных ВЗК славян, проживающих в Московском регионе.
Впервые исследовано распределение генов HLA I и II классов в группах пациентов с ЯК, БК и ВЗК в зависимости от клинической формы, тяжести течения заболевания, ответа на гормональную терапию, возраста и пола больных.
Впервые установлено, что группы аллелей А*26, B*38 и С*12 являются общими маркерами предрасположенности к развитию ЯК и ВЗК у женщин старше 35 лет. Впервые показана связь группы аллелей В*52 с развитием ЯК и ВЗК в возрасте до 35 лет, В*56 отнесен к маркерам развития ВЗК в возрасте после 35 лет. Показана ассоциация В*58 с ЯК.
Впервые выявлено, что с развитием БК у женщин ассоциирована группа аллелей С*12. Впервые охарактеризованы маркеры различных форм БК. Показано, что характерными маркерами стриктурирующего типа БК являются В*38 и А*11. Маркерами нестриктурирующего, непенетрирующего типа являются группы аллелей С*14 и В*56. С*14 ассоциирована также с развитием БК у мужчин.
Впервые установлено, что маркерами протекции к развитию ЯК являются группы аллелей В*15, C*04 и DQB1*02, причем В*15 выступает маркером протекции к
развитию ЯК у мужчин, DQB1*02 – у лиц младше 35 лет. Установлено, что группа аллелей DRB1*07 отрицательно ассоциирована с развитием ВЗК у мужчин, DQB1*02 – с развитием ВЗК у мужчин младше 35 лет. Впервые определены характерные маркеры протекции, в частности, к развитию ВЗК им является С*03, к тяжелому течению БК – DQB1*03.
Впервые показано, что при наличии в генотипе групп аллелей А*26, В*38 возрастает вероятность развития рефрактерных к гормональной терапии форм ВЗК и ЯК, также характерными маркерами рефрактерности к гормональной терапии являются С*17 при ЯК и С*07 при ВЗК. Впервые установлено, что DRB1*07 является маркером протекции к развитию гормональной рефрактерности при ВЗК и ЯК, а С*06 – характерным маркером протекции к гормональной рефрактерности при ВЗК.
Впервые к маркерам восприимчивости к гормональной терапии отнесены В*52, В*56 и С*12 при ВЗК, В*52 и В*58 при ЯК, С*12 при БК. Впервые выявлен характерный маркер гормональной восприимчивости к терапии при ВЗК - DQB1*04. Установлено, что DQB1*02 отрицательно ассоциирована с развитием восприимчивых к гормональной терапии форм ЯК и ВЗК.
Впервые установлено, что развитие хронического непрерывного течения ВЗК и ЯК ассоциировано с А*26 и B*38, DRB1*14 является характерным маркером хронического непрерывного течения ЯК. Показано, что маркерами протекции к хроническому рецидивирующему течению ВЗК являются С*04 и DQB1*02, к данной форме БК -DQB1*02.
Маркером тотального колита при ЯК можно считать А*26 и B*38, характерным маркером левостороннего колита при ЯК – В*56.
Теоретическая и практическая значимость
На основании полученных в рамках представленного исследования данных установлены HLA-маркеры протекции и предрасположенности к возникновению как ЯК и БК, так и ВЗК в целом, которые будут способствовать более точному формированию групп риска, а также установлению диагноза на начальных стадиях соответствующего заболевания.
Иммуногенетические особенности, выявленные при разных клинических формах ВЗК, ЯК и БК позволят прогнозировать течение, степень тяжести заболевания, развитие рефрактерности к гормональной терапии с коррекцией тактики лечения пациентов.
При сравнении частоты групп аллелей HLA I и II класса в группах взрослых здоровых доноров и новорожденных Московского региона достоверных различий выявлено не было, что позволяет использовать образцы пуповинной крови в качестве контрольной группы при проведении генетических исследований HLA-системы взрослых пациентов.
Методология и методы диссертационного исследования
Для выявления иммуногенетических маркеров при язвенном колите и болезни Крона проводилось HLA-генотипирование методом SSO (Sequence Specific Oligonucleotides) c применением технологии LIFECODES и мультиплексного проточного анализатора Luminex. Образцы, при исследовании которых были получены двойные интерпретации при использовании метода SSO, были типированы методом ПЦР-SSP (Sequence Specific Primer). Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программного обеспечения Microsoft Excel, Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health («Open Epi»), версия 3.01 от 2013/04/06.
Положения, выносимые на защиту
1. Распределение аллельных групп генов HLA среди пациентов с ЯК, БК и ВЗК
Московского региона отличается от их распределения среди здорового населения того
же региона.
2. Изучение особенностей генетического полиморфизма HLA-системы у пациентов
с ЯК, БК и ВЗК позволяет выявить генетические маркеры предрасположенности к
указанным заболеваниям у славянского населения Московского региона.
3. Существует ряд иммуногенетических маркеров предрасположенности и
протекции к развитию ЯК, БК и ВЗК у славянского населения Московского региона,
зависящих от пола и возраста и ассоциированных с определенной клинической формой,
течением, степенью тяжести заболевания, а также ответом на гормональную терапию.
4. При ВЗК имеются как общие для ЯК и БК иммуногенетические маркеры, так и
специфичные для каждого заболевания.
Степень достоверности
Достоверность результатов исследования подтверждается объемом фактического материала (9685 исследований, 1937 образцов), применением современных технологий генотипирования и использованием методов статистической обработки данных, полностью соответствующих поставленным задачам.
Апробация результатов диссертации
Материалы диссертации доложены на VI научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» (Москва, 23 – 24 мая, 2013 г.), 27-ой Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (The 27th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference, Poster Presentations, Маастрихт, Нидерланды, 11 – 14 мая, 2013 г.), заседании кафедры биологии и общей генетики медицинского института РУДН (2015 г.).
Внедрение результатов в практику
Результаты исследования внедрены в работу Государственного Бюджетного Учреждения Здравоохранения «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы», реорганизованного 23.10.2013г. согласно приказу ДЗМ №327 от 27.03.2013г. в Государственное Бюджетное Учреждение Здравоохранения «Станция переливания крови Департамента здравоохранения г. Москвы», и Центрального Научно-исследовательского института гастроэнтерологии г. Москвы (в настоящее время ГБУЗ Московский Клинический Научно-практический Центр).
Публикации результатов исследований
По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 5 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационных исследований.
Структура и объем диссертации
Значение иммуногенетических факторов в развитии язвенного колита
Об участии микроорганизмов в запуске иммунного или аутоиммунного ответа свидетельствует обнаружение в крови больных антител к некоторым микроорганизмам (Chlamydia trachomatis, Candida albicans) и компонентам бактериальных клеток (порину внешней мембраны Escherichia coli – Omp С (outer membrane porin С) и I2 – антигену Pseudomona fluorescens, гликанам бактериальной стенки АККА (АССА – anti - chitobisoside carbohydrate antibodies), АЛКА (ALCA – anti laminaribioside carbohydrate antibodies) и АМКА (АМСА – anti mannobioside carbohydrate antibodies) [18, 66, 81, 140]. Другим доказательством определенного вклада микроорганизмов в развитие воспаления в кишечнике являлись эксперименты на трансгенных животных, у которых в обычных условиях было смоделировано развитие колита или энтероколита [162, 171, 173]. При содержании животных в стерильных условиях, препятствующих заселению кишечника микроорганизмами, либо стерилизации кишечника антибактериальными препаратами воспаление не развивалось или было выражено в меньшей степени [1, 18, 120, 163].
При БК обнаруживаются отклонения во многих звеньях иммунной системы [77, 90]. Так, у больных снижен метаболический потенциал фагоцитов. В связи с этим рецидив заболевания и распространение патологического процесса связывают со снижением активности и интенсивности фагоцитоза [18, 28]. Отмечено изменение активности митохондриальных ферментов лимфоцитов при БК и корреляция ферментного статуса лимфоцитов с активностью заболевания [30]. В исследованиях системы комплемента отмечено повышение уровня некоторых ее компонентов в крови, а также отложение компонентов системы комплемента и иммунных комплексов в стенке кишечника [18].
В клеточном звене иммунитета наблюдаются колебания численности субпопуляций лимфоцитов: возрастает количество активированных Т-лимфоцитов, нарушается соотношение CD4+ (хелперов) и CD8+ (цитотоксических клеток, супрессоров) лимфоцитов [60]. В стенке кишечника увеличивается число антигенпредставляющих клеток – макрофагов и дендритных клеток [18, 29, 66, 72].
Изменения клеточного состава закономерно отражаются на содержании цитокинов, что в свою очередь, обусловливает изменение дифференцировки различных иммунокомпетентных клеток, наблюдающееся при воспалительных заболеваниях кишечника [1, 60, 72]. При БК дисбаланс в системе цитокинов проявляется изменением уровня интерлейкинов (ИЛ): повышением ИЛ –1 альфа, ИЛ-6, ИЛ–8, ФНО (фактор некроза опухоли) – альфа, ИЛ-10 и снижением содержания ИЛ-4 и ИЛ-2 [9, 137, 153].
Во многих исследованиях у больных БК отмечается нарушение продукции различных классов иммуноглобулинов: снижение секреторного иммуноглобулина (Ig) А, являющегося основным иммуноглобулином слизистой желудочно-кишечного тракта, и увеличение IgG и IgM. В основе этих явлений лежит изменение количества клеток, продуцирующих соответствующие иммуноглобулины, в слизистой оболочке кишечника. Снижение уровня IgA свидетельствует о недостаточности местного иммунитета в стенке кишечника, а повышение IgG – о повышенной проницаемости ее для чужеродных агентов. Указанные изменения являются звеном воспалительного процесса и, вероятнее всего, они вторичны [18, 22, 60, 66].
Достаточно интересны и другие иммунологические феномены, к которым относятся появление некоторых антител и экспрессия аутоантигенов в стенке кишечника [60]. У больных БК часто (до 60% случаев) обнаруживаются антитела к Saccharomyces cerevisiae (пекарским и пивным дрожжам) – ASCA (anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies), и более редко (до 20-40% случаев) – антитела к перинуклеарным нейтрофильным антигенам – pANCA (perinuclear anti - neutrophil cytoplasmic antibody). Уровень антител коррелирует как с локализацией и протяженностью поражения, так и с активностью заболевания [18, 37]. Установлена достаточно высокая чувствительность и специфичность совместного определения данных групп антител, что может использоваться в дифференциальной диагностике БК и язвенного колита как между собой, так и с другими заболеваниями, однако в настоящее время данные тесты не являются критериями диагностики [32, 52, 68, 169]. Большое внимание отводится поискам генетических факторов, вовлеченных в развитие БК [14, 97, 133167].
Во многих исследованиях определены локусы IBD (Inflammatory bowel disease) 1 на 16-й, IBD 2 на 12-й, IBD 3 на 6-й, IBD 5 на 5-й хромосомах, где обнаружены гены, которые могут определять предрасположенность к ВЗК. Гены предрасположенности обнаружены и на других хромосомах [87, 101, 121, 167].
Как в зарубежной, так и в отечественной литературе наибольшая ассоциация с заболеванием показана для гена CARD15/NOD2 (Caspase recruitment domain-containing protein 15/Nucleotide-binding oligomerization domain containing 2), расположенного на 16-й хромосоме в пределах локуса IBD 1 [18, 145]. Данный ген кодирует белок, участвующий в распознавании компонентов бактериальной клетки, запуске и регуляции иммунных и воспалительных реакций на внедрение чужеродных микроорганизмов. Как считается, мутации в гене CARD15/NOD2 приводят к недостаточной бактерицидной активности слизистой кишечника, что, в свою очередь, способствует проникновению патогенов в слизистую, а также неадекватной стимуляции иммунокомпетентных клеток [18, 90, 145]. Во многих исследованиях показана связь БК, его различных форм течения и осложнений с наличием определенных аллелей указанного гена [60]. Данные полиморфные варианты гена CARD15/NOD2 встречаются у 30-70% пациентов с БК [145].
Большинство исследований, подтверждающих роль мутаций в данном гене в возникновении и прогрессировании БК, проведено в Северной Америке и Европе [82, 89, 169, 190]. Результаты, полученные в России, показывают, что риск заболевания возрастает от 2-4 до 20-40 раз в зависимости от вида и количества обнаруживаемых полиморфных вариантов [38, 42, 45, 78]. Однако оказалось, что полиморфизм гена CARD15/NOD2 не связан с БК в азиатских и африканских популяциях [123, 145].
Методы исследования
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программного обеспечения Microsoft Excel, Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health («OpenEpi»), версия 3.01 от 2013/04/06.
С целью выявления возможной взаимосвязи между наличием в генотипе каких-либо групп аллелей HLA и возникновением ЯК, БК, ВЗК в целом и некоторых форм течения заболеваний, в частности, было выполнено исследование по типу «случай – контроль». Как «случай» были определены образцы периферической крови пациентов с установленным диагнозом БК или ЯК. «Контроль» представлен образцами пуповинной крови здоровых новорожденных доноров пуповинной крови. Предполагаемым этиологическим фактором, связанным с развитием заболевания, являлось наличие в генотипе больных БК и ЯК и в контрольной группе определенных групп аллелей HLA, т.е. в каждой из групп определены носители и не носители исследуемых групп аллелей HLA [96].
Группы аллелей, встречающиеся достоверно чаще у больных ЯК, БК и ВЗК были определены как маркеры предрасположенности к развитию заболеваний, а встречающиеся достоверно реже – как маркеры протекции к заболеваниям.
Также группы аллелей HLA, отрицательно или положительно ассоциированные с развитием заболевания в нескольких группах, представлены как общие маркеры протекции или предрасположенности, соответственно. Группы аллелей HLA, отрицательно или положительно ассоциированные с развитием заболевания в конкретной группе пациентов, представлены как характерные маркеры протекции или предрасположенности, соответственно. Для оценки взаимосвязи между наличием определенных групп аллелей HLA в генотипе и развитием заболеваний были рассчитаны следующие показатели и применены следующие статистические критерии:
1. Частота групп аллелей HLA, выраженная в долях и рассчитанная как отношение количества положительных исходов (в нашем случае - количество случаев, где встретилась исследуемая группа аллелей HLA, причем при наличии исследуемой группы аллелей в гомозиготном состоянии показатель умножался на 2) к общему количеству испытаний (в нашем случае - к количеству исследованных по данной группе аллелей HLA образцов, умноженному на 2 ввиду диплоидности). f = n / 2N, где: п - количество случаев, где выявлена исследуемая группа аллелей HLA (в гомозиготном состоянии показатель умножен на 2); N - общее количество исследованных образцов по данной группе аллелей HLA; f - частота группы аллелей, в долях; 2. Сформулирована нулевая гипотеза об отсутствии различий в частоте групп аллелей HLA в долях между исследуемой и контрольной группами. 3. Для сравнения долей и, таким образом, для проверки нулевой гипотезы, применен критерий z, рассчитываемый по формуле:
Учитывая, что нормальное распределение непрерывно, а критерий z имеет дискретные значения, применена поправка Йейтса (Yates), или поправка на непрерывность. При этом формула для расчета критерия z имеет вид: 1 где pi и p2 - выборочные доли; щ и п2-объемы двух выборок. При np и n(1 - p) менее 5 критерий z неприменим, в этом случае использовался точный критерий Фишера. 4. Был принят уровень значимости р0,05, при котором критическое значение z составляет 1,96. При получении в наших исследованиях значения z больше критического значения z при р0,05, нулевая гипотеза об отсутствии различия долей отвергалась, и различия принимались как статистически значимые. 5. Для оценки характера влияния прогностических факторов применена таблица сопряженности, или таблица «2 х 2», и рассчитан критерий 2 с поправкой Йейтса. Если ожидаемое число в одной из клеток было меньше 5, применялся точный критерий Фишера. Таблица «2 х 2» имела следующий вид:
Прогностический Заболевание БК или ЯК ВСЕГО фактор (группа аллелей HLA) Наличие заболевания Заболевание отсутствует Исследуемая группа аллелей HLA присутствует в генотипе Группа аллелей HLAприсутствует у больных ВЗК (n человек) (A) Группа аллелей HLAприсутствует у здоровых (n человек) (B) Всего с наличием группы аллелей HLA
Исследуемая группа аллелей HLA отсутствует в генотипе Группа аллелей HLA отсутствует у больных ВЗК (n человек) (C) Группа аллелей HLA отсутствует у здоровых (n человек) (D) Всего с отсутствием группы аллелей HLA ВСЕГО Всего больных Всего здоровых Всего исследовано 6. Расчет показателя отношения шансов (ОШ) и 95% доверительного интервала (ДИ) проводился в случае, если для исследуемой группы аллелей HLA различия долей оказывались статистически значимыми (при р0,05) т.е. если отвергалась нулевая гипотеза. Отношение шансов (ОШ) определяли по следующей формуле: 95% доверительный интервал (ДИ) для ОШ рассчитывали по формуле:
Показатель ОШ отражает шансы развития заболеваний (БК, ЯК или ВЗК) при наличии или отсутствии исследуемой группы аллелей HLA. При значении ОШ более 1 группа аллелей HLA положительно ассоциирована с развитием заболевания, если значение показателя колеблется в пределах от 0 до 1, группа аллелей HLA отрицательно ассоциирована с развитием заболевания, т.е. имеется связь данной группы аллелей HLA с протективными свойствами к развитию заболевания. При ОШ, равном 1, связь развития заболевания с наличием данной группы аллелей HLA отсутствует [20, 49, 50, 100].
На начальном этапе исследования было изучено распределение генов HLA I и II классов в контрольных группах. Первая контрольная группа, представленная взрослыми здоровыми донорами, была разделена на подгруппы по полу (60 женщин и 59 мужчин, средний возраст составил 37,44±7,5 лет) и по возрасту (младше 35 лет - 28 мужчин и 30 женщин; старше 35 лет - 31 мужчина и 30 женщин). При сравнении частоты групп аллелей HLA I и II классов в контрольной группе достоверных отличий между исследуемыми подгруппами выявлено не было.
Так как полученные данные показали, что распределение групп аллелей HLA I и II класса достоверно не различается у представителей разного пола и в разных возрастных группах, стало возможным объединить эти подгруппы в одну контрольную группу взрослых здоровых доноров Московского региона.
Далее было проведено сравнение полученных данных с соответствующими показателями в группе здоровых новорожденных доноров пуповинной крови Московского региона (вторая контрольная группа). Статистически значимых отличий обнаружено не было (таблица 1).
Особенности полиморфизма генов системы HLA при язвенном колите
Диагностика ЯК после 35-летнего возраста коррелирует со значимым повышением частоты групп аллелей HLA А 26, В 38 и С 12, причем наличие С 12 увеличивает риск заболеть ЯК в 2,4 раза, В 38 – в 3,3, А 26 – в 3,5 раз по сравнению с контрольной группой.
Обобщенные данные по HLA-маркерам предрасположенности и протекции к ЯК в исследованных группах приведены в таблице 9. Опираясь на полученные результаты, можно заключить, что общими иммуногенетическими маркерами предрасположенности к развитию ЯК у женщин старше 35 лет, а также к хроническому непрерывному течению ЯК являются группы аллелей А 26, В 38, C 12. Маркерами предрасположенности к развитию ЯК является также В 58, а у населения в возрасте младше 35 лет – В 52. Иммуногенетическими маркерами предрасположенности к тотальному поражению кишечника и к гормональной рефрактерности при ЯК выступают А 26 и В 38. Характерным маркером предрасположенности к хроническому непрерывному течению ЯК является DRB1 14, к гормональной рефрактерности при ЯК – С 17. С поражением при ЯК левых отделов ободочной кишки ассоциирована В 56, со среднетяжелым течением – А 26, с восприимчивостью к гормональной терапии – В 52 и В 58. Маркерами протекции к ЯК являются В 15, C 04, DRB1 07, DQB1 02; у мужчин – В 15; у населения в возрасте младше 35 лет –DQB1 02; к среднетяжелому течению заболевания – DRB1 07 и DQB1 02; к гормональной рефрактерности – DRB1 07 и к ЯК с восприимчивостью к гормональной терапии – DQB1 02 [63]. Таблица 9 HLA – маркеры предрасположенности и протекции к ЯК в исследованных группах Группа ОШ аллелей HLA Общаягруппа сЯКn= 65 Тотальныйколитn= 37 Левостороннийколитn= 25 НепрерывноетечениеЯКn= 27 СреднетяжелоетечениеЯКn= 57 Рефрактерные кгормональнойтерапиипри ЯКn= 22 Восприимчивые кгормональнойтерапиипри ЯКn= 43 Мужчиныn= 34 Женщиныn= 31 Младше 35 лет n= 36 Старше 35 лет n= 29
На первом этапе изучения характера распределения групп аллелей HLA у больных БК исследование проводилось в общей группе пациентов (n=53). Данные, полученные в исследуемой и контрольной группах, представлены на рисунке 10 и в таблице 10.
Как видно из полученных результатов, группа аллелей С 12 встречается достоверно чаще у пациентов с БК, чем в контрольной группе, увеличивая вероятность развития заболевания в 2,2 раза.
По аналогии с описанным ранее исследованием, выполненным среди больных язвенным колитом, было проведено сравнение встречаемости групп аллелей HLA у пациентов с илеоколитом при БК и в контрольной группе, при этом статистически значимых отличий выявлено не было. Группы пациентов с колитом (п=16) и терминальным илеитом (п=12) не оценивались по причине их малочисленности.
В представленном исследовании было проведено сравнение встречаемости групп аллелей HLA у пациентов с хроническим непрерывным течением и с хроническим рецидивирующим течением с соответствующими показателями в контрольной группе. Достоверных отличий от контроля в подгруппе больных с хроническим непрерывным течением БК не обнаружено.
У пациентов с хроническим рецидивирующим течением заболевания значимо чаще, чем в контроле встречается группа С 12, в то время как DQB1 02 – достоверно реже (рисунок 11 и таблица 11).
Характер распределения групп аллелей HLA изучался также в подгруппах пациентов с БК, разделенных по тяжести течения заболевания. Подгруппа пациентов с легким течением БК не оценивалась из-за малочисленности (n = 3).
При сравнении подгрупп пациентов с тяжелым и среднетяжелым течением БК с контрольной группой выявлен ряд иммуногенетических особенностей, представленных на рисунке 12 и в таблице 12.
Особенности полиморфизма генов системы HLA при воспалительных заболеваниях кишечника
Маркерами восприимчивости к гормональной терапии служат группы аллелей В 52 (при ВЗК и ЯК), С 12 (при ВЗК и БК), В 56 и DQB1 04 (при ВЗК), В 58 (при ЯК). DQB1 04 является характерным маркером гормональной чувствительности при ВЗК. Маркером протекции к развитию чувствительной к гормональной терапии формы ВЗК и ЯК, в частности, можно считать DQB1 02.
Относительно ассоциации групп аллелей HLA с тяжестью и характером течения заболеваний выявлены следующие закономерности. Группа аллелей DQB1 03 при БК достоверно реже выявляется у пациентов с тяжелым течением заболевания и является характерным маркером протекции к данной форме БК. Группы аллелей С 04, DRB1 07, DQB1 02, отрицательно ассоциированные со среднетяжелым течением ВЗК, и DRB1 07 и DQB1 02 отрицательно ассоциированные с этой же формой течения ЯК, отражают общие протективные свойства данных групп аллелей к заболеваниям в целом. Маркерами предрасположенности к среднетяжелому течению ВЗК, как и к ВЗК в общем, могут являться В 38, В 56 и С 12. С 12 ассоциирован с этой же формой течения БК. Достоверное увеличение частоты указанных групп аллелей именно в этих подгруппах пациентов, возможно, объясняется тем, что пациенты со среднетяжелым течением заболеваний составляют большинство в проведенном исследовании.
Группа аллелей DRB1 14 является характерным маркером хронического непрерывного течения ЯК. Группы аллелей A 26 и B 38, ассоциированные с хроническим непрерывным течением ЯК и ВЗК, отражают ассоциацию данных групп аллелей с предрасположенностью к ЯК и ВЗК в общем. Аналогичные закономерности обнаружены при хроническом рецидивирующем течении, где группы аллелей DQB1 02 при ВЗК и БК, и С 04 при ВЗК отрицательно ассоциированы с данной формой течения заболеваний и заболеваниями в общем.
Также выявлено, что группа аллелей А 26 достоверно чаще встречается при тяжелом течении ВЗК и, в то же время, при среднетяжелом течении ЯК. Аналогичная ситуация наблюдается в отношении группы аллелей С 12, которая ассоциирована как с тяжелым, так и со среднетяжелым течение ВЗК, и со среднетяжелым течением БК. Также С 12 ассоциирована с хроническим непрерывным течением ЯК и ВЗК, а в случае БК данная группа аллелей ассоциирована с хроническим рецидивирующим течением. Указанные явления могут объясняться потенциально прогрессирующим течением заболеваний, приводящим без лечения к утяжелению состояния и сокращению ремиссий вплоть до постоянного наличия симптомов заболевания. Вместе с тем, при ранней диагностике заболевания и применении современных методов лечения удается добиться стихания воспалительного процесса, наступления ремиссии заболевания, что, соответственно, обусловливает возможность отнесения пациента к иной клинической группе. Исходя из вышесказанного, использование групп аллелей А 26 и С 12 в качестве маркеров соответствующих форм течения заболевания затруднительно. Тем не менее, достоверно более высокая частота А 26 и С 12 у данных групп пациентов подтверждает их ассоциацию с заболеваниями в целом и позволяет отнести данные маркеры к общим маркерам предрасположенности к ЯК, БК и ВЗК, соответственно.
У женщин выявлены значительные положительные ассоциации групп аллелей А 26 и В 38 с возникновением ВЗК и ЯК, а С 12 – с возникновением ВЗК, ЯК и БК. У мужчин маркером предрасположенности к ВЗК является группа аллелей В 52, к БК – С 14. Маркерами протекции к ВЗК у мужчин могут служить DRB1 07 и DQB1 02, к ЯК – В 15.
С развитием и выявлением ВЗК и ЯК в возрасте младше 35 лет обнаружена положительная ассоциация группы аллелей В 52. Маркером протекции к возникновению ВЗК и ЯК в данной возрастной группе можно считать DQB1 02. Группы аллелей А 26, В 38 и С 12 ассоциированы с развитием и выявлением ВЗК и ЯК в возрасте старше 35, в то время как В 56 маркирует позднее развитие ВЗК в целом.
Таким образом, A 26, B 38 и C 12 можно отнести к маркерам предрасположенности к развитию ЯК и ВЗК у женщин старше 35 лет, B 52 – к маркерам предрасположенности к развитию ВЗК у мужчин до 35 лет. DQB1 02 является маркером протекции к развитию ВЗК у мужчин до 35 лет [61, 62, 63, 64].
Следует обратить внимание на следующую особенность: некоторые группы аллелей HLA проявили ассоциацию только с объединенной группой больных ВЗК, в то время как в группах пациентов с ЯК и БК достоверных ассоциаций этих групп аллелей не отмечено. Однако имеется тенденция к появлению различий в частоте групп аллелей HLA в опытных и контрольной группах, не достигшая статистической достоверности. Так, В 52 отнесен к маркерам предрасположенности к ВЗК (р = 0,021) и встречается чаще при ЯК (р = 0,09) и у мужчин с БК (р = 0,08). В 56 также ассоциирован с предрасположенностью к ВЗК и встречается недостоверно чаще при БК (р = 0,08) и у женщин при ЯК (р = 0,07). С 07 достоверно чаще встречается при рефрактерности к гормональной терапии при ВЗК (р = 0,04), и также имеется тенденция к увеличению частоты данной группы аллелей у больных с гормональной рефрактерностью к терапии при БК (р = 0,09). Аналогичная ситуация наблюдается в отношении группы аллелей DQB1 04, достоверно чаще встречающейся при восприимчивости к гормональной терапии у больных ВЗК (р = 0,03), и недостоверно чаще – при этой же форме ЯК (р = 0,07). При рефрактерности к гормональной терапии при ЯК С 06 встречается недостоверно реже (p = 0,055), в то время, как в такой же группе больных с ВЗК уровень достоверности был достигнут (p = 0,013). С 03, выделенный как маркер протекции к ВЗК (р = 0,04), встречается реже, однако также недостоверно, при БК (р = 0,09). Таким образом, можно утверждать, что указанные группы аллелей HLA ассоциированы с патогенезом ВЗК в целом, и БК и ЯК имеют общие черты патогенеза. Вышесказанное нашло отражение при анализе группы больных ВЗК, когда после объединения подгрупп тенденции к увеличению или уменьшению частоты некоторых групп аллелей HLA были подтверждены, т.е. уровень достоверности в различиях был достигнут. Таким образом, В 52, В 56, С 07, DQB1 04, С 06 и С 03 могут быть отнесены к маркерам предрасположенности или протекции к ВЗК, рефрактерности или восприимчивости к гормональной терапии при ВЗК [61, 62, 63, 64].
Несмотря на многочисленные исследования, механизм участия HLA системы в возникновении ЯК и БК окончательно не выяснен. Наиболее распространена теория о нарушении иммунологической толерантности к собственным антигенам через аберрантную презентацию Т-лимфоцитам в составе молекул HLA собственных пептидов или чужеродных пептидов, на которые не должен развиваться иммунный ответ [58, 69, 95, 112]. Вероятно, имеет место наличие общего иммуногенного эпитопа у микроорганизмов и человека, а так же хроническая внутриклеточная инфекция, в том числе вирусная [116, 156, 162, 165]. В итоге может происходить презентация антигена, схожего с собственным, или измененного аутоантигена, в составе молекул HLA Т-лимфоцитам и запуск каскада аутоиммунных реакций [56, 79, 107, 188]. От уникального набора HLA-антигенов может зависеть характер иммунного ответа, а также вероятность развития аутоиммунной агрессии [62, 70, 110, 122, 151].