Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение процессов транскрипции в отдельных районах хромосом - один из важнейших аспектов общей проблемы экспрессии генетического материала. Удобной моделью для исследования структурно-функциональной организации интерфазных хромосом эукариот являются политенные хромосомы личиночных тканей Diptera, морфологическая дифференциация которых отражает различное функциональное состояние хромосомных локу-сов. Центральное место в етой проблеме занимает вопрос о взаимосвязи процессов деконденсации и транскрипции. Применение различных подходов в исследовании транскрипционной активности политенных хромосом двукрылых показало, что в синтезе РНК участвуют районы, деконденсированные в различной мере. Преимущественное положение среди методов изучения занимает метод иммунофлуоресцентной локализации гибридов ДНК-РНК, основанный на выявлении гибридных молекул между хромосомной ДНК и эндогенными молекулами РНК, находящимися в локусе их синтеза. Такие молекулы обнаруживаются с помощью специфической антисыворотки против синтетических .ибридов po\y(A)xpoly{dT) (Stol-lar, 1970, 1975; Colby et al.. 1971: Kitagawa, Stollar, 1982; Roap et al., 1984). Применение поли- и моноклональных антисывороток на гибриды ДНК-РНК показало, что гибриды присутствуют на фиксированных препаратах политенных хромосом Dlptera и их распределение носит стадиеспецифический характер, коррелируя с изменениями в пуфовой картине (Rudkin, Stollar, 1977; Alco-ver et al., 1982; BUsen et al., 1982; Lezzi et al., 1989). В своих исследованиях авторы в основном анализировали районы крупных пуфов. Что касается Droaophlla melanogaster. которая является наиболее исследованным на молекулярно-цитологи-ческом уровне модельным объектом, то в литературе практически отсутствуют данные о закономерностях распределения гибридов ДНК-РНК в различных районах политенных хромосом в сравнении с другими характеристиками транскрипционной активности. Кроме того не изучены картины стадиеспецифического распределения гибридов ДНК-РНК в период смены генетических программ под действием гормона экдистерона. В этом плане возникает необходимость исследования стадиеспецифического распределения гибридов ДНК-РНК в нормальном развитии дрозофилы и у мутантов с различными гормональными нарушениями. Так, у мутантов
1(1 )t435 утрачена чувствительность клеток к гормону и транс-крипционно активные районы в основном представлены малыми пуфами (районами, деконденсация которых не увеличивает диаметра хромосомы). У экдистерон-недостаточных мутантов l(3)tl с "удлиненной" личиночной жизнью, политенные хромосомы сокращаются по длине и разрыхляются, теряя дисковый рисунок. Исследование иммунофлуоресцентной локализации гибридов ДНК-РНК в нормальных и мутантных хромосомах дрозофилы приближает нас к пониманию механизмов экспрессии генетического материала на транскрипционном уровне.
Цели и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования является выявление корреляции между степенью девонденсации хромосомного материала и количеством гибридов ДНК-РНК, характеризующих его транскрипционные свойства. Для этого поставлены следующие конкретные задачи:
-
Провести серию контрольных экспериментов по выявлению специфичности реакции обнаружения гибридов ДНК-РНК на цитологических препаратах политенных хромосом Prosophila melanogas-ter.
-
Определить закономерности распределения гибридов ДНК-РНК в различных по морфологии районах политенных хромосом дрозофилы на одной фиксированной стадии развития и сравнить их с данными авторадиографического анализа по включению меченого уриди-на, полученными ранее.
-
Определить онтогенетический спектр изменений распределения гибридов ДНК-РНК в различных по морфологии районах 2R хромосомы Prosophila melanogaater.
-
Выявить влияние мутаций с гормональными нарушениями на характер распределения гибридов ДНК-РНК в политенных хромосомах мутантов JJjJt425. и: 1Щи_.
Научная новизна работы. Впервые проведено детальное картирование гибридов ДНК-РНК в различных по морфологии районах хромосом дрозофилы в сравнении, с авторадиографическими методами включения Н-уридина. Гибриды ДНК-РНК обнаруживаются в деконденсированных районах , и отсутствуют в черных плотных дисках. При этом интенсивность флуоресценции гибридов ДНК-РНК не всегда коррелирует со степенью деконденсации хромосомного материала и включением Н-уридина. Около 90* флуоресцентных
I - 2 -
полос и 50 радиоактивности приходится на малые пуфы. Несмотря на постоянство морфологии малых пуфов в половине этих районов свечение гибридов ДНК-РНК меняется в зависимости от титра экдистерона и онтогенетического возраста. В хромосомах мутантов с гормональными нарушениями обнаружены крупные пуфы, в которых отсутствует свечение гибридов ДНК-РНК.
Практическая ценность. Определена локализация транскрип-ционно активных районов политенных хромосом Drosophlla mela-nogaster на стадии 0-часовой предкуколки по данным иммунофлу-оресцентной локализации гибридов ДНК-РНК. Предложен способ идентификации хромосом с измененной морфологией с помощью гибридизации in aitu специфических клонов и продемонстрированы морфологические типы хромосом мутантов l(3)tl. Для получения хромосом с четким дисковым рисунком рекомендовано выращивать культуры мутантов l(3)tl при 18С.
Апробация работы. Материалы исследований доложены на 5-ом (г.Москва, 1983) и 7-ом (г.Москва, 1987) Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов"; 8-ом (г.Пущино, 1984) и 10-ом (г.Гродно, 1990) Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра"; 9-ой (Венгрия, 1985) Европейской конференции по генетике дрозофилы; 5-ом (г.Львов, 1987) Всесоюзном рабочем совещании по генетике дрозофилы.
Объем и структура работы. Работа изложена на 172 страницах, содержит 7 таблиц и 35 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 257 ссылки.