Введение к работе
Актуальность проблемы.
Исследование механизмов регуляции экспрессии генов - одна из центральных проблем современной молекулярной биологии. Ключевую роль в осуществлении большинства типов регуляции экспрессии генов играют так называемые факторы транскрипции, или белки, способные связываться с определенными участками ДНК, что приводит к изменению уровня транскрипции прилегащіх генов. К числу таких белков относятся и рецепторы стероидных гормонов.
Изучение структуры участков ДНК, опознаваемых белками-рецепторами, выявление их в глюкокортикоид-зависимых генах, выяснение их расположения относительно сайтов связывания других регуляторних белков, изучение их возмокного взаимодействия между собой,- все это ведет к пониманию молекулярных механизмов активации и репрессии гормон-зависимых генов.
Актуальность работа обусловлена также необходимостью функционального анализа секвенированных последовательностей ДНК генов, регулируемых глюкокортикоидами, и отсутствием удовлетворительных критериев'поиска сайтов связывания транскрипционных факторов (в т.ч. глюкокортикоидного рецептора) в них. Цель работыі Данная работа посвящена выявлению неизвестных ранее сайтов связывания глюкокортикоидного рецептора в глюко-кортикоид-регулируемых генах, изучению влияния их первичной структуры на эффективность связывания с рецептором и выяснению их способности функционировать в качестве глюкокортикоид-зависимых регуляторов транскрипции.
Научная новизна работы. В работе получены принципиально новые данные о том, что специфичность связывания глюкокортикоидного рецептора с ДНК определяется не только присутствием в ДНК общепринятого консенсуса, но и некими характерными особенностями его непосредственного нуклеотидного окружения. Эти данные легли в основу нового компьютерного метода поиска сайтов связывания рецептора глюкокортикоидов, разработанного в Теоретическом Отделе ИЦИГ СО РАН. В данной работе были впервые экспериментально выявлены предсказанные данным методом сайты в генах металлотионеина I мыты (мМТІ) и цитохрома Р450е крысы. Было показано, что каждый из двух сайтов связывания рецептора глюкокортикоидов, выявленных в гене мМТІ, в изолированном виде может выполнять функции элементов глюкокортикоидного
ответа (GRE), способных под действием глкжокортиковдов усиливать экспрессию репортерного гена CAT, находящегося под контролем гетерологичного промотора.
Оказалось, однако, что промотор гена мМТІ, содержащий один из выявленных GRE в своем природном окружении, был практически нечувствительным к глюкокортикоидам. Результаты проведенного делеционного анализа этого района гена мМТІ говорят в пользу существования дополнительных регуляторних участков, влияющих на проявление функций этого GRE. Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные в работе результаты способствуют дальнейшему развитию представлений о структурно-функциональной организации генов. Они также имеют значение для разработки эффективных методов анализа последовательностей ДНК геномов живых организмов. Апробация работы. Результаты работы докладывались на I и II Всесоюзных конференциях "Геном человека" (1990, 1991, Перея-славль-Залесский) и Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторних систем" (1990, Таллин)
Структура диссертации. Диссертация изложена на 116 стр., она включает 16 рисунков и 1 таблицу, список цитированной литературы содержит 199 наименований. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, выводов.