Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Амилоиды и прионы – сходства и различия 13
1.1. Амилоиды 13
1.2. Прионы и их отличия от неинфекционных амилоидов 18
1.3.Функциональные и патологические амилоиды 27
1.3.1. Функциональные амилоиды 27
1.3.2. Патологические амилоиды 31
1.3.2.1. Системный амилоидоз АА 31
1.3.2.2. Латеральный склероз 32
1.3.2.3. Болезнь Альцгеймера 32
1.3.2.4. Болезнь Хангтингтона 36
1.4. Прионы 37
1.4.1. Прионы млекопитающих 37
1.4.1.1. Прионный белок PrP 37
1.4.1.2. Альфа – синуклеин 40
1.4.1.2.Белок tau 41
1.4.2. Прионы низших эукариот 42
1.4.2.1. Фактор [URE3] 44
1.4.2.2. Фактор [PSI+] 46
1.4.2.3. Фактор [PIN+] 48
1.4.2.4. Фактор [SWI+] 49
1.4.2.5. Факторы [ISP+], [MOT3+], [OCT+] и [MOD+] 50
1.4.2.6. Факторы [] и [GAR+] 52
1.4.2.7. Фактор [Het-s] мицелиального гриба Podospora anserina 53
1.4.3. Функциональная значимость прионов 55
1.5. Взаимодействие прионов и амилоидов и влияние амилоидогенеза на регуляцию протеомных сетей
1.6. Фундаментальные и методологические проблемы в исследовании прионов и амилоидов 65
ГЛАВА 2. Материалы и методы 68
2.1. Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования 68
2.2. Плазмиды 76
2.3. Методы дрожжевой генетики 86
2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 87
2.5. Метод бицистронной люминесценции 88
2.6. Флуоресцентная микроскопия 89
2.7. Иммунохимический анализ белков. 91
2.7.1. Выделение белка из дрожжей 91
2.7.2. Дифференциальное центрифугирование 93
2.7.3. Анализ устойчивости белков к действию протеиназы К 93
2.7.4. Белковый электрофорез и «Вестерн-блот» гибридизация 93
2.8. Протеомный метод выявления и идентификации амилоидов PSIA 96
2.8.1. Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке ионными детергентами 97
2.8.2. Разделение и идентификация белков 98
2.8.2.1. Двумерный разностный гель-электрофорез (2D-DIGE) 98
2.8.2.2. Идентификация белков, разделенных при помощи 2D-DIGE 100
2.8.2.3. Жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией (LC-MALDI) 101
2.9. Статистические методы 102
ГЛАВА3. Экспериментальные исследования и обсуждение 103
3.1. Прионный фактор [NSI+] 103
3.1.1. Выявление и характеристика дрожжевого эпигенетического детерминанта [NSI+] 103
3.1.2. Ap-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSt] 106
3.1.3. [NSI+] вызывает снижение эффективности терминации трансляции 107
3.1.4. Прионные характеристики эпигенетического детерминанта [NSI+] ПО
3.1.5. Генетический контроль проявления фактора [NSI+] 118
3.1.5.1. Выявление генов, изменение уровня экспрессии которых влияет на фенотипическое проявления [NSI+] 118
3.1.5.2. Скрининг детерминанта фактора [NSI+] и генов, сверхэкспрессия которых вызывает нонсенс-супрессию в штамме [nsi-] 121
3.2. Идентификация инфекционных и неинфекционных амилоидов в дрожжах S. cerevisiae методом «протеомного скрининга амилоидов» 126
3.2.1. Разработка и апробация метода «протеомного скрининга амилоидов» 126
3.2.2. Идентификация прионов и неинфекционных амилоидов в штамме [NSI+] 137
3.2.2.1. Идентификация белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты в штамме [NSI+] 137
3.2.2.2. Выявление белков-детерминантов фактора [NSI+] 141
3.3. Анализ взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN+] 146
3.4. Оценка универсальности метода PSIA – выявление амилоидных агрегатов белков млекопитающих в клетках дрожжей 154
3.5. Оценка амилоидных характеристик и анализ взаимодействия in vivo амилоидных агрегатов белка PrP с пептидом A в дрожжах S. cerevisiae 157
Заключение 166
Выводы 171
Список сокращений 172
Список литературы 175
- Функциональные амилоиды
- Полимеразная цепная реакция в реальном времени
- Выявление и характеристика дрожжевого эпигенетического детерминанта [NSI+]
- Идентификация белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты в штамме [NSI+]
Функциональные амилоиды
Следует отметить, что наряду с альфа спиралью, бета слои являются одной из форм укладки белка, и большинство белков содержит последовательности, формирующие такие вторичные структуры. Уникальность амилоидов заключается в том, что они образуются за счт формирования не внутримолекулярных, а межмолекулярных упорядоченных бета слов. Нередко приходится встречать утверждение - «любой белок может формировать амилоидные агрегаты». В этом утверждении есть лишь небольшое зерно истины с точки зрения химика, который ставит эксперименты in vitro, однако с точки зрения биолога, оно лишено смысла. Биолог имеет дело с живыми объектами, и in vivo, даже в условиях сверхпродукции, лишь немногие белки образуют амилоидные агрегаты. Более того, даже in vitro при широком варьировании условий (солевого состава буферов, кислотности и температуры) далеко не всякий белок или пептид может формировать амилоидные фибриллы [Maji et al., 2009]. Амилоидогенные свойства определяет аминокислотный состав последовательности полипептидов. Экспериментально установлено, что наибольшим амилоидогенным потенциалом обладают последовательности, обогащнные гидрофобными аминокислотами, такими как фенилаланин, изолейцин и валин, а наименьшим - обогащнные заряженными аминокислотами [Ahmed and Kajava, 2013]. Такая аминокислота как пролин вообще не образует бета связей и, соответственно, препятствует амилоидогенезу, так как у не отсутствует стандартная аминогруппа.
Разработано несколько теоретических алгоритмов, позволяющих предсказывать способность полипептидов к амилоидогенезу, но эти алгоритмы удовлетворительно работают только для коротких пептидов [по: Ahmed and Kajava, 2013]. Есть основания полагать, что амилоидные свойства белка, определяют не только последовательности способные образовывать бета слои, но и соседние участки полипептидной цепи. Таким образом, теоретические предсказания в настоящее время малоэффективны.
Большинство выявленных амилоидов являются патогенными и демонстрируют цитотоксические эффекты [по: Нижников и др., 2015]. Образование патогенных амилоидных полимеров чаще всего может быть вызвано двумя причинами – аномальным повышением концентрации амилоидогенного белка, или возникновением аминокислотных замен, способствующих агрегации. Вместе с тем, у некоторых организмов выявлены как конститутивные функциональные амилоиды, так и функциональные амилоиды, формирование которых индуцирует внешнее воздействие [Sugiyama and Tanaka, 2014].
Для амилоидов можно выделить несколько универсальных физико-химических свойств [по: Нижников и др. 2015]: - поперечная исчерченность, которая определяется поперечным расположением мономеров белка по отношению к центральной оси протофибриллы; - связывание с амилоид-специфическими красителями, такими как Конго красный и тиофлавин Т; - высокий уровень устойчивости к воздействию ионных детергентов, растворяющих почти все белковые комплексы и агрегаты, но не амилоидные фибриллы; - способность к автокаталитическому росту за счт присоединения свободных мономеров к протофибрилле [McLaurin et al., 2000].
Отметим, что при присоединении к амилоидной протофибрилле мономер изменяет конформацию, что зачастую приводит к инактивации белка, или к приобретению белком новых функций [по: Winklhofer et al., 2008]. Для большинства исследованных белков есть полный спектр доказательств амилоидных характеристик фибрилл, полученных in vitro, а в экспериментах in vivo показано лишь связывание с амилоидспецифическими красителями. Это объясняется серьзными методическими сложностями выделения и очистки амилоидов от прочих белков.
Прионы и их отличия от неинфекционных амилоидов Впервые термин «Prion» (“proteinaceous infectious (particles)”) был предложен Стенли Прусинером для описания особой формы одноимнного белка PrP (Prion Protein), вызывающей инфекционные нейродегенеративные заболевания человека и животных. Прионная форма белка была обозначена PrPSc (от первого описанного прионного заболевания овец “Scrapie”). Нормальная форма белка PrP обозначается PrPC (от Cellular) [по: Prusiner and Scott, 1997]. Согласно определению С. Прусинера «прионы – это инфекционные белковые частицы», которые способны к самовоспроизведению. Эти инфекционные частицы представляют собой амилоидные агрегаты белка Prion Protein. Агрегаты PrPSc удивительно устойчивы и могут передаваться от организма к организму даже принадлежащим разным видам. Инфекционные частицы PrPSc содержатся не только в мозге, но и в других органах и тканях, а также в выделениях лимфатической системы и фекалиях [по: Aguzzi et al., 2008]. Большинство выявленных впоследствии у разных организмов белков, подпадающих под определение «прион» (т.е. инфекционная белковая частица), формируют амилоидные агрегаты.
Рассмотрим основные сходства и различия понятий «амилоид» и «прион». В первую очередь нужно заметить, что описаны некоторые прионы, не обладающие амилоидными свойствами [Brown and Lindquist, 2009], а возникновение дрожжевого приона [] вообще не связано с конформационными изменениями [Roberts and Wickner, 2003]. Подробнее об этом будет сказано в разделе «Прионы». Здесь мы сосредоточимся на обсуждении отличительных черт инфекционных и неинфекционных амилоидов.
Инфекционными являются только те агенты, которые способны размножаться в организме-хозяине. Классическими примерами инфекционных агентов являются бактерии, патогенные грибы, бактерии и вирусы. Поскольку прионы являются инфекционными белковыми частицами, то само определение постулирует способность этих частиц (иначе говоря, амилоидных агрегатов) размножаться, то есть самовоспроизводиться. Именно размножение прионных частиц объясняет распространение прионных инфекций у млекопитающих [Sun et al., 2008] и передачу прионной формы белка в ряду поколений у микроорганизмов [Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998]. Если говорить о S. cerevisiae, то прионный агрегат, образовавшийся в одной клетке, стабильно передается всем е потомкам в ряду клеточных поколений, что однозначно доказывает наличие механизма, обеспечивающего размножение, то есть расщепление прионного агрегата. Для описания прионизации белка PrP было предложено две базовые модели, получивших название «гетеродимерной» и «полимеризационной» [Prusiner, 1989; Lansbury and Caughey, 1995] (рис. 3).
Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Определение Стенли Прусинера, согласно которому прионы представляют собой инфекционные белковые частицы [Prusiner, 1989], не постулирует, что белок обязательно должен изменять конформацию. В соответствии с этим, формирование самовоспроизводящихся (расщепляющихся) амилоидных агрегатов нельзя рассматривать как единственно возможный механизм прионогенеза. Робертс и Викнер описали альтернативный механизм самовоспроизводящихся изменений белка, приводящих к наследственным изменениям [Roberts and Wickner, 2003]. Активация вакуолярной протеазы В (РгВ) происходит в результате нескольких последовательных этапов процессинга. Процессинг регулируется протеазой А (РгА), а также автокаталитически за счт активности зрелого белка РгВ. Активная форма РгВ осуществляет протеолиз белков. В частности, белки РгА и РгВ совместно регулируют процессинг ещ одной протеазы CpY, и их инактивация блокирует споруляцию. Было показано, что при пассировании дрожжей на среде с галактозой делеция гена РЕР4, кодирующего РгА, не приводит к инактивации РгВ, то есть в этих условиях процессинг РгВ может осуществляться автокаталитически. Пересев клеток рер4 на среду с глюкозой приводит к необратимой элиминации активности РгВ. Активная форма белка РгВ передатся цитодукцией, если в качестве донора используется штамм рер4, пассирующийся на среде с галактозой, а в качестве реципиента такой же штамм, в котором РгВ инактивирован пассированием на среде с глюкозой. Таким образом, активная форма РгВ, как и прионы, поддерживается автокаталитически и обладает инфекционностью (передатся цитодукцией). Исходя из этих данных, авторы предложили называть процессированный белок РгВ прионом [Р] [Roberts and Wickner, 2003]. По сути, в этой работе был описан новый механизм белковой наследственности, который принципиально отличается от механизма наследования инфекционных амилоидов. Другим примером неамилоидных прионов является фактор [GAR+]. В норме, при наличии в среде глюкозы, в дрожжевой клетке происходит репрессия потребления других источников углерода. Фактор [GAR+] блокирует глюкозную репрессию, штаммы [GAR+] способны потреблять глицерин в присутствие глюкозамина [Ball et al. 1976]. Фактор [GAR+], как и прочие прионы, доминантен, наследуется 4:0 в мейозе, передатся цитодукцией, и может возникать de novo. Исследованию данного фактора посвящн ряд работ, но по-прежнему нет ясности в вопросе о его детерминантах. Индукция [GAR+] происходит с высокой частотой при сверхэкспрессии гена STD1, а к его элиминации приводит одновременная делеция гена STD1 и N-терминальной части гена PMA1 [Brown and Lindquist, 2009]. Белки Pma1 и Std1 не образуют амилоидные полимеры в штаммах [GAR+] [Brown and Lindquist, 2009]. Косвенным свидетельством в пользу неамилоидной природы [GAR+] является его независимость от активности шаперона Hsp104 [Brown and Lindquist, 2009]. Возможно, возникновение фактора [GAR+], не связано с конформационными изменениями белка, а является примером структурной наследственности, сходным с кортикальной наследственностью у инфузорий [Beisson and Sonneborn, 1965]. Можно допустить, что наличие или отсутствие фактора [GAR+] определяется разными способами сборки белкового комплекса, состоящего из двух или нескольких элементов. Мы можем предложить и другую возможную модель – временная сверхпродукция белка Std1, который является активатором киназ [Kuchin et al., 2003], вызывает гипперфосфорилирование Pma1, и однажды распознав этот белок в качестве мишени, киназы продолжают обеспечивать фосфорилирование Pma1 в ряду поколений. Наша гипотеза имеет право на жизнь, поскольку последовательность Pma1 содержит необычайно много (а именно 28) потенциальных сайтов фосфорилирования [Swaney et al., 2013].
Фактор [Het-s] это ещ один пример эпигенетического изменения, обусловленного прионной конверсией. Слияние гиф грибов, принадлежащих к двум разным мицелиям, приводит к образованию гетерокариона, однако в ряде случаев этот процесс заканчивается гибелью гетерокариона из-за отличий между двумя мицелиями по аллелям генов несовместимости (рисунок 7). У гриба-аскомицета Podospora anserina известно 9 локусов het (от heterokaryon formation), контролирующих вегетативную несовместимость. Один из них - локус het-s представлен двумя аллелями (het-s и het-S). Прион образует только белковый продукт аллели het-s [Coustou et al., 1997]. В штаммах [Het-s ] белок HET-s находится в нативной конформации. Если происходит прионизация белка, то фенотип штамма обозначают как [Het-s]. При слиянии прионсодержащих гиф ([Het-s]) и гиф [Het-s ], в которых белок представлен в мономерной изоформе, образуется гетерокарион и весь пул белка HET-s переходит в прионное состояние. При слиянии прионсодержащих гиф ([Het-s]) и гиф, содержащих аллель het-S, происходит гибель гетерокариона. Таким образом, прион контролирует вегетативную несовместимость [Coustou et al., 1997; Wickner, 1997].
Белок HET-s отличается от большинства известных прионных белков низших эукариот отсутствием участков с повышенным содержанием глутамина и аспарагина. В ходе изучения трехмерной структуры белка HET-s границы и функции доменов были определены следующим образом: N-домен (аминокислоты 1-217), образованный в основном -спиралями, важен для регуляции несовместимости, тогда как неструктурированный С-домен (аминокислоты 218-289) отвечает за прионизацию [Balguerie et al., 2003]. После перехода в прионную конформацию в С-домене преобладают -слои, образующие структуру устойчивую к обработке протеиназой К [Balguerie et al., 2004]. Изучение фибрилл, полученных in vitro, показало, что HET-s(218-289) образует левозакрученный -соленоид с треугольным гидрофобным основанием [Wasmer et al., 2008]. Для фибрилл HET-s(218-289) характерна полярность, и добавление новых мономеров в условиях in vitro при комнатной температуре происходит только с одного конца. Механизм добавления мономера к уже имеющемуся амилоиду включает в себя присоединение неструктурированного прионного домена к концу протофибриллы с последующим конформационным изменением и встраиванием в структуру фибриллы. [Baiesi et al., 2011]. Белок HET-s (218-289) способен прионизоваться и при экспрессии его структурного гена в клетках дрожжей S.cerevisiae. В этом случае поддержание прионной конформации требует наличия белка-шаперона Hsp104 [Taneja et al., 2007].
Выявление и характеристика дрожжевого эпигенетического детерминанта [NSI+]
Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке ионными детергентами проводили в соответствии методикой описанной ранее [Kushnorov et al., 2006], и нашими существенными модификациями [Nizhnikov et al., 2014]. . Осадок (примерно 4 – 5 грамм клеток) суспендировали в 5мл буфера (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 10mM EDTA, 10Mm PMSF, 10mM DTT). Добавляли к суспензии равный объм стеклянных бус (0.4 mm GLC, Merck BDH) и ставили на лд. Клетки разрушали на дезинтеграторе “Fisher Scientific” шесть циклов по одной минуте с перерывом в одну минуту между каждым циколом для охлаждения проб на льду. Пробы центрифугировали при 2500g, 10мин. 4oC, осадок удаляли, надосадочную фракцию переносили в другую пробирку и добавляли 5мг РНК азы. Пробы ультрацентрифугировали 2ч., 223 600g при 4oC в роторе Ti75. 9. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок тщательно суспендировали в 1 мл буфера ( 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 10mM EDTA, 10Mm PMSF, 10mM DTT), доводили объм до 5.4 мл. и добавляли 0.6мл 10% раствора SDS (конечная концентрация 1% SDS). Альтернативно, в других экспериментах вместо 1% SDS использовали саркозинат натрия в конечной концентрации 3%. Аккуратно перемешивали, не допуская образования пены.
Пробы наслаивали на 2 мл подушки (25% сахароза в буфере TBS). Пробирки устанавливали в ротор Ti75 ультацентрифуги и включали режим «отложенный старт». Таким образом, пробы инкубировались 4-6 часов при температуре 18оС.
В случае разделения белков с помощью двумерного электрофореза осадок растворяли в хаотропных агентах (смотри раздел «Двумерный разностный электрофорез белков»). В случае использования методики “HPLC – MALDI” осадок растворяли в 100 мкл 96%муравьиной кислоты. Если осадок не растворялся, увеличивали объем муравьиной кислоты. Инкубировали 30 мин при комнатной температуре.
Осадок суспендировали в 90 мкл воды, добавляли 30 мкл буфера (100mM Tris-HCL-6.8, 20% меркаптоэтанол, 10% SDS, 0.2% бромфеноловый синий, 40% глицерин) и кипятили белки 10мин при 100оС.
Белки растворяли в регидратирующем буфере (7М мочевина, 2М тиомочевина, 4% 3-[(3-холамидопропил) диметиламмонио]-1-пропансульфонат (ХАМПс), 25 мМ Трис, рН 8,5) и коньюгировали с флурохромами Cy5 (опытный образец) или Cy3 (контрольный образец) (Luminoprobe, BioDye) в соотношении 400 пмоль флуорохрома на 50 мкг белка. Концентрацию белка оценивали по величине поглощения при длине волны 280 нм. Образцы инкубировали с флуорохромами на льду в течение 30 мин. в темноте. Реакцию останавливали добавлением 10 мкмоль L-лизина с последующей инкубацией в течение 10 мин. при тех же условиях, затем белки центрифугировали 2500g, 10 мин. Растворнные белки, меченные разными флуорохромами, объединяли и загружали в стрип с градиентом рН 3-10 (7 см, BioRad, США). Процесс загрузки был сопряжен с пассивной регидратацией стрипа (16-18 ч. при комнатной температуре в темноте). Разделение первого направления проводили в ячейке для изоэлектрического фокусирования (Protean IEF Cell, BioRad), следуя рекомендациям производителя (10000 Вольт-часов, финальное напряжение 4000 В, 20C, ток не более 25 мА/стрип).
Перед разделением второго направления стрипы с фокусированными образцами последовательно инкубировали по 15 мин. в эквилибрирующих буферах: первом (6 M мочевина, 2% додецил-сульфат натрия, 20% глицерин, 2% дитиотреитол, 0,375 M Трис, pH 8,8) и втором, где дитиотреитол заменен на 2,5% иодоацетамид. Электрофорез второго направления проводили в ячейке MiniProtean TetraCell (BioRad) в 15% полиакриламидном геле в трис-глициновой буферной системе (tris/glycine/SDS buffer, BioRad) при напряжении 200 В. Для визуализации электрофоретической картины использовали лазерный сканнер GE Typhoon FLA 9500. Наложение электрофореграмм проводили в программном обеспечении ImageJ версии 1.48v (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA, http://imagej.nih.gov.ij). Гель окрашивали кумасси G250 (Coomassie Brilliant Blue R250, BioRad). Пятна окрашенные кумасси G250 и соответствующие сигналам, выявленным при лазерном сканирования вырезали из геля.
Идентификация белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты в штамме [NSI+]
Как мы показали (см. рис. 14), супрессия, наблюдаемая в штаммах [SWI+][PIN+] (ранее обозначенных как [NSI+]), приводит к снижению эффективности терминации трансляции. Снижение эффективности терминации трансляции опосредовано уменьшением уровня экспрессии гена SUP45 (рисунок 17). Поскольку белок Swi1 является транскрипционным регулятором более чем 6% дрожжевых генов [Peterson and Herskowitz, 1992; Burns and Peterson, 1997], эффект его прионной инактивации на уровень экспрессии гена SUP45 и терминацию трансляции вполне объясним, однако остатся загадкой, каким образом на этот процесс влияет прион [PIN+]. Наши и литературные данные свидетельствуют о том, что прионные агрегаты белков Swi1 и Rnq1 физически не взаимодействуют. Исходя из этого, следует, что белок Rnq1 в прионной конформации приобретает новую функцию и опосредовано влияет на свойства прионных агрегатов [SWI+]. Недавно было показано, что Rnq1 только в прионной изоформе вызывает гиперфосфорилирование белка Pin4 [Yang et al., 2014].
Вполне вероятно, что прионные агрегаты Rnq1 секвестрируют репрессор киназы, которая ответственна за гиперфосфорилирование не только Pin4, но и некоторых других белков, и в частности Swi1. В связи с этим, интересно отметить, что у белка Swi1 выявлено необычно много (двенадцать) потенциальных сайтов фосфорилирования (http://www.yeastgenome.org).
Полученные данные позволяют сформулировать концепцию, согласно которой функциональные взаимодействия прионов, опосредованные другими компонентами протеомной сети, могут вызывать наследуемые изменения признаков. По аналогии с признаками, наследование которых контролируется одним или несколькими генами, можно утверждать, что существуют признаки, проявление которых контролируется прионизацией одного белка, или взаимодействием различных прионов.
Несмотря на то, что взаимодействия прионов можно описать в рамках традиционной классификации взаимодействий генов, мы не можем согласиться с авторами, которые предлагают рассматривать прионы в качестве генов или «белковых генов» [Chernoff , 2001; Wickner et al., 2004]. Ген представляет собой единицу наследственного материала, кодирующую одну макромолекулу. Прион, несомненно, является матрицей, кодирующей наследственную информацию о конформации белка [Инге-Вечтомов, 2013], но он не кодирует молекулу белка, а лишь изменяет е конформацию и функциональную активность. Как было показано ранее, прионизация приводит к тем же последствиям, что и мутации [Chernoff, 2001]. Разница заключается в том, что мутация приводит к изменению самого гена, а прионизация вызывает наследуемое изменение генного продукта. На основании приведнных рассуждений мы приходим к заключению, что прион не является геном, поскольку не кодирет макромолекулу, а вызывает изменение е свойств.
Когда мы говорим о взаимодействии генов, то на самом деле речь идт о взаимодействии генных продуктов (в нашем случае белков). Исходя из этого, становится понятным, почему взаимодействие прионов приводит к таким же последствиям, как взаимодействие классических генов. Мы показали, что прионы [SWI+] и [PIN+] демонстрируют комплементарное взаимодействие по отношению к признаку «супрессия нонсенс-мутации ade1-14(UGA)». Теоретически можно предсказать, что прионы могут взаимодействовать также по типу эпистаза и различных вариантов полимерии. Оценка универсальности метода PSIA – выявление амилоидных агрегатов белков млекопитающих в клетках дрожжей Наш метод протеомного скрининга был успешно использован для идентификации глутамин-аспарагин обогащнных дрожжевых белков, формирующих прионные агрегаты. Мы предположили, что данный метод может служить универсальным инструментом для выявления различных амилоидов у любых организмов. Для проверки этой гипотезы мы оценили возможность выявления агрегатов PrP и A млекопитающих с помощью метода PSIA при продукции этих белков в дрожжах S. cerevisiae. Ранее было показано, что белки PrP и A агрегируют в дрожжах, и агрегаты PrP, подобно полимерам PrPSc в мозге млекопитающих, демонстрируют высокий уровень устойчивости к обработке протеиназой К [Ma and Lindquist, 1999].
Штамм BY4742 [PIN+] трансформировали плазмидами PGPD-PrP90-231 GFP(URA3) и PGPD-A-GFP(URA3), продуцирующими гибридные белки PrP(90 231)-GFP и A40-GFP под контролем промотора GPD. Поскольку прион [PIN+] уверенно идентифицируется методом PSIA (см. раздел «Разработка и апробация метода «протеомного скрининга амилоидов»), сигнал, соответствующий белку Rnq1, может служить положительным контролем. В качестве отрицательного контроля использовали [pin-] дериват штамма BY4742, трансформированный плазмидой pRS316CG, продуцирующей белок GFP под контролем промотора CUP1. Фракции, содержащие белковые агрегаты, устойчивые к обработке 1% SDS и 3% саркозинатом натрия, были выделены и очищены из опытных и контрольных образцов как описано в разделе «Материалы и методы». Для удобства демонстрации полученных результатов, была использована модификация метода PSIA, включающая двумерный электрофорез белков, окрашенных флуорохромами.