Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Состояние производственной среды на предприятиях теплоэнергетического комплекса 12
1.2. Хромосомные аберрации в лимфоцитах крови как биомаркер эффекта воздействия факторов окружающей среды на генетический аппарат 19
1.2.1. Хромосомные нарушения в условиях воздействия производственных факторов 20
1.3. Генетический полиморфизм систем защиты генома от повреждающих воздействий факторов среды 24
1.3.1. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков 25
1.3.2. Полиморфизм генов ферментов эксцизионной репарации ДНК 32
1.4. Вклад полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и генов ферментов репарации ДНК в формировании индивидуальной чувствительности рабочих к действию факторов производственной среды 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 47
2.1. Характеристика обследованных групп 47
2.2. Гигиеническая характеристика предприятий теплоэнергетического комплекса в г. Кемерово 49
2.3. Методы исследования 53
2.3.1. Цитогенетический анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах крови 53
2.3.2. Молекулярно-генетические методы 54
2.3.2.1. Выделение геномной ДНК з
2.3.2.2. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1 2A, CYP1A2 1F, GSTM1, GSTT1) 55
2.3.2.3. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов ферментов репарации ДНК (XRCC1, АРЕХ1, hOGGl, ADPRT, XPD) 58
2.4. Методы статистической обработки данных 60
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 65
3.1. Анализ хромосомных аберраций в исследуемых группах 65
3.1.1. Уровень и спектр хромосомных аберраций в лимфоцитах крови рабочих теплоэнергетического производства и контрольных индивидов 65
3.1.2. Оценка влияния пола, возраста, статуса курения и специфики контакта с вредными производственными факторами на уровень хромосомных аберраций в исследуемых группах 68
3.2. Анализ полиморфных локусов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК в исследуемых группах 77
3.2.1. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у рабочих теплоэлектростанций и контрольных индивидов 77
3.2.2. Полиморфизм генов ферментов репарации ДНК у рабочих теплоэнергетического производства и контрольных индивидов 86
3.3. Анализ взаимосвязи полиморфных локусов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК с уровнем 92
хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у рабочих теплоэнергетического производства
3.3.1. Исследование взаимосвязи полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с уровнем хромосомных аберраций 93
3.3.2. Исследование взаимосвязи полиморфных вариантов генов ферментов репарации ДНК с уровнем хромосомных аберраций 99
3.3.3. Анализ межгенных взаимодействий полиморфных локусов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК, детерминирующих формирование повышенного уровня хромосомных аберраций у рабочих теплоэнергетического комплекса 104
Заключение 123
Выводы 129
Список литературы 131
- Хромосомные нарушения в условиях воздействия производственных факторов
- Вклад полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и генов ферментов репарации ДНК в формировании индивидуальной чувствительности рабочих к действию факторов производственной среды
- Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1 2A, CYP1A2 1F, GSTM1, GSTT1)
- Полиморфизм генов ферментов репарации ДНК у рабочих теплоэнергетического производства и контрольных индивидов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование закономерностей возникновения хромосомных аберраций (ХА) в лимфоцитах периферической крови для оценки повреждающего действия факторов окружающей среды на организм человека широко используется во всем мире (Тимошевский и др., 2010; Сычева, 2012; Севанькаев и др., 2013). Наличие числовых и структурных перестроек хромосом может обусловливать нарушение клеточной пролиферации и возникновение геномной нестабильности (Матвеенко и др., 2010).
Наиболее интенсивное воздействие потенциальных генотоксикантов на популяции человека следует ожидать при профессиональном контакте с вредностями, так как в производственных условиях организм на протяжении большого временного интервала может находиться под максимальным прессингом мутагенных факторов. Накоплен значительный фактический материал, свидетельствующий о генотоксических эффектах в соматических клетках рабочих различных производств: свинцовом (Grover et al., 2010); коксохимическом (Дружинин, 2003; Ada et al., 2013; Iscan et al., 2013); в уранодобывающей и резиновой промышленности (Васильева и др., 2012; Bolognesi et al., 2014); у работников атомных электростанций (Hristova et al., 2013).
Наряду с этим установлено, что интенсивность хромосомного мутагенеза зависит не только от свойств мутагенного фактора, но и от конституциональных особенностей организма, определяемых, в том числе генетическим полиморфизмом ферментов, обеспечивающих стабильность генома. К числу таких полиморфных систем относятся гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК (Ревазова и др., 2009; Минина, 2013; Сальникова и др., 2013).
Система биотрансформации ксенобиотиков играет ключевую роль в обеспечении индивидуальной устойчивости организма к негативным факторам окружающей среды (Rueff et al., 2009; Измеров и др., 2011). В случае возникновения повреждения генома включается механизм, восстанавливающий целостность генетического аппарата клетки, важнейшим представителем которой является система эксцизионной репарации ДНК, осуществляющая исправления наиболее часто встречающихся изменений в структуре ДНК (Викторова и др., 2011; Кочетова и др., 2011; Li etal., 2014).
В настоящее время имеется определенный экспериментальный материал, подтверждающий значимость роли отдельных аллельных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК в формировании индивидуальной чувствительности к широкому спектру наиболее распространенных химических мутагенов: полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) (Liu
et al., 2013), стирола (Teixeira et al., 2004), бензола (Mansi et al., 2012), органических растворителей (Hoyos-Giraldo et al., 2009), формальдегида (Jiang et al., 2010), акриламида (Huang et al., 2011) и др.
В то же время можно отметить отсутствие комплексного изучения генотоксических эффектов у работников теплоэлектростанций (ТЭС). Согласно литературным данным рабочие ТЭС подвержены воздействию целого комплекса неблагоприятных факторов химической (угольная пыль, оксиды азота и углерода, ПАУ, металлы, сероводород, серная кислота, аммиак и др.) и физической (шум, вибрация, перепады температуры) природы (Панаиотти, 2009; Панаиотти и др., 2012; Захаренков, Кислицына, 2014). В связи с этим приобретает свою актуальность изучение ХА у рабочих теплоэнергетического производства в сочетании с оценкой генетического полиморфизма защитных систем организма.
Цель работы: Исследовать эффекты воздействия производственной среды на хромосомы рабочих теплоэнергетического комплекса с учетом полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК.
Задачи исследования:
-
Изучить уровень и спектр хромосомных аберраций у рабочих теплоэнергетического производства и у жителей той же местности, не контактирующих профессионально с промышленными мутагенами.
-
Оценить влияния пола, возраста, статуса курения, стажа работы и специфики контакта с вредными производственными факторами на уровень хромосомных аберраций в исследуемых группах.
-
Провести сравнительный анализ полиморфных локусов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков: CYP1A1 (rs4646903), CYP1A2 (rs762551), GSTM1 (del), GSTT1 (del) и репарации ДНК: XRCC1 (rs25489), APEX1 (rs 1130409), hOGGl (rs 1052133), ADPRT (rsl 136410), XPD (rsl3181) у рабочих теплоэнергетического комплекса и в группах контроля.
-
Исследовать взаимосвязь полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК с уровнем и спектром хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у рабочих теплоэнергетического производства.
5. Провести анализ межгенных взаимодействий полиморфных локусов
изученных генов, детерминирующих формирование повышенного уровня
хромосомных аберраций у рабочих теплоэнергетического комплекса.
Научная новизна. Впервые проведено исследование ХА в лимфоцитах крови рабочих теплоэнергетического производства, включающее оценку уровня повреждений хромосом в зависимости от возраста, пола, стажа, курения, специфики контакта с вредными производственными факторами и генотипа. Установлено наличие выраженного генотоксического эффекта воздействия производственных факторов у рабочих теплоэнергетики. Показано, что пол, возраст, стаж работы и статус курения в исследуемой выборке не модифицируют частоту ХА и поэтому не могут рассматриваться в качестве ведущих причин увеличения уровня хромосомных нарушений. Наиболее высокая частота клеток с хромосомными аберрациями наблюдалась у рабочих, выполняющих основные производственные операции. Впервые охарактеризовано распределение частот аллелей и генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК у работников теплоэнергетического производства. Впервые оценен уровень ХА в зависимости от полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК у рабочих теплоэнергетического комплекса. Установлены генотипы ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК, ассоциированные с возрастанием уровня хромосомных повреждений у рабочих теплоэлектростанций (GSTT1 (del), XRCC1 (rs25489)).
Научно-практическая значимость работы. Изучение вклада генетического полиморфизма на реализацию мутагенных эффектов воздействия факторов производственной среды теплоэнергетического комплекса позволит формировать группы повышенного генетического риска. Полученные результаты могут быть использованы как при разработке новых, научно-обоснованных рекомендаций при проведении профессионального отбора рабочих теплоэлектростанций, так и для составления индивидуальных рекомендаций по способам защиты генома при диспансеризации. Результаты исследования используются в учебном процессе в Кемеровском Государственном университете (Специальный курс «Медицинская генетика. Генетика иммунитета», Большой практикум, раздел «Цитогенетика»).
Апробация работы: Основные положения и результаты научных исследований были доложены на XXXVI международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Образование, наука, инновации - вклад молодых исследователей» КемГУ (Кемерово, 2009); VI съезде общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); I Усовских чтениях в Кузбассе (Кемерово, 2010); XV Всероссийской научно - практической конференции «Научное творчество молодежи» (Анжеро-Судженск, 2011); Инновационном конвенте «КУЗБАСС: ОБРАЗОВАНИЕ, НАУКА, ИННОВАЦИИ» (Кемерово, 2011); XIV Всероссийском
форуме с международным участием им. Академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011); конференции «Актуальные проблемы лабораторной диагностики и биотехнологии» (Кемерово, 2012); межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 2012); XVI Всероссийской научно - практической конференции «Научное творчество молодежи» (Анжеро-Судженск, 2012); научной сессии молодых ученых Кузбасса «Наука-Практике»; VIII Конференции молодых ученых Института экологии человека СО РАН (Кемерово, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 6 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 173 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитированной литературы включает 325 источника, из них 114 отечественных и 211 зарубежных. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 24 рисунками.
Финансовая поддержка работы. Результаты диссертационного исследования получены в рамках выполнения НИР по грантам РФФИ: 07-04-96026-р_урал_а «Молекулярные механизмы индуцированного полициклическими ароматическими углеводородами мутагенеза у человека в условиях канцерогено-опасного производства»; 12-04-32117 «Оценка индивидуальной чувствительности организма человека к мутагенному воздействию комплекса факторов теплоэнергетического производства».
Хромосомные нарушения в условиях воздействия производственных факторов
Значительная доля энергии на сегодняшний день производится за счет относительно чистых видов топлива (газ, нефть). Однако в последние годы наблюдается тенденция уменьшения их доли в получении энергии во всем мире. По имеющимся данным, эти энергоносители потеряют свое ведущее значение уже в первой четверти XXI столетия. В этом случае закономерно ожидать увеличение использования угля в мировом энергобалансе, запасы которого могут обеспечивать мировые потребности в энергии в течение 200-300 лет (Jumpponen et al., 2013). Особенно важную роль уголь будет играть в энергетике тех регионов, в которых альтернативные виды топлива пока недоступны (Sinha, Nag, 2011). Более 1/3 мировых запасов угля находится на территории России. В то же время, уголь, который используется на ТЭС России, как правило, имеет низкое качество. Высокая зольность и влажность угля вызывают значительные технические и экологические трудности при его сжигании в котлах (Беляев и др., 2004).
На Кузнецкий угольный бассейн приходится около 56% добычи каменных углей в Российской Федерации, а доля от добычи коксующихся углей доходит до 80% (Георгиев, 2009). Поэтому закономерно ожидать увеличения доли углей или продуктов их переработки в получении энергии, а, следовательно, и в загрязнении среды.
Серьезные экологические проблемы связаны с твердыми отходами ТЭС - золой и шлаками (Mani et al., 2007). Несмотря на то, что зола в основной массе улавливается различными фильтрами, в России, в виде выбросов ТЭЦ, ежегодно в атмосферу поступает около 250 млн. тонн мелкодисперсных аэрозолей, которые являются ядрами конденсации для паров воды и формирования осадков. Также они способны вызывать различные респираторные заболевания у человека (Dherani et al., 2008).
Несмотря на большой объем работ, проводимых на ТЭС по улучшению условий труда, они еще не отвечают гигиеническим требованиям и характеризуются наличием ряда неблагоприятных факторов производственной среды (нагревающего микроклимата, интенсивного шума, вибрации, загазованности, запыленности), которые наблюдаются не только в основном (топливно-транспортном), но и во вспомогательных (электрическом, химическом, ремонтных) цехах (Демченко и др., 2001; Демченко и др., 2002; Малышкина и др., 2002; Плотникова и др., 2003; Панаиотти, Суржиков, 2007; Панаиотти, 2009).
Источниками интенсивного шума на ТЭС являются турбогенераторы, мельницы помола угля, высоковольтные электродвигатели, газо- и паропроводы, вентиляционные установки и т.д. Уровни шума, генерируемые указанными установками, значительно превышают допустимые. Проявление вредного воздействия шума на организм человека весьма разнообразно. Повышенный шум влияет на нервную и сердечно-сосудистую системы, репродуктивную функцию человека, вызывает раздражение, нарушение сна, утомление, агрессивность, способствует развитию психических заболеваний (Тэйлор, 1978).
Воздействие производственной вибрации на человека вызывает изменения как физиологического, так и функционального состояния организма человека. Изменения в функциональном состоянии организма проявляются в повышении утомляемости, увеличении времени двигательной и зрительной реакции, нарушении вестибулярных реакций и координации движений. Изменения в физиологическом состоянии организма - в развитии нервных заболеваний, нарушении функций сердечно-сосудистой системы и , нарушении функций опорно-двигательного аппарата, поражении мышечных тканей и суставов, нарушении функций органов внутренней секреции (Суворов и др., 1984).
Длительное воздействие на организм запыленности, повышенной температуры среды вызывает угнетение иммунной системы. Это в свою очередь может привести к нарушению контроля генетического постоянства в организме (Жидецкий и др., 2000).
Продукты сгорания твердого топлива являются сложной смесью твердых и газообразных веществ. Производство энергии путем сжигания каменного угля приводит к образованию твердых частиц (ТЧ) около 0,1 мкм, которые считаются наиболее вредными из-за высокого содержания в них органических химикатов. Сжигание угля рассматривается как один из основных источников микроэлементов в атмосфере (Zereini et al., 2005). Большинство микроэлементов создают серьезные экологические проблемы из-за их токсичности и биоаккумуляции в различных экологических средах (Palus et al., 2003; Schwarze, 2006). Было установлено, что органические элементы, присутствующие в ТЧ и адсорбированные на их поверхности приводят к образованию свободных радикалов, которые могут вызвать окислительный стресс и воспаление (Donaldson, 2006). Также, в составе ТЧ могут входить тяжелые металлы.
В составе твердых частиц, образующихся от сжигания угля на теплоэлектростанциях, наблюдалось увеличение концентрации таких металлов как хром (Сг), марганец (Мп), железо (Fe), кобальт (Со), никель (Ni), медь (Си), цинк (Zn), кадмий (Cd), свинец (РЬ), селен (Se), ртуть (Hg), мышьяк (As). Преобладающими элементами были Fe и Zn (Jayasekher, 2009). Металлы являются канцерогенными веществами и могут вызывать повреждения ДНК (Kakkar, Jaffery, 2005; Joseph, 2009), которые создают возможные неблагоприятные последствия для здоровья человека (Garcon et al., 2004). Ультрадисперсные аэрозольные частицы могут легко проникать в легкие из-за их субмикронных размеров, попадают непосредственно в систему кровообращения, которая позволяет им распространиться системно (Nemmar et al., 2002). Эти частицы в зависимости от их физических и химических свойств могут вызывать в кратко- и долгосрочной перспективе различные токсические эффекты, в том числе и повреждения клеток на генетическом уровне (Tice et al., 2000).
Вклад полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и генов ферментов репарации ДНК в формировании индивидуальной чувствительности рабочих к действию факторов производственной среды
У 521 обследованных был выполнен цитогенетический анализ. Опытную группу составили 280 рабочих основных производственных цехов, выполняющих основные технологические операции. В качестве группы контроля было обследовано 241 человек.
Подготовку препаратов метафазных хромосом осуществляли с использованием стандартного полумикрометода (Hungerford, 1965). Питательную смесь готовили из расчета: 6 мл среды RPMI-1640 (ПанЭко), 1,5 мл эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко) и 0,1 мл фитогемагглютинина (ПанЭко). Смесь помещали в стерильные культуральные флаконы и добавляли 0,5 мл гепаринизированной крови. Культуральные флаконы выдерживали при 37 С в течение 48 ч. За 2 ч до фиксации в культуры вводили колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. По окончании культивирования клетки обрабатывали гипотоническим раствором 0,55% КС1 в течение 20 мин при 37 С. Фиксацию материала проводили в 3 сменах охлажденного этанол-уксусного фиксатора (3:1). Клеточную суспензию раскапывали на чистые охлажденные, смоченные водой предметные стекла. Препараты шифровали и окрашивали 2% раствором красителя Гимза (Merk).
Препараты анализировали с использованием микроскопа Axioskop 2 plus (Carl Zeiss). Анализировали в среднем 200 клеток на человека. Учет хромосомных аберраций проводили без кариотипирования. Отбор метафаз, включаемых в анализ, и критерии для регистрации цитогенетических нарушений соответствовали общепринятым рекомендациям (Carrano, Natarajan, 1988). Протокол цитогенетического анализа приведен в Приложении А. Определяли частоту метафаз с ХА, уровень ХА (как частоту ХА в процентах от изученного числа клеток). Отдельно учитывали частоту ХА хроматидного и хромосомного типов. В случаях обнаружения «спорных» вариантов аберраций верификацию цитогенетических событий осуществляли путем повторного анализа разными исследователями. Результаты цитогенетического анализа заносили в электронную базу данных. На рисунке 3 представлена метафазназная пластинка, содержащая дицентрическую хромосому.
Исследовали 9 полиморфных локусов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков: CYP1A1 (rs4646903), CYP1A2 (rs762551), GSTM1 (del), GSTT1 (del) и генов репарации ДНК: XRCC1 (rs25489), APEX1 (rsll30409), hOGGl (rsl052133), ADPRT (rsl 136410), XPD (rsl3181). Подбор генов-кандидатов осуществлялся с учетом функционального характера полиморфизма и наличия сопряженности с изменением активности и/или количества соответствующего фермента.
У 408 обследованных был выполнен молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков. Опытную группу составили 197 рабочих основных производственных цехов, выполняющих основные технологические операции. В качестве группы контроля было обследовано 211 человек.
Протяженные делеции в генах GSTM1 и GSTT1 анализировали методом мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени (ООО «СибДНК», г. Новосибирск).
Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР были выбраны внутри области делеции в генах GSTM1 и GSTT1 таким образом, что обуславливало отсутствие синтеза соответствующего продукта ПЦР при анализе образцов ДНК с генотипами GSTM1 del или GSTT1 del, соответственно. Для того, чтобы отличить наличие гомозиготной делеции в генах GSTM1 и GSTT1 от отсутствия ДНК матрицы или ингибирования реакции ПЦР в амплификационную смесь вводили внутренний контроль, в качестве которого использовали фрагмент генома условно обозначаемого LTM - от «low temperature melting». Результаты интерпретировали исходя из анализа графиков накопления флуоресценции. Специфичность оценивалась с помощью кривой плавления, так для LTM температура плавления составляла 78 С, для GSTM1 - 86,5 С, a GSTT1 - 91 С. Отсутствие флуоресцентного сигнала указывало на гомозиготность индивидуума по делеции гена (del). Гетерозиготы по мутации рассматривались в одной группе с носителями нормальных генов (п).
Полиморфизм генов CYP1A1 (rs4646903) и CYP1A2 (rs762551) исследовали с помощью методов ПЦР-ПДРФ с использованием наборов 000 «СибДНК» (г. Новосибирск). ПЦР проводили на амплификаторах ТЕРЦИК (ДНК-Технология, Россия). Для рестрикции использовали рестриктазу BsflU. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в горизонтальном 3% агарозном геле и в вертикальном 7% полиакриламидном геле. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. В таблице 6 представлены основные характеристики исследуемых генов ФБК. На рисунке 4 показан пример интерпретации результатов анализа полиморфизма 3801 Т С, rs4646903 гена CYP1A1 (а) и -163 С А, rs762551 гена CYP1A2(6).
Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1 2A, CYP1A2 1F, GSTM1, GSTT1)
Распределение частот генотипов по локусу 2251 А С (rsl3181) гена XPD в исследуемых группах соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Показано, что мажорный генотип АА (Lys/Lys) гена XPD встречался с частотой 34,74% - в опытной группе и 36,92% - в группе контроля. Частота гетерозиготного генотипа AC (Lys/Gln) гена XPD в исследуемых группах составила 49,47% и 48,72% соответственно, что согласуется с частотой данных генотипов в популяции Центральной и Северной Европы: частота АА (Lys/Lys) - 44,24%; AC (Lys/Gln) - 49,09% (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/). Статистически значимых отличий в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса А2251С гена XPD между опытной группой и группой контроля выявлено не было.
В ряде исследований было установлено, что минорный вариант 751 Gin гена XPD ассоциирован с увеличением ХА и СХО в лимфоцитах крови (Zhou et al., 2002; Zijno et al., 2006), а также с повышенной предрасположенностью в развитии онкологических новообразований (Hou et al., 2003; Harms et al., 2004; Stern et al., 2006).
Таким образом, проведенный сравнительный анализ частот полиморфных локусов генов репарации ДНК: XRCC1 (rs25489), АРЕХ1 (rsll30409), hOGGl (rsl052133), ADPRT (rsll36410), XPD (rsl3181) в исследуемых группах не выявил статистически значимых отличий в частоте распределения изученных генов.
В последние годы проводятся исследования, посвященные изучению полиморфизма генов ферментов репарации ДНК в группах рабочих, занятых в различных производственных процессах. Так, в работе Г.Н. Мансуровой с соавт. (2008) проводилось анализ взаимосвязи полиморфных вариантов генов XRCC1 (rs25489, rs25487), hOGGl (rsl052133), XPD (rsl3181), XPG (rsl7655) с риском возникновения злокачественных новообразований (ЗНО) у работников Сибирского химического комбината (СХК). Сравнительный анализ ассоциации генотипов по исследуемым полиморфизмам с ЗНО показал эффект для гомозиготного генотипа 326 СС гена hOGGl (р=0,02; OR=2,ll; 95% СІ 1,09-4,08). Для гетерозиготного генотипа 326 CG гена hOGGl была установлена протективная роль в отношении развития ЗНО (р=0,007; OR=0,41; 95% СІ 0,21-0,81) (Мансурова и др., 2008).
Н.В. Литвяков с соавт. (2009) исследовали ассоциации полиморфных локусов генов ферментов репарации ДНК hOGGl (rsl052133), XPD (rsl3181), XRCC1 (rs25489, rs25487, rsl 799782) и XPG (rs 17655) с риском развития ЗНО в условиях низкоинтенсивного облучения у работников СХК. Были выявлены положительные ассоциации с риском ЗНО для полиморфных локусов: rs25487гена XRCC1 (аллель G), rs25489 гена XRCC1 (генотип GG), rsl052133 гена hOGGl (генотип СС), rsl3181 гена XPD (генотип АЛ). Значимых ассоциаций аллелей и генотипов гена XPG с риском развития ЗНО не было установлено (Литвяков и др., 2009).
В работе О.В. Кочетовой с соавт. (2011) был проведен ассоциаций полиморфных вариантов генов XRCC1 (rs25487), XPD (rsl3181), ХРС (rs2228001), XRCC3 (rs861539) с риском развития миомы матки у работниц нефтехимической промышленности. Было установлено, что гомозиготный по минорному аллелю генотип СС и минорный аллель С полиморфного локуса rs2228001 гена ХРС ассоциированы с риском развития миомы матки (%2=10,91; р=0,004; OR=3,9; 95% СІ 1,08-14,4 для генотипа и %2=10,69; р=0,001; OR=2,3; 95% СІ 1,4-3,7 для аллеля). Для полиморфных локусов генов XRCCl, XPD и XRCC3 достоверных отличий в распределении частот генотипов и аллелей с риском развития миомы матки выявлено не было. С помощью программы MDR была определена двухлокусная модель взаимодействия ДНК-локусов, приводящая к развитию миомы матки. Вариантом повышенного риска являлась комбинация гетерозиготных генотипов генов ХРС я XRCCl AC/AG (OR=2,27; 95% СІ 1,04-4,92) (Кочетова и др., 2011).
Анализ взаимосвязи полиморфных локусов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК с уровнем хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у рабочих теплоэнергетического производства
Известно, что повышенная генотоксическая чувствительность к факторам среды зависит с одной стороны от целого комплекса модифицирующих факторов, а с другой - от генотипа. В настоящее время накоплен определенный экспериментальный материал о значимости роли отдельных аллельных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК в формировании индивидуальной токсико-генетической чувствительности к широкому спектру наиболее распространенных мутагенов (Баранов и др., 2000; Викторова и др., 2004, 2009, 2011; Benetton et al, 2004; Григорьева, 2007; Akutsu et al., 2007; Tudek, 2007; Измеров и др., 2011; Кочетова и др., 2011; Насыхова и др., 2012; Сальникова и др., 2013; Ахмадишина и др., 2014; Корытина и др., 2014; Hemminki et al., 2015). Однако значимость определенных генетических вариантов существенно меняется в зависимости от множества факторов, таких как популяционные особенности, специфика действующих генотоксикантов на организм человека.
В этой связи в нашем исследовании был проведен анализ хромосомных нарушений в лимфоцитах крови у рабочих в зависимости от различных аллельных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК в условиях теплоэнергетического производства. Изучение взаимосвязи полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК с частотой хромосомных повреждений в когортах лиц, подвергающихся хроническому воздействию негативных факторов теплоэнергетического производства, может увеличить чувствительность цитогенетических показателей как биомаркеров генотоксического воздействия, а также помочь в идентификации групп риска.
Исследование взаимосвязи полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с уровнем хромосомных аберраций Результаты анализа ХА у индивидов с различными генотипами полиморфного локуса 3801 Т С гена CYP1A1 представлены в таблице 22. Между опытной группой и группой контроля были выявлены статистически значимые отличия в частоте ХА у индивидуумов с генотипами ТТ и ТС гена CYP1A1. Не было выявлено достоверных отличий в уровне ХА у лиц с разными генотипами гена CYP1A1 внутри исследуемых групп по всем изученным цитогенетическим показателям.
Полиморфизм генов ферментов репарации ДНК у рабочих теплоэнергетического производства и контрольных индивидов
У рабочих электрического и химического цехов также регистрировался высокий уровень ХА: 3,77 ± 0,53% и 3,86 ± 0,42% соответственно. Наименьшая частота наблюдалась у рабочих ремонтных цехов - 3,02 ± 0,3%.
Статистически значимые различия были установлены между группами рабочих топливно-транспортного цеха и рабочих ремонтных цехов (р=0,004).
Во всех исследованных группах проведен сравнительный анализ девяти полиморфных локусов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYP1A1 (rs4646903), CYP1A2 (rs762551), GSTM1 (del), GSTT1 (del) и генов репарации ДНК XRCC1 (rs25489), APEX1 (rsll30409), hOGGl (rsl052133), ADPRT (rsll36410), XPD (rsl3181). Подбор генов-кандидатов осуществлялся с учетом функционального характера полиморфизма и наличия сопряженности с изменением активности и/или количества соответствующего фермента.
Статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов генов CYP1A1, CYP1A2, XRCC1, АРЕХ1, hOGGl, ADPRT, XPD между опытной группой и группой контроля установлено не было.
Анализ распределения частот полиморфных вариантов гена GSTM1 (del) в исследуемых группах выявил, что частоты генотипов GSTM1 в исследуемых группах значимо не отличались и соответствовали данным, полученным для европеоидов (Garte et al., 2001). Анализ распределения частот генотипов гена GSTT1 (del) в изученных группах выявил статистически значимое повышение частоты делеционного генотипа GSTT1 в опытной группе. В группе контроля частота генотипа GSTT1 del составила 20,38% и соответствовала данным, полученным для европеоидов (19,70%). В опытной группе делеционный генотип GSTT1 встречался с частотой 29,95%, что статистически значимо выше по сравнению с контрольными индивидами (Х2=4,48; р=0,03) и европеоидами (х2=48,32; р=0,0001).
В результате анализа уровня и характера ХА в зависимости от полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков {CYP1A1, CYP1A2, GSTM1, GSTT1) в исследуемых группах были установлены значимые отличия в частоте аберрантных метафаз и аберраций хроматидного типа у рабочих, имеющих различные генотипы гена GSTT1.
У рабочих с делеционным генотипом гена GSTT1 частота метафаз с ХА составила 4,83 ± 0,41%, что статистически значимо выше, чем у рабочих с генотипом GSTT1 без делеции - 3,59 ± 0,19% (рсог=0,009; расу=0,04; ORadj=l,26; 95% СІ 1,10-1,57). Частота аберраций хроматидного типа в группе рабочих, непосредственно занятых на производстве была значимо у рабочих с делеционным генотипом гена GSTT1 и составила 4,17 ± 0,38%, что значимо выше, чем у носителей генотипа GSTT1 п - 3,16 ± 0,18% (рсог=0,04; padj=0,04; ORadj=l,17; 95% СІ 1,01-1,35).
Анализ уровня и характера ХА в зависимости от полиморфных вариантов генов ферментов репарации ДНК {XRCC1, АРЕХ1, hOGGl, ADPRT, XPD) в исследуемых группах позволил установить статистически значимые отличия в частоте аберрантных метафаз и аберраций хроматидного типа у рабочих, имеющих различные генотипы гена XRCC1 (rs25489). У рабочих с гетерозиготным генотипом GA гена XRCC1 частота аберрантных метафаз составила 4,61 ± 0,71%, что статистически значимо выше, чем у рабочих с генотипом GG- 2,53 ± 0,17% (pcor=0,03; padj=0,002; ORadj=l,63; 95% СІ 1,29-2,06). Частота аберраций хроматидного типа у лиц с гетерозиготным генотипом GA гена XRCC1 составила - 4,06 ± 0,71% и была достоверно выше, чем у носителей генотипа GG - 2,14 ± 0,16% (рсог=0,02; расу=0,005; ORadj=l,59; 95% CI 1,22-2,08).
Анализ межгенных взаимодействий позволил выявить информативные 4-х локусные модели, приводящие к увеличению частоты хромосомных нарушений в группе рабочих основных производственных цехов теплоэлектростанций. Одна из них включала в себя гены CYP1A1 (3801Т С), CYP1A2 (-163С А), GSTM1 (del), GSTT1 (del); другая АРЕХ1 (444T G), hOGGl (977C G), XPD (2251 A C) и ADPRT (2285T C).
При анализе межгенных взаимодействий в группах, дифференцированных по статусу курения, наибольший вклад в формирование повышенного уровня ХА у некурящих вносят гены ферментов репарации ДНК (АРЕХ1 (444T G), hOGGl (977C G), XPD (2251A C), ADPRT (2285T C)). У курильщиков же более значима модель, включающая гены системы биотрансформации ксенобиотиков и репарации ДНК (GSTM1 del, АРЕХ1 (444T G), hOGGl (977C G), XPD (2251A C)\ эффекты которых реализуются при взаимодействии с факторами окружающей среды.
В группах, дифференцированных по полу, у мужчин оптимальной моделью межгенных взаимодействий, приводящих к увеличению уровня ХА, является модель: АРЕХ1 (444T G), XRCC1 (839G A), hOGGl (977C G), ADPRT (2285T C), у женщин: APEX1 (444T G), hOGGl (977C G), XPD (2251 A C) и ADPRT (2285T C).
Данные, полученные в результате проведенного исследования вносят вклад в решение фундаментальной научной проблемы экологической и молекулярной генетики, связанной с изучением механизмов индивидуальной чувствительности человека к воздействию неблагоприятных факторов среды.
Результаты данной работы позволят формулировать рекомендации для работников теплоэлектростанций в соответствии с их генетическими характеристиками, а также поможет в процессе верификации причин и степени тяжести патологических процессов у обследуемых рабочих с отягощенным профмаршрутом.