Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Характеристика увеальной меланомы 11
1.1.1 Клиническая характеристика заболевания 11
1.1.2 Клинико-патологические особенности и их прогностическая значимость 13
1.2 Хромосомные нарушения и идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез 18
1.2.1 Увеальная меланома и меланома кожи 19
1.2.2 Хромосомные перестройки в УМ 23
1.2.2.1 Потеря хромосомного материала в увеальных меланомах 25
1.2.2.2 Определение избыточного хромосомного материала в УМ 26
1.2.3 Идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез 26
1.2.3.1 Анализ потери гетерозиготности в УМ 27
1.2.3.2 Поиск мутаций 31
1.2.3.3 Анализ метилирования в УМ 32
1.2.3.4 Изучение профиля экспрессии генов 37
1.3 Ассоциации молекулярных нарушений с клинико-патологическими факторами 39
1.4 Разработка ДНК-диагностических протоколов 43
1.4.1 Определение циркулирующих опухолевых клеток в общем кровотоке 43
1.4.2 Молекулярно-генетическое исследование операционного материала 44
1.4.3 Техника тонкоигольной аспирационной биопсии 45
Резюме 49
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1 Клинический материал 51
2.2 Забор крови и операционного материала 51
2.3 Выделение геномной ДНК 51
2.4 Анализ аллельного дисбаланса 53
2.5 Аллель-специфическая амплификация мутантного аллеля BRAF 55
2.6 Анализ метилирования методом метил-чувствительной ПЦР 56
2.7 Электрофорез в ПААГ 57
2.8 Ультратонкое окрашивание нитратом серебра 58
2.9 Программное обеспечение 58
2.10 Статистическая обработка 59
Глава 3. Результаты и обсуждение 60
3.1 Спектр молекулярных нарушений в увеальных меланомах 61
3.1.1 Анализ потери гетерозиготности в УМ 61
3.1.2 Анализ метилирования в УМ 69
3.1.3 Поиск мутаций 71
3.1.4 Профиль молекулярной патологии в исследованных образцах УМ 72
3.2 Анализ ассоциаций молекулярно-генетических нарушений в увеальных меланомах с клинико-патологическими факторами и факторами прогноза 74
3.3 Спектр молекулярной патологии в УМ и меланоме кожи 77
3.4 Разработка системы ДНК-маркеров для диагностики увеальной меланомы 79
3.5 Диагностика молекулярных маркеров УМ в биоптатах 82
Заключение 86
Выводы 88
Практические рекомендации 89
Список литературы
- Клиническая характеристика заболевания
- Потеря хромосомного материала в увеальных меланомах
- Аллель-специфическая амплификация мутантного аллеля BRAF
- Анализ ассоциаций молекулярно-генетических нарушений в увеальных меланомах с клинико-патологическими факторами и факторами прогноза
Введение к работе
Увеальная меланома (УМ) является наиболее частой первичной злокачественной внутриглазной опухолью у взрослых, заболеваемость увеальной меланомой составляет 7-8 человек на 1 млн. населения в год в России, США и странах Западной Европы. УМ возникает в результате злокачественной трансформации меланоцитов сосудистой оболочки глазного яблока. Современные методы диагностики и лечения УМ направлены на повышение выживаемости пациентов п сохранение глаза как косметического и функционального органа.
Метастазы развиваются у значительной части пациентов с УМ. В частности, смертность в связи с увеальной меланомой достигает 53% в течение пятилетнего периода именно вследствие метастатической болезни. Несмотря на использование новейших достижений в области диагностики и лечения, этот показатель остается по-прежнему чрезвычайно высоким. Выявлены некоторые характерные клинические и гистологические факторы, совокупность которых позволяет условно разделить увеальные меланомы на более «спокойные», с невысоким риском метастазирования, и «агрессивные», для которых риск развития метастазов считается повышенным. Однако необходимость создания диагностической системы маркеров увеальной меланомы очевидна. Поиск и характеристика молекулярных маркеров диагностики и прогноза является, на сегодняшний день, одной из важнейших задач онкологии. Создание эффективных диагностических протоколов позволит в дальнейшем оценить прогноз заболевания и предпринять адекватные меры для выявления и лечения метастатической болезни у пациентов с увеальной меланомой. Необходимым этапом создания систем маркеров УМ является анализ наиболее характерных и часто встречающихся молекулярно-генетических нарушений в первичных увеальных меланомах.
Настоящая работа посвящена изучению структурных и функциональных генетических нарушений в увеальных меланомах, а также оценке диагностической значимости этих изменений как потенциальных маркеров УМ.
Актуальность работы определяется следующими факторами:
1). Увеальная меланома является наиболее частой первичной злокачественной внутриглазной опухолью, составляющей 12% от меланом всех локализаций, однако
молекулярные механизмы ее патогенеза к настоящему моменту изучены недостаточно.
2). Эффективное лечение увеальной меланомы связано не только со своевременной диагностикой и лечением первичной опухоли, но также ранним выявлением и лечением метастатической болезни. Есть предположения, что ряд характерных молекулярных нарушений в увеальных меланомах может быть ассоциирован с опухолевой прогрессией и развитием метастазов.
3). Молекулярные методы диагностики увеальной меланомы в настоящее время в отечественной лабораторной практике не используются, хотя успешно применяются в медицинских центрах за рубежом.
Цель н задачи исследования
Целью настоящей работы является анализ молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием увеальной меланомы и изучение потенциала их использования в клинической практике для расширения возможностей диагностики, а также прогнозирования течения заболевания.
В соответствии с поставленной целью предполагается решить следующие задачи:
Исследовать аллельное состояние микросателлитных маркеров в локусах генов-супрессоров опухолевого роста и хромосомных районах, наиболее часто делетируемых в злокачественных опухолях.
Определить статус метилирования промоторных районов ряда генов-супрессоров опухолевого роста.
В увеальных меланомах провести анализ молекулярных нарушений в генах и хромосомных районах, наиболее часто повреждаемых в меланомах кожи.
Определить ассоциации молекулярно-генетических нарушений с клинико-патологическими данными.
Оценить возможность использования тонкоигольной аспирационной биопсии для скрининга молекулярных нарушений.
Научная новизна
Настоящая работа является первым широкомасштабным молекулярно-генетическим исследованием увеальных меланом на территории Российской Федерации и направлена на поиск молекулярных маркеров увеальных меланом с перспективой создания комплексной системы диагностических и прогностических маркеров, позволяющих врачу сделать правильный выбор в отношении тактики лечения и дальнейшего наблюдения пациентов.
Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование, включающее определение не только ранее описанных молекулярных нарушений, но и изучение состояния генов и сигнальных каскадов, связанных с регуляцией клеточного цикла, клеточной прогрессией и дифференцировкой.
Выявлено наличие характерных для увеальной меланомы генетических и эпигенетических нарушений (потеря одной копии хромосомы 3 (моносомия 3), делеции 1р и 8р, метилирование RASSF1A). В исследовании обнаружены ассоциации моносомии 3 с характеристиками агрессивного течения меланомы, такими как эпителиоидный клеточный тип, цилиарная локализация и пигментация опухоли. Аллельные делеции 1р не могут рассматриваться как патогномоничное нарушение в увеальных меланомах, однако определена их достоверная ассоциация с экстрасклеральной инвазией опухоли, снижающей выживаемость пациентов. Метилирование гена RASSF1A является неслучайным изменением, обнаруженным в увеальных меланомах: его отсутствие подтверждено в условно-нормальной хориоидее тех же пациентов. Также определена его ассоциация с отсутствием аллельных потерь по маркерам RASSFJA в хромосоме 3.
Установлено, что основной спектр молекулярных нарушений, характерный для меланомы кожи, не играет важной роли в запуске патологических процессов в увеальной меланоме.
Практическая значимость
Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование 107 пациентов с диагнозом первичная увеальная меланома. Обнаружение моносомии 3 способствует дифференциальной диагностике УМ, так как это нарушение является специфическим, не
характерным для другой онкопатологии. Определена ассоциация структурных и количественных нарушений в хромосоме 3 и 1р36 с клинико-морфологическими характеристиками и факторами прогрессии опухоли, что позволит использовать анализ этих нарушений в качестве маркеров прогрессии на различных стадиях УМ. Показано, что тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) представляет собой эффективный способ получения материала для генетического анализа пациентов с увеальной меланомой. Результаты, полученные в представленной работе, легли в основу разработки системы молекулярных маркеров УМ в дополнение к применяемым диагностическим методам — гистологическому и биохимическому. Внедрение таких систем расширяет возможности диагностики, в том числе дифференциальной, а также позволяет определить риск метастазирования опухоли и выбрать тактику терапии.
Апробация работы
Результаты исследования были представлены на ежегодных Европейских конференциях по генетике человека в 2007 г. (Ницца, Франция) и 2008 г. (Барселона, Испания), на конгрессе Международного общества онкоофтальмологов в 2007 г. (Сиена, Италия), Всероссийской научно-практической конференции «Современные технологии в дифференциальной диагностике и лечении внутриглазных опухолей» в 2007 г. (Москва), конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в 2008 году (Москва).
Публикации
Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.
Внедрение результатов работы в клиническую практику
На основании результатов проведенной работы разработаны новые медицинские ДНК-технологии «Молекулярно-генетическая методика выявления специфических молекулярных маркеров увеальной меланомы» и «Молекулярно-генетическая методика
оценки прогрессии первичной опухоли при увеальной меланоме» (Поданы заявки на регистрацию новых медицинских технологий). Методические подходы, разработанные в диссертационной работе, используются в МНИИ Глазных Болезней им. Гельмгольца.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, списка сокращений, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 153 ссылки. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками.
Положения, выносимые на защиту
Моносомия 3 является специфическим хромосомным нарушением, выявляемым не менее чем в 45% увеальных меланом и определяющим агрессивное течение заболевания. Для УМ также характерны аллельные делеции в локусах 1р36 и 8р22.
Метилирование RASSFIA определяется преимущественно в меланомах, не имеющих моносомии 3 и не характерно для условно-нормальной хориоидеи.
Молекулярный патогенез УМ и меланомы кожи различен. Для увеальной меланомы не характерны основные молекулярные нарушения, свойственные меланоме кожи, в том числе мутация ТІ796А гена BRAF, аллельные делеции в локусе PTEN, а также потеря гетерозиготности и гиперметилирование промоторов генов пути регуляции CDKN2A-+RB1.
Разработаны системы ДНК-маркеров для выявления молекулярных нарушений в образцах увеальной меланомы, полученных в результате резекции опухоли и тонкоигольной биопсии.
Клиническая характеристика заболевания
Увеальная меланома (УМ) является наиболее частой первичной злокачественной внутриглазной опухолью, составляющей 12% от меланом всех локализаций и 90% от всех внутриглазных новообразований у взрослых (Саакян СВ., 2007). Заболеваемость меланомой увеального тракта в различных регионах неравнозначна: за год в ряде стран Западной Европы эту опухоль диагностировали у 7 из 1 млн. человек, в то же время в Средней Азии, в Испании и некоторых районах Италии этот показатель оказался значительно меньше (2 на 1 млн. населения), а в Скандинавских странах, напротив, отмечено его увеличение до 8-10 на 1 млн. человек (Virgili et al., 2007, Саакян с соавт., 2002). В России заболеваемость увеальной меланомой по обращению в различных регионах колеблется от 6,23 до 8 человек на 1 млн. взрослого населения в год (Саакян с соавт., 2002). В Москве заболеваемость увеальной меланомой составляет, по некоторым данным, 11-13 случая на 1 млн. взрослого населения в год (Поддубная с соавт., 2003, Гришина с соавт., 1998). Меланома увеального тракта выявляется у пациентов в возрасте 30-80 лет, пик заболеваемости приходится на пятое-шестое десятилетие жизни (Albert et al., 2003).
УМ возникает в результате злокачественной трансформации меланоцитов сосудистой оболочки глазного яблока (Moriaux et al., 2005). В генезе увеальной меланомы возможны три механизма: возникновение её de novo (чаще всего), на фоне существующего хориоидального невуса, либо на фоне существующего окулодермального меланоцитоза (Саакян с соавт., 2002).
Благодаря внедрению современных методов диагностики идентификация увеальной меланомы стала представлять гораздо меньше трудностей, чем в прошлом. Помимо офтальмоскопии (рис. 1А), в диагностике увеальной меланомы используются ультрасонография (рис. 1Б), флуоресцентная ангиография, а также магнитно-резонансная визуализация, которые позволяют дифференцировать увеальную меланому от других опухолей (гемангиома хориоидеи, ангиоматоз сетчатки, невус, меланоцитома, метастатическая опухоль, злокачественная лимфома, ретинобластома, хористома) и опухолеподобных заболеваний (гранулема и гамартома сетчатки, хориоидит, колобома хориоидеи, саркоидоз, а также гиперплазия пигментного эпителия сетчатки различного генеза) (Саакян с соавт., 2002, Склярова Н.В., 2004, Albert et al., 2003). Однако частота клинически нераспознанных случаев (выявленных при гистологическом исследовании энуклеированных глаз) достигает 12%. Этот факт можно объяснить многообразием клинических симптомов и их многочисленными комбинациями (Саакян с соавт., 2002).
Методы лечения включают локальную резекцию, энуклеацию пораженного глаза, радиотерапию, а также транспупиллярную термотерапию. Современные методы диагностики и лечения УМ направлены на повышение выживаемости пациентов и сохранение глаза как косметического и функционального органа (Albert et al., 2003, Bell et al., 2004 Склярова H.B., 2004).
Витальный прогноз при увеальной меланоме всегда серьезен, а поздняя диагностика опухоли его резко отягощает. Метастазы развиваются у значительной части пациентов с увеальной меланомой. Несмотря на многочисленные достижения в диагностике и лечении увеальной меланомы, уровень пятилетней выживаемости практически не изменяется в течение последних 30 лет (Саакян с соавт., 2002, Albert et al.,
2003, Virgili et al., 2008). Выживаемость пациентов в течение 5, 10 и 15 лет составляет 65%, 52%) и 46%) соответственно (Bakalian et al., 2008). Наибольшая частота выявления метастазов приходится на первые 3 года с момента установления диагноза (Саакян с соавт., 2002). Однако описаны случаи возникновения метастазов через 25 и 40 лет после лечения (Coupland et al., 1998, Gunduz et al., 1998). Наиболее часто метастазы обнаруживаются в печени (87-93%), легких (24-46%), костях (16-29%) и коже (11-17%)(Albert et al., 2003, Singh et al., 2001). При этом скриннпнговые обследования пациентов, проводимые с целью раннего выявления метастазов, показывают недостаточный уровень чувствительности, хотя выявление метастазов хотя бы до момента их клинического проявления могло бы значительно улучшить показатели выживаемости. Продолжительность жизни после клинической диагностики метастазов составляет около 5-9 месяцев (Albert et al., 2003).
Клетки распространяются из первичного очага путем гематогенной диссеминации. При этом преимущественную локализацию метастазов в печени нельзя объяснить особенностями системы кровообращения, так как первая микроциркуляторная сеть, оказывающаяся на пути опухолевых клеток, находится в легких (Albert et al., 2003, Bakalian et al, 2008).
В прошлом, некоторые эксперты, ссылаясь на возможность быстрого прогрессирования и высокий риск развития метастазов даже для небольших меланом, предлагали энуклеацию как единственный способ предотвращения риска для жизни пациента (Albert et al., 2003). В дальнейшем, однако, был определен набор характерных клинических и гистологических факторов, совокупность которых позволила разделить увеальные меланомы на «спокойные», с невысоким риском метастазирования, и более «агрессивные», для которых риск развития метастазов считался повышенным (Singh et al., 2001, d Hermies et al., 2007). Это разделение в значительной степени условно, в связи с наличием большого количества оцениваемых факторов и с разночтениями в оценке самих факторов.
Одним из важных прогностических факторов считается размер опухоли (Diener-West et al., 1992, Albert et al., 2003, Ehlers et al, 2006, d Hermies et al, 2007).
Предполагается, что крупные опухоли имеют менее благоприятный прогноз. Однако даже сама оценка размеров опухоли вызывает определенные разногласия. В прогностических целях было предложено измерять наибольший размер опухоли, протяженность ее контакта со склерой и толщину (Albert et al., 2003). Также популярна классификация, предложенная в 1996 году Diener-West: опухоли предлагается разделять на малые (толщина Змм, диаметр основания 10 мм), средние (толщина 3-8 мм, диаметр основания 10-15 мм) и большие (толщина 8мм, диаметр основания 15 мм). Смертность в течение пятилетнего периода для этих групп колебалась значительно (16%, 32%, 53% соответственно). Кроме того, это разделение в достаточной мере соответствует общепринятой классификации TNM (Ті 10 мм, Т2 10-15 мм и Тз 15 мм) (d Hermies et al., 2007).
Многие полагают, что локализация опухоли также играет важную роль в развитии метастазов. Меланомы, локализующиеся в цилиарном теле, чаще склонны к метастазированию по сравнению с меланомами хориоидеи (Singh et al., 2001).
Меланомы радужки выделены в отдельную группу, они ассоциированы со значительно меньшей смертностью по сравнению с меланомами хориоидеи и цилиарного тела (Albert et al., 2003, Singh et al., 2001, Singh et al., 2005). По характеру роста чаще выявляются узловая и смешанная формы меланом радужки, в редких случаях встречается диффузный (анулярный) тип опухоли. Прогноз для жизни, как правило, благоприятен, метастазирование наблюдается в 5-15%), в основном при диффузных формах (Саакян с соавт., 2002).
Потеря хромосомного материала в увеальных меланомах
К настоящему моменту, большинство сообщений о хромосомных нарушениях, ассоциированных с увеальной меланомой, базируются на данных цитогенетических исследовании и сравнительной геномной гибридизации (Speicher et al., 1994, Becher et al., 1997, Tschentscher et al., 2000, Kilic et al, 2006, Hughes et al., 2005 и др.). Меньшее количество исследований было посвящено определению генов, ответственных за возникновение и прогрессию увеальной меланомы. Чаще всего, в увеальных меланомах обнаруживаются крупные хромосомные нарушения, захватывающие хромосомы целиком, отдельные плечи или обширные районы, которые могут содержать множество регуляторных генов. При наличии таких крупных повреждений бывает трудно предположить, какие именно гены вовлечены в патогенез опухоли. В этом случае выявление структурных нарушений в этих районах может помочь в поиске генов, вовлеченных в канцерогенез. Цитогенетичесие исследования могут помочь в определении генов-кандидатов только в том случае, если будут нацелены на обнаружение минимальных хромосомных участков, подверженных структурным перестройкам.
Наличие гетерозиготных делеций в областях локализации генов-супрессоров чаще всего идентифицируют с помощью генетического анализа состояния гипервариабельных микросателлитных маркеров, локализованных внутри генов-супрессоров или тесно сцепленных с ними. Микросателлитный маркер представляет собой участок ДНК с определенной геномной локализацией, содержащий короткие тандемные повторы (STR. -Short Tandem Repeats). При полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, фланкирующих повтор, амплифицируются два фрагмента, соответствующих двум гетерозиготным аллелям. Когда интенсивность сигнала одного из аллелей в опухоли отличается от сигнала соответствющих аллелей нормальной ткани, делается вывод о наличии аллельного дисбаланса - потери гетерозиготносте (ПГ) (Залетаев с соавт., 2004).
Другим методом выявления ПГ является использование однонуклеотидных полиморфизмов (Single nucleotide polymorphisms (SNPs)). Полиморфизмы широко распространены в геноме и их относительно небольшая информативность (наличие в гетерозиготном состоянии) компенсируется при одновременном исследовании множества локусов с помощью микрочипов. Современные технологии позволяют анализировать на одном чипе до 100 000 полиморфизмов (Garnis et al., 2004).
Некоторым ограничением для использования упомянутых методов является доступность полиморфных маркеров в интересующем регионе. Кроме того, ограниченное количество ДНК (например, из микродиссекционного образца) не позволит провести широкомасштабный поиск аллельных потерь (Garnis et al., 2004). Однако, в случаях, когда проводится прицельный поиск делеций в локусах регуляторных генов, анализ аллельного дисбаланса имеет явные преимущества и является методом выбора, как, например, в исследовании Tschentscher et al. (2001).
Таким образом, изучение состояния зиготности генов-супрессоров в опухоли является необходимым этапом изучения механизмов канцерогенеза, их влияния на прогноз и течение злокачественной трансформации. Анализ аллельного дисбаланса (потери гетерозиготности) можно считать следующим шагом, после оценки крупных хромосомных изменений, в идентификации отдельных генов, вовлеченных в патогенез заболевания.
Хромосома 3. Необходимо подчеркнуть, что для увеальных меланом характерна именно потеря целой хромосомы, в то время как перестройки в ней обнаруживаются достаточно редко. Структурные нарушения в хромосоме 3 наблюдаются в различных типах опухолей, однако чаще всего они выявляются только в коротком плече (Knuutla et al, 2002, Riquelme et al., 1999., Choi et al, 2007, Zabarovsky et al, 2002). Потеря целой копии хромосомы 3 в клетках УМ дала возможность предположить вовлеченность в патогенез УМ опухолевых супрессоров, локализованных на обоих плечах хромосомы 3. Анализ обнаруженных делеций показал наиболее часто делетируемые локусы Зр25, 3(р14.2-р13) и 3(q24-q26), однако гены, инактивация которых играла бы ключевую роль в патогенезе УМ, так и не были определены (Tschentscher et al., 2001, Cross et al., 2006, Blasi et al., 1999, van Gils et al., 2008). Также в 5-15% случаев выявляется изодисомия 3, являющаяся результатом потери одной из хромосом и дупликации оставшейся (White et al., 1997, Harbour JW., 2007). При таком нарушении цитогенетческий анализ покажет наличие двух копий хромосомы 3, а микросателлитный анализ выявит потерю гетерозиготности.
При помощи стандартных цитогенетических исследований и анализа потери гетерозиготности в различных опухолях был выявлен целый ряд потенциальных супрессоров онкогенеза. Это DUTT/ROBOl, FHIT, FOXP1, MLH1, DRR1, ВАРІ, ARP, CACNA2D2, BLU, RASSF1A, FUS1, HYAL2, SEMA3B, SEMA3F, RBM5, RBM6, LIMD1, CTNNB1, DLC1, VHL, RARB и др. (Zabarovsky et al., 2002).
Ген FHIT (fragile histidine triad gene), локализующийся в Зр 14.2, имеет в своем составе «ломкий» сайт FRA3B (Smith et al., 2007). Наличие аллельных потерь в Зр14.2 было зафиксировано во многих эпителиальных новообразованиях. Кроме того, эпигенетическая инактивация, представляющая собой опухоль-специфичное метилирование FHIT, не определяющееся в соответствующих нормальных тканях, обозначила важную роль FHIT в подавлении опухолевого роста (Tanaka et al., 1998, Wistuba et al., 2002). Также было продемонстрировано, что введение конструкций, содержащих экспрессирующийся ген FHIT «дикого типа» подавляет опухолевый рост (Croce et al., 1999, Siprashvili et al, 1997).
Молекулярные нарушения гена-супрессора VHL, локализованного в Зр25-2б, являются причиной развития синдрома Хиппеля-Линдау, а также обнаруживаются при спорадическом светлоклеточном раке почки (Михайленко с соавт., 2008). Инактивация VHL при синдроме Хиппеля-Линдау приводит к развитию многочисленных опухолей глаза, ЦНС, почек, внутреннего уха, поджелудочной железы, а также печени, легких и яичника (Chan et al., 2007). Молекулярные механизмы, благодаря которым нарушение экспрессии VHL приводит к образованию опухоли, пока недостаточно ясны. Считается, что супрессия VHL активирует множество ангиогенных факторов, стимулирующих рост таких новообразований, как гемантиобластомы, цисты и др.
Ген RASSF1A кодирует белок, сходный с белками группы Ras. Наиболее изученным эффектором Ras является Raf, серин-треонин киназа, которая контролирует каскад Ras-Raf-MEK-ERK, активирующий пролиферацию и фосфатидитинозитол-3-киназный каскад, активность которого ингибирует апоптоз. Также было обнаружено, что белок нарушает механизм аккумуляции циклина D1, приводя к остановке клеточного цикла. Семейство RASSF, насчитывает 8 белков, RASSF1 (123F2), RASSF2 (Rasfadin/KIAA0168), RASSF3, RASSF4 (AD037), RASSF5 (NORE1), RASSF6, RASSF7 (HRC1) и RASSF8, большинство из которых в той или иной степени являются супрессорами опухолевого роста (Song et al., 2004, van der Weyden et al., 2007).
Аллель-специфическая амплификация мутантного аллеля BRAF
Электрофорез в неденатурирующем ПААГ Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 8% ПААГ в течение 1 -2 часов. Состав 8% ПААГ: - 8,4% мл 30% раствора АА(29:1), - 1,5 мл 1 Ох буфера ТВЕ, - до 30 мл дистиллированной воды, - 600 мкл 10% аммония персульфата (APS), - 26 мкл TEMED Электрофорез в денатурирующем ПЛАТ Электрофорез продуктов ПЦР в 10% денатурирующем ПААГ проводили в течение 2-3 часов. Состав 10% денатурирующего ПААГ: - 8,4 мл 30% раствора АА(29:1), - 8.0 мл формамида, - мочевина до конечной концентрации 7 М, - 2,5 мл 1 Ох буфера ТВЕ, - до 30 мл дистиллированной воды, - 600 мкл 10% аммония персульфата (APS), - 26 мкл TEMED
Визуальный контроль пробега проб ДНК в гелях проводили по ксиленцианолу и бромфеноловому синему. Затем проводили окрашивание гелей.
После электрофореза гель помещали в раствор 10% метанола и 5% уксусной кислоты на 10-15 минут. Затем дважды отмывали дистиллированной водой. После этого гель инкубировали в растворе 0,011 М AgNCb в течение 10-15 минут, трижды промывали в дистиллированной воде. Проявление проводили в растворе проявителя следующего состава: 0,75 М NaOH; 0,5 М НСНО; 2,3 тМ Na(BH4) в течение 10-15 минут в зависимости от интенсивности проявления геля.
Для сохранения результатов ПААГ проводили сканирование гелей.
Компьютерный анализ проводился с помощью следующих программ: 1. Выявление микросателлитных районов, подбор маркеров, определение генов, расположенных в делетированных регионах проводилось с использованием баз данных: - The UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu), - The Ensembl Genome Databases (http://www.ensembl.org), - NCBI UniSTS (http://ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=unists), - BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
2. Компьютерное конструирование олигонуклеотидных праимеров и подбор условий для проведения ПЦР с использованием программы РгітегЗ Input 0.4.0 (http ://frodo. wi .mit. edu).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Пациентов делили на группы по клиническим критериям и сравнивали в этих группах частоты аллельных потерь по каждому локусу с помощью точного критерия Фишера и критерия х - квадрат. Сравнение средних величин внутри каждой из групп, разделенных по наличию определенных хромосомных аберраций, проводили при помощи критерия Манна-Уитни. Двусторонний р 0.05 рассматривали как статистически достоверный.
В представленную работу вошли результаты молекулярно-генетического обследования пациентов с первичной увеальной меланомой. Во всех случаях заболевание носило спорадический характер. Диагноз увеальпая меланома был подтвержден гистологически в отделении патологической анатомии и гистологии глаза НИИ глазных болезней имени Гельмгольца. Работу проводили на образцах периферической крови и операционном материале (УМ + условно-нормальная хориоидея) 107 пациентов и на образцах периферической крови и биопсийных образцах (кровь + цитологические препараты) шести пациентов. Для проведения статистического анализа пациенты были разделены на группы (см. табл. 5).
Согласно данным литературы, увеальная меланома характеризуется широчайшим спектром молекулярных нарушений: от крупномасштабных, захватывающих отдельные хромосомы или их плечи делеций и амплификации, до точечных мутаций в отдельных генах, а также эпигенетических нарушений (Albert et al., 2003). Наша работа имела целью не только выявление молекулярных маркеров, позволяющих определять характерные черты и потенциал злокачественного процесса, но и создание предпосылок к выявлению генов-кандидатов, вовлеченных в патогенез опухоли, что могло бы привести к пониманию молекулярных изменений, которые являются основой образования и прогрессии увеальной меланомы.
В настоящем исследовании мы провели анализ аллельного дисбаланса с помощью микросателлитных маркеров (рис. 10) в хромосомных районах, наиболее подверженных структурноіі патологии в УМ и в районах локализации следующих генов-супрессоров опухолевого роста: ІрЗб, ІрЗІ.З, Зр25.3 (VHL), Зр21.3 (RASSF1A), Зр14.2 (FHIT), 3ql2, 3q26.3 (TNFSF10), 3q28, Sp22, 9(p21.2-p21.3) (CDKN2A), 10(q23.2-q23.3) (PTEN), 13ql4.2 (RBI).
Рисунок 10. Пример микросателлитного анализа для образцов увеальной меланомы с использованием нескольких микросателлитных маркеров. ПГ - потеря гетерозиготности по указанному маркеру, гет. - маркер гетерозиготен (потери гетерозиготности нет), гом. -маркер гомозиготен (не информативен).
Анализ ассоциаций молекулярно-генетических нарушений в увеальных меланомах с клинико-патологическими факторами и факторами прогноза
Несмотря на многочисленные доводы «за» общий патогенез увеальной меланомы и меланомы кожи (Hoglund et al., 2001, Landreville et al., 2008), анализ молекулярных нарушений в УМ не выявляет тех же повреждений, которые характерны для меланомы кожи. Возвращаясь к описаным ранее ключевым каскадам регуляции, повреждаемым в меланомах кожи, теперь мы имеем возможность сопоставить частоты обнаруженных нами молекулярных повреждений при обоих патологических состояниях. Наиболее частого повреждения, определяемого в меланомах кожи (до 70%) (Miller et al., 2006), мутации Т1796А гена BRAF нами выявлено не было. Результаты нашего исследования не противоречат данным большинства авторов (Weber et al, 2003, Cruz et al., 2003, Kilic et al., 2004, Spendlove et al., 2004 Zuidervaart et al., 2005). Также не выявлено аллельных потерь в локусе PTEN, второго наиболее частого нарушения в спорадических злокачественных меланомах кожи. Структурные нарушения в локусе 10q, определяемые не менее чем в 20-40% меланом кожи, достаточно разнообразны - от субмикроскопических, выявляемых с помощью микросателлитного анализа, до крупных нарушений, захватывающих целое плечо хромосомы 10 (Reifenberger et al, 2000). Ранее в одной из публикаций сообщалось о наличии субмикроскопических гемизиготных делеций в локусе PTEN (Abdel-Rahman et al., 2006), однако других сообщений о наличии этого нарушения в УМ пока нет. Также не были определены аллельные делеции генов CDKN2A и RB1, определяющиеся не менее чем в 50% спорадических меланом кожи. Метилирование CDKN2A было определено в единичных образцах, а метилирования RB1 выявлено не было (определяется с частотой соответственно 10% и 40% в меланоме кожи)(табл. 10).
Основной спектр молекулярных повреждений при спорадической меланоме кожи и увеальной меланоме по данным различных авторов (Chin et al., 2006, Miller et al., 2006, Rastetter et al., 2007, Uribe et al, 2005, Albert et al., 2003, Abdel-Rahman et al., 2008 и
др.). Результаты отдельных авторов, не согласующиеся с остальными данными, отделены Моносомия 3 является специфическим нарушением, характерным для меланомы увеалыюго тракта и в меланомах кожи обычно не определяется (Belmar-Lopez et al., 2008).
Молекулярными нарушениями, характерными для обеих опухолей, являются метилирование RASSF1A и аллельные потери в локусе 1р36. Делеции 1р36 не являются ранним событием в патогенезе обеих опухолей, это явление чаще связывают с опухолевой прогрессией (Poetsch et al., 2003), а метилирование RASSF1A является одним из наиболее частых событий в канцерогенезе и отмечено не менее чем в 37 типах опухолей (Donninger et al., 2007).
Таким образом, основной спектр молекулярных нарушений, характерный для меланомы кожи, не играет важной роли в запуске патологических процессов в увеальной мелаиоме. Естественно, что в процессе канцерогенеза различных опухолей происходит повреждение одних и тех же сигнальных каскадов, однако к настоящему моменту можно предполагать, что ключевые моменты патогенеза для этих опухолей не идентичны. Предполагается, что различия в популяциях меланоцитов кожи и увеального тракта появляются еще в процессе эмбрионального развития в процессе миграции предшественников меланоцитов кожи в эпителий, а меланоцитов увеального тракта -глубоко в мезодермальные ткани (Belmar-Lopez et al., 2008). Возможно, изучение путей дифференцировки этих двух клеточных популяций поможет понять причины различий в патогенезе двух опухолей.
Проблемы дифференциальной диагностики увеальной меланомы связаны с многообразием ее проявлений. С учетом полиморфности симптомов меланому приходится дифференцировать от большого количества заболеваний как опухолевой, так и неопухолевой природы. Однако полиморфизм клеток и их атипия усложняют морфологическую диагностику УМ. В этих случаях генетическое исследование может быть важным дополнением к используемым в настоящее время методам.
Первоначальная выборка содержала образцы УМ 120 пациентов с клиническим диагнозом «первичная увеальная меланома». Экстракция ДНК при помощи фенол-хлороформного метода позволила выделить достаточное для анализа количество ДНК в 117 случаях. 10 образцов были исключены из исследования, после того как диагноз «увеальная меланома» был отвергнут при гистологическом исследовании (2 - метастазы, 1 - глиома, 1 — гемофтальм, 1 — миоэпителиальная опухоль, 5 — отсутствие в образце опухолевых клеток). Таким образом, в окончательную выборку были включены 107 образцов. Примечательно, что для образцов, исключенных из выборки после получения результатов гистологического исследования аллельные делеции в специфических локусах (маркеры хромосомы 3 и 1р) выявлены не были. В одном из метастазов ПГ определялась по маркеру D9S169 (9р21.2). В одном образце (гемофтальм неясной этиологии) было выявлено метилирование RASSF1A.
Микросателлитные маркеры, использованные в работе, позволили получить информацию о состоянии ряда локусов хромосомы 3 и 1р для всех образцов, позволив сделать вывод о наличии или отсутствии аллельного дисбаланса. Анализ метилирования был также доступен для всех 107 образцов. Количественные и структурные нарушения хромосом 3 и 1р имеют статистически достоверную ассоциацию с неблагоприятными факторами прогноза, мы можем рекомендовать проведение молекулярно-генетического анализа для оценки агрессивности течения УМ в дополнение к проводимым в настоящее время морфологическим и иммуногистохимическим. Анализ аллельных делеций хромосом 3 и 1 позволит сориентировать врача в дифференциальном диагнозе и прогнозе заболевания и оценить риск возникновения осложнений и метастазирования увеальной меланомы.
Для оценки состояния хромосомы 3 мы предлагаем панель из десяти микросателлитных маркеров, локализованных на обоих плечах хромосомы 3 (см. рис 18), позволяющую выявить делеций различной протяженности, а также потерю хромосомы 3. Три изучаемых локуса располагаются в районах, подверженных структурным перестройкам, то есть выявление наиболее распространенных делеций при использовании предложенных маркеров также представляется возможным.
