Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Основная часть 12
2.1. Обзор литературы 12
2.1.1. Типы SNP 12
2.1.2. Генетические маркеры свиней 13
2.1.3. Маркеры воспроизводительных качеств свиней
2.1.3.1. Эстрогеновый рецептор ESR1 17
2.1.3.2. Бета-субъединица фолликулостимулирующего гормона FSHB 21
2.1.3.3. Коактиватор ядерных рецепторов 1 NCOA1 25
2.1.4. Маркеры мясных и откормочных качеств свиней 28
2.1.4.1. Гамма 3 субъединица протеинкиназы PRKAG3 32
2.1.4.2. Инсулиноподобный фактор роста 2 IGF2 36
2.1.4.3. Рецептор меланокортина 4 MC4R 39
2.1.4.4.Гипофизарный транскрипционный фактор POU1F1 45
2.1.5. Генетическая устойчивость к колибактериозу 48
2.1.5.1. Эшерихия коли рецептор ECR F18/FUT1 49
2.1.5.2. Муцин 4 MUC4 55
2.1.6. Заключение по обзору литературы 59
2.2. Материалы и методы 60
2.2.1. Материалы 60
2.2.1.1. Животные 60
2.2.1.2. Материально-техническое обеспечение исследований 64
2.2.2. Методы исследований 71
2.3. Результаты собственных исследований 76
2.3.1. Разработка и усовершенствование методик диагностики
полиморфизма генов маркеров продуктивности свиней 76
2.3.1.1. Маркеры воспроизводительных качеств 76
2.3.1.1.1. Тест-системы определения полиморфизма ESR1 на основе пиросеквенирования и ПЦР-ПДРФ анализа 77
2.3.1.1.1.1. Тест-система на основе метода пиросеквенирования 77
2.3.1.1.1.2. Тест-система на основе метода ПЦР-ПДРФ 80
2.3.1.1.2. Тест-система определения полиморфизма NCOA1 на основе ПЦР-ПДРФ анализа 83
2.3.1.2. Маркеры мясных и откормочных качеств 87
2.3.1.2.1. Тест-система определения полиморфизма PRKAG3 на основе пиросеквенирования з
2.3.1.2.2. Тест-система определения полиморфизма гена IGF2 на основе метода пиросеквенирования 92
2.3.1.2.3. Разработка тест-системы определения полиморфизма гена MC4R 95
2.3.1.2.4. Разработка тест-системы определения полиморфизма гена POU1F1 98
2.3.1.5. Разработка тест-системы определения полиморфизма гена RYR1 100
2.3.1.6. Разработка тест-системы определения полиморфизма гена ECR F18/FUT1 102
2.3.1.9. Разработка мультиплексной системы диагностики полиморфизма гена ESR1, RYR1 и ECR F18/FUT1 104
2.3.2. Исследование аллелофонда свиней различных пород по ДНК маркерам 108
2.3.2.1. ДНК-маркеры воспроизводительных качеств 108
2.3.2.1.1. Изучение полиморфизма гена ESR1 109
2.3.2.1.2. Изучение полиморфизма гена FSHB 118
2.3.2.1.3. Изучение полиморфизма гена NCOA1 123
2.3.2.2. ДНК-маркеры мясной и откормочной продуктивности 130
2.3.2.2.1. Изучение полиморфизма гена PRKAG3 130
2.3.2.2.2. Изучение полиморфизма гена IGF2 149
2.3.2.2.3. Изучение полиморфизма гена MC4R 157
2.3.2.2.4. Изучение полиморфизма гена POU1F1 164
2.3.2.3. ДНК-маркеры устойчивости к колибактериозу 170
2.3.2.3.1. Изучение полиморфизма гена ECR F18/FUT1 170
2.3.2.3.2. Изучение полиморфизма гена MUC4 176
2.3.2.4. Сравнительные исследования аллелофонда свиней и дикого кабана по ДНК-маркерам 181
2.3.3. Изучение продуктивных качеств свиней в зависимости от генетического полиморфизма исследуемых генов 184
2.3.3.1. Продуктивные качества свиней с различными генотипами по гену ESR1 185
2.3.3.2 Продуктивные качества свиней с различными генотипами по гену FSHB 188
2.3.3.3. Продуктивные качества свиней с различными генотипами по гену NCOA1 194
2.3.3.4. Продуктивные качества свиней с различными генотипами по гену PRKAG3 196
2.3.3.5. Продуктивные качества свиней с различными генотипами по гену IGF2 200
2.3.3.6. Продуктивные качества свиней с различными генотипами по гену MC4R 212
2.3.3.7. Продуктивные качества свиней с различными генотипами по гену POU1F1 220 2.3.3.8. Продуктивные качества свиней с различными генотипами по гену ECR F18/FUT1 227
2.3.3.9. Продуктивные качества свиней с различными генотипами по гену MUC4 229
3. Заключение 236
3.1. Обсуждение результатов исследований 236
3.2. Выводы 263
3.3. Практические предложения 269
Список литературы
- Бета-субъединица фолликулостимулирующего гормона FSHB
- Материально-техническое обеспечение исследований
- Тест-системы определения полиморфизма ESR1 на основе пиросеквенирования и ПЦР-ПДРФ анализа
- Исследование аллелофонда свиней различных пород по ДНК маркерам
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Сохранение биоразнообразия видов и
пород сельскохозяйственных животных является основой создания устойчивых систем
производства продукции животноводства (CBD, 1991; FAO, 2012). Для оценки
биоразнообразия на генетическом уровне наряду с селекционно-нейтральными
находят применение ДНК-маркеры локусов количественных признаков, QTL
(Сулимова Г.Е., 2004; Терлецкий В.П. и др., 2015). Использование ДНК-маркеров QTL
делает возможным не только характеристику генетического разнообразия пород и
популяций животных, но и оценку их генетического потенциала по хозяйственно-
полезным признакам (Селионова М.И. и др., 2014). ДНК-диагностика QTL имеет ряд
преимуществ перед традиционной селекцией по фенотипу: она позволяет оценивать
индивидуумов в раннем возрасте вне зависимости от пола и без учета изменчивости,
обусловленной внешней средой (Калашникова Л.А. и др., 2000; Захаров И.А., 2006).
Оценка генотипа способствует выявлению и быстрому распространению
предпочтительных аллелей из ресурсных популяций в популяции реципиентов с целью
улучшения продуктивных качеств и устойчивости к заболеваниям улучшаемых пород
(Адаменко В.А., 2005). Особую актуальность маркерная селекция приобретает для
воспроизводительных качеств, характеризующихся относительно низкой
наследуемостью, оценка которых ограничена полом (Golisov E. et al., 2004; Rothschild M. et al., 1998; Spotter A. et al., 2006), а также для признаков мясной и откормочной продуктивности, отличающихся большой вариабельностью и трудоемкостью массового определения (Jeon J. T. et al., 1999; Nezer C. et al., 1999; Cirera S. еt al., 2004; Dekkers J.C.M., 2004). Включение в селекционные программы ДНК-маркеров QTL в качестве дополнительного критерия позволяет повысить точность оценки племенной ценности животных.
Исходя из вышеизложенного, актуальной задачей является характеристика аллелофонда пород и популяций сельскохозяйственных животных по ДНК-маркерам QTL и идентификация генотипов, ассоциированных с селекционно-значимыми признаками.
Степень разработанности темы исследования. Исследования по разработке систем диагностики генетических дефектов и выявлению ДНК-маркеров локусов количественных признаков осуществляются во многих странах. В Российской Федерации обязательному тестированию по генетическим дефектам RYR1, KPL2, RN подлежат все хряки основного стада в рамках проведения генетической экспертизы племенного материала (приказ МСХ РФ № 431 от 17 ноября 2011 года). Регулярно выявляются новые мутации, обуславливающие наличие генетических аномалий, и разрабатываются тест-системы, позволяющие своевременно принимать меры по контролю за их распространением в стадах (Зиновьева Н.А. и др., 2015). Исследования ассоциаций ДНК-маркеров в свиноводстве привлекают внимание ученых как в нашей стране (Селионова М.И. и др., 2015; Гетманцева Л.В. и др., 2013, Долматова А.В. и др. 2010), так и за рубежом (Bruun C.S. et al., 2006; Chen J.F. et al., 2008; Ciobanu D. C. et al., 2011; Rempel L.A. et al., 2010). Изучение роли ДНК-маркеров в характеристике экономически-значимых признаков, поиск новых SNP, связанных с признаками продуктивности и устойчивостью к заболеваниям, характеризуется актуальностью и востребованностью в практической селекционно-племенной работе (Rothschild et al., 1996; Chen J.F. et al., 2008: Косовский Г.Ю. и др., 2011).
Цель и задачи исследований. Целью исследований явилась характеристика аллелофонда свиней различных пород, разводимых в сельскохозяйственных
предприятиях России, по ДНК-маркерам локусов количественных признаков, и исследование ассоциаций маркерных генотипов с хозяйственно-полезными признаками свиней.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать тест-системы анализа полиморфизма ДНК-маркеров гамма 3 субъединицы протеинкиназы (PRKAG3), коактиватора ядерных рецепторов А1 (NCOA1), гипофизарного транскрипционного фактора (POU1F1), рецептора меланокортина 4 (MC4R) и инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2).
-
Усовершенствовать тест-системы анализа полиморфизма ДНК-маркеров эстрогенового рецептора (ESR1), рецептора E.coli (ECR F18/FUT1) и рианодинового рецептора (RYR1).
-
Разработать тест-систему для мультиплексного анализа полиморфизма ДНК-маркеров ESR1, ECR F18/FUT1 и RYR1.
-
Изучить аллелофонд свиней различных пород по ДНК-маркерам ESR1, FSHB, NCOA1, PRKAG3, MC4R, POU1F1, IGF2, ECR F18/FUT1, MUC4.
-
Выполнить анализ популяционно-генетических параметров в группах свиней различных пород по ДНК-маркерам ESR1, FSHB, NCOA1, PRKAG3, MC4R, POU1F1, IGF2, ECR F18/FUT1, MUC4.
-
Провести сравнительные исследования аллелофонда домашних свиней и кабанов по ДНК-маркерам ESR1, FSHB, NCOA1, PRKAG3, MC4R, POU1F1, IGF2, ECR F18/FUT1, MUC4.
-
Выполнить анализ ассоциаций генотипов ДНК-маркеров ESR1, NCOA1 и FSHB с воспроизводительными качествами свиней различных пород.
-
Изучить связи генотипов ДНК-маркеров IGF2, MC4R, POU1F1 и PRKAG3 с мясными и откормочными качествами свиней.
-
Изучить влияние генотипов ДНК-маркеров ECR F18/FUT1, MUC4 на продуктивные качества свиней.
Научная новизна. Впервые разработаны и усовершенствованы методические приемы определения полиморфизма ДНК-маркеров NCOA1, PRKAG3, ESR1, POU1F1, MC4R, ECR F18/FUT1 и IGF2. Дана характеристика аллелофонда различных популяций свиней пород крупная белая, ливенская, дюрок, ландрас, йоркшир, белорусская мясная, пьетрен по вышеназванным ДНК-маркерам. Установлены статистически значимые различия в распределении аллелей и генотипов ДНК-маркеров между домашними свиньями и кабанами. Выполнена количественная оценка ассоциаций генотипов изучаемых ДНК-маркеров с воспроизводительными качествами, показателями мясной и откормочной продуктивности свиней различных пород.
Теоретическая и практическая значимость работы. В качестве возможных генетических маркеров, представляющих практический интерес для свиноводства, рассмотрены гены ESR1, FSHB, NCOA1, PRKAG3, IGF2, MC4R, POU1F1, ECR F18/FUT1 и MUC4. Предложены усовершенствованные методики выявления аллельных вариантов генов ESR1, NCOA1, PRKAG3, IGF2, MC4R, POU1F1, ECR F18/FUT1. Установлены генотипы ДНК-маркеров ESR1, FSHB, NCOA1, PRKAG3, IGF2, MC4R, POU1F1, ECR F18/FUT1, MUC4, ассоциированные с уровнем воспроизводительных, мясных и откормочных качеств у свиней различных пород. Получена доказательная база о количественном влиянии генотипов ДНК-маркеров на хозяйственно-полезные признаки свиней.
Методология и методы исследования. Методологической основой при проведении исследований служили научные положения ученых в области молекулярной генетики сельскохозяйственных животных. В процессе выполнения диссертационной работы были использованы общепринятые методы молекулярной генетики и биотехнологии, реализованные на современном оборудовании. Обработка экспериментальных данных проводилась с использованием статистических методов анализа.
Основные положения, выносимые на защиту:
Новые тест-системы анализа полиморфизма ДНК-маркеров PRKAG3, NCOA1, POU1F1, MC4R и IGF2;
Усовершенствованные тест-системы анализа полиморфизма ДНК-маркеров ESR1, NCOA1, PRKAG3, IGF2, MC4R, POU1F1, ECR F18/FUT1 свиней;
Аллельные профили свиней различных пород по ДНК-маркерам ESR1, FSHB, NCOA1, PRKAG3, IGF2, MC4R, POU1F1, ECR F18/FUT1, MUC4;
Популяционно-генетические параметры исследуемых групп свиней по ДНК-маркерам;
Сравнительные ДНК-профили домашних свиней и кабанов по ДНК-маркерам, ассоциированным с QTL;
Количественная оценка влияния генотипов ДНК-маркеров на воспроизводительные, мясные и откормочные качества.
Степень достоверности и апробация результатов. Результаты работы доложены и получили положительные оценки на:
международных научных конференциях «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (п. Дубровицы, 2005-2009 г.);
международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Международного Симпозиума ЕС-Россия перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной Программе (г. Санкт-Петербург, 2006);
годовых научных отчетных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ им. Л.К. Эрнста (2005-2015 гг.);
международной научно-практической конференции "Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения" (п. Дубровицы, 2008
г.);
международной научно-практической конференции, посвященной 140-летию со дня рождения профессора И.И. Иванова (г. Курск, 2010 г.);
международной конференции с элементами научной школы для молодежи в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (г. Уфа, 2010 г.);
VI научно-практической конференции «Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук» (г. Москва, 2010 г.);
международной научной молодежной конференции-школе «Биотехнологии в сельском хозяйстве: современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (п. Дубровицы, 2012 г.);
XXIII Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы производства свинины в Российской Федерации» (п. Персиановский, 2013 г.);
форуме в рамках Международной специализированной выставки «АгроФерма», (г. Москва, 2013 г.);
Международной конференции «Свиноводство: итоги первого года в реалиях ВТО» (г. Москва, 2013 г.);
симпозиуме «Geschlechtsabhngige Vererbung - mehr als Gender und Sex», 27-28 марта 2014 года (г. Вена, Австрия, 2014);
международной научно-практической конференции «Свиноводство-2015. Импортозамещение как первый этап создания экспортного потенциала» (г. Москва, 2015 г.).
Достоверность результатов подтверждается объемом проведенных исследований, количеством животных, использованных в исследованиях, результатами статистической обработки данных.
Личное участие. Непосредственно автором проанализировано современное состояние проблемы, определены цели и задачи исследований, разработана программа и определены методы их проведения; выполнены лабораторные исследования, обработка, обобщение и анализ полученных результатов. Печатные работы по теме диссертации подготовлены самостоятельно и в соавторстве.
Публикации. Всего опубликовано 82 научные работы, в том числе по материалам диссертации 49 работ, из них 15 - в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК («Достижения науки и техники АПК», «Проблемы биологии продуктивных животных», «Сельскохозяйственная биология. Серия Биология животных», «Свиноводство», «Зоотехния»), получен патент на изобретение RU 2328531 C2.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 372 страницах, содержит 138 таблиц, 64 рисунка, 11 приложений и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и библиографический список, который включает 455 цитируемых источников, из них 340 - на иностранных языках.
Бета-субъединица фолликулостимулирующего гормона FSHB
При изучении влияния генотипа хряков по ESR1 на воспроизводительные качества маток установлено, что при осеменении маток спермой хряков – производителей с вариантом ВВ гена ESR1 оплодотворяемость составила 92,6%, что на 2,2% больше, комплексный показатель воспроизводительных качеств (КПВК) на 3,6 балла выше, чем у АВ-генотипа. Можно предположить, что использование хряков-производителей генотипа ВВ повышает фертильность маток (Полозюк О.Н., 2013).
Выявлено, что ESR1-генотип маток достоверно влияет на молочность, определяющую жизнеспособность, рост и развитие подсосных поросят. Свиноматки с ВВ-генотипом превосходили аналогов с АВ вариантом гена по молочности (12,6 кг (29%); p 0,001), выходу деловых поросят при отъеме в 32 дня (на 1,5 гол.), сохранности поросят (на 17,9%) (Полозюк О.Н., 2013).
Установлено, что свиноматки с генотипом ВВ превышали по многоплодию на 0,87–1,57 поросенка на опорос особей с вариантом АА при уровне достоверности р 0,05; р 0,001. Наличие в генотипе аллеля В у гетерозиготных особей также выражалось в устойчивой и достоверной тенденции к повышению многоплодия на 0,5–0,89 поросенка (при р 0,01). Масса гнезда к отъему у свиноматок-носителей генотипа ВВ была выше, чем у обладателей генотипа АА, на 2,09–6,1 кг (р 0,05) (Лобан Н.А. и др., 2008).
Urban T. с соавторами (2002) выявили значимую ассоциацию полиморфизма гена ESR1 с общим количеством родившихся поросят, многоплодием и падежом поросят в первом опоросе. Horogh G. и сотрудники (2005) продемонстрировали противоречивые результаты, полученные различными исследователями. По данным Епишко Т.И. и коллег (2009) у свиноматок белорусской мясной породы с генотипом ВВ по сравнению с генотипом АА наблюдали большее количество рожденных поросят на 0,99 гол. (Р 0,05), увеличение многоплодия на 0,78 гол., уменьшение аварийных опоросов на 3,23 % (Р 0,001).
У свиней с гомозиготными генотипами по ESR1 не обнаружено различий по продолжительности эстрального цикла и эструса, а также уровня секреции лютеинизирующего гормона, эстрогена и прогестерона, количества овулировавших яйцеклеток и числа живых эмбрионов на 35-36 день, однако имелись различия по размеру плаценты: свиньи с повышенным многоплодием отличались большими размерами плаценты, что может быть связано с различной сохранностью поросят в эмбриональный период (Matousek V. et al., 2003).
При изучении влияния гена ESR1 на продуктивные показатели свиноматок крупной белой породы, Шейко И.П. с соавторами (2007) установили, что носители гетерозиготного генотипа на 3,2 дня раньше (при р 0,05) достигают живой массы 100 кг, по сравнению со свиноматками с генотипом АА. При исследовании плейотропного эффекта полиморфизма гена ESR1 у хряков крупной белой породы разных генотипов Kaminski S. (2003) не обнаружил ассоциации полиморфизма с мясными и откормочными качествами. Short Т.H. (1997) и Santana B.A. (2006) выявили зависимость генотипа ВВ с толщиной шпика и со среднесуточными приростами живой массы.
Ген ESR1 был первым геном-кандидатом и первым изученным главным геном у свиней. Опубликовано большое количество сообщений о локусе ESR1 и его связи с репродуктивными признаками (Li F.E. et al., 2004; Rothschild M. et al., 1994; Southwood O.I. et al., 1995; Southwood O.I. et al., 1999; Short T.H. et al., 1997). Непрерывный отбор и размножение свиней, гомо- и гетерозиготных по предпочтительному аллелю, позволит получить значительные успехи в селекции, создать новую линию или породу с повышенным многоплодием (Rothschild M. et al. 1999).
У млекопитающих фолликулостимулирующий гормон (FSH) является одним из гликопротеинов, выделяемых передней долей гипофиза (Li N. et al, 2001). Взаимодействуя со своим рецептором в гранулоцитах, ФСГ стимулирует созревание и дифференцировку фолликулов (Li F.E. et al., 2002). ФСГ это ключевой фактор, который контролирует дифференциацию фолликулов, их рост и развитие, так как регулирует деление клеток зернистого слоя (Dierich A. et al., 1998). Рост, развитие и созревание в яичниках фолликулов обусловлено поступлением в кровь ФСГ (Abdennebi L. et al., 1999; Скопичев В.Г. и др., 2004). ФСГ ингибирует гибель клеток зернистого слоя фолликула и стимулирует образование новых фолликулярных клеток (Guethri H.D. et al., 1998) и, по всей видимости, регулирует уровень овуляции у свиноматок (Cardenas H., Pope W.F., 2002). У самцов млекопитающих фолликулостимулирующий гормон регулирует сперматогенез в клетках Сертоли, а его абсолютная необходимость для размножения была предметом некоторых дискуссий (Tapanainen J.S. et al., 1997). Было показано, что у самцов FSHB-дефицитных мышей был меньший размер семенников и сперматозоидов, но при этом они были фертильны (Kumar T.R. et al., 1997). Канадские ученые Sairam M.R. и Krishnamurthy H. (2001) высказали предположение о влиянии фолликулостимулирующего гормона уже в раннем возрасте на нормальное развитие гонад и наступление половой зрелости. Недостаток фолликулостимулирующего гормона проявляется в недоразвитии семенников у молодых самцов и сокращении количества клеток Сертоли до 50%. Недостаток фолликулостимулирующего гормона у взрослых самцов приводит к уменьшению уровня тестостерона, и, как следствие, снижению количества и качества спермы. Эти данные позволяют предположить, что ФСГ играет важную роль в количественном поддержании нормального сперматогенеза, но не может быть принципиально необходимым для фертильности у самцов. Тем не менее, мужчины с инактивирующими мутациями в гене FSHB, которые не в состоянии продуцировать димерный лиганд, являются азооспермичными (Berger K. et al., 2005; Layman L.C. et al., 2002; Lindstedt G. et al., 1998; Phillip M. et al., 1998). Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) состоит из двух субъединиц, кодируемых другими генами: -субъединицы, присутствующей у всех гликопротеиновых гормонов типа лютеинизирующего гормона (ЛГ) и лютеотропного гормона (ЛТГ), и уникальной -субъединицы, которая и определяет характерную биологическую активность (Гормональная регуляция размножения у млекопитающих, 1987) и кодируется геном FSHp (Mellink С. et al., 1995). -субъединица обуславливает физиологическую специфичность этого гормона (Esch F.S. et al, 1986; Jameson J.L. et al, 1988; Kato Y., 1988).
Материально-техническое обеспечение исследований
POU1F1 – гипофизарный фактор транскрипции 1 (известный также как PIT-1 или GHF-1) является тканеспецифическим фактором транскрипции и в основном эспрессируется в передней доле гипофиза (Bodner M. et al., 1988; Ingraham H. et al., 1988), где он регулирует развитие гипофиза (Cohen L.E. et al. 1996). Этот белок играет важнейшую роль в регуляции транскрипции генов гормона роста и пролактина (Lefevre C. et al., 1987; Nelson C. et al., 1988) путем образования димеров с ДНК-мишенями (Holloway J.M. et al., 1995; Jacobson E.M. et al., 1997). Он также участвует в активации генов бета-субъединицы тиреотропного гормона (TSHb) (Li S. et al., 1990), собственно POU1F1 (Chen R. et al., 1990; McCormick A. et al., 1990) и рилизинг-фактора гормона роста (GHRH-R) (Lin C. et al., 1992). В дополнение к своей роли в активации генов, POU1F1 необходим для дифференцировки, пролиферации и выживания соматотропных, лактотропных и тиреотропных клеток (Li S. et al., 1990). POU1F1 принадлежит к большой семье POU доменных белков (название, связано с первыми описанными белками этого домена: POU1F1; OCT 1, 2 и UNC86), характеризуется наличием двух консервативных регионов: POU специфического домена (POUs) и POU –гомеодоменного (POUh), ответственного за высокое сродство ДНК привязки к специфическим промотерным регионам (Sturm R.A. et al., 1988). Активация транскрипции достигается за счет менее консервативного домена на N-терминале, богатом сериновыми и треониновыми основаниями (серин / треонин домен активации, STA) (Theill L.E. et al., 1989). кДНК POU1F1 была клонирована у различных видов млекопитающих: крупный рогатый скот (Bodner M. et al., 1988), крыса (Bodner M. et al., 1988; Ingraham H. et al., 1988), мышь (Li S. et al., 1990), человек (Tatsumi K. et al., 1992), свинья (Tuggle C.K. et al., 1993), макака-резус (Schanke J.T. et al., 1997), овца (Thomas M.G. et al., 2000), собака (Lantinga-van Leeuwen I.S. et al., 2000). Этот ген играет важную роль в контроле развития и экспрессии генов гормонов в гипофизе. Некоторые авторы связывают мутации этого гена с нарушениями на уровне гипофиза. Мутации в гене POU1F1, ассоциированы с гормоном роста, бета-субъединицей тиреотропного гормона, и дефицитом пролактина и гипопитуитаризмом у человека (Hendriks-Stegeman B.I. et al., 2001). Мутации, идентифицированные в гене POU1F1 приводят к дефициту или отсутствию гормона роста, пролактина и бета субъединицы тиротропина, что в свою очередь может привести к изменению в развитии и скорости роста (Radovick S. et al.,1992; Hendriks-Stegeman B.I. et al., 2001). Именно это послужило тому, что за рубежом ген POU1F1 рассматривается как ценный генетический маркер и с успехом используется в маркер-зависимой селекции.
Некоторые полиморфизмы, обнаруженные в гене POU1F1 также оказались связанными с количественными признаками животных (Yu T.P. et al. 1993, 1995, 1996; Woollard J. et al. 1994; Moody D.E. et al. 1996; Nielsen V.H. and Larsen N.J., 1997; Stancekova K. et al. 1999; Brunsch C. et al. 2002; Sun H.S. et al. 2002; Di-Stasio L. et al. 2002). Например, точковая мутация в POU-гомеодоменовом регионе гена POU1F1 у карликовых мышей вызывает гипоплазию передней доли гипофиза и комбинированный дефицит гормонов гипофиза (CPHD) GH, PRL и TSHb (Li S. et al., 1990). Nica G. и соавторы (2004) описал рыбок данио - нулевых мутантов POU1F1, лишенных трех типов клеток гипофиза, у которых развивалась тяжелая карликовость. Предполагается, что у крупного рогатого скота ген POU1F1 связан с изменением массы тела и количеством белка и жира в молоке (Renaville R. et al.,1997; Zwierzchowski L. et al.,2002). Учитывая ценность гена POU1F1 для контроля экспрессии генов, кодирующих значимые гормоны, непосредственно связанные с процессом роста и производства молока, можно считать его хорошим геном-кандидатом для MAS. У свиней, Tuggle C.K. и сотрудники (1993), Yu T.P. и коллеги (1993, 1994) выявили и проанализировали ПЦР-ПДРФ полиморфизм в кДНК гена POU1F1. Yu T.P. и соавторы (1995) установили связь этих полиморфизмов с ростом и развитием у свиней и обнаружили положительную корреляцию. Аналогичный результат был получен Stancekova K. и коллегами (1999) в другом исследовании. Sun H.S. и сотрудники (2002) показали значительное влияние генотипа POU1F1 на уровень циркуляции гормона роста и пролактина в неонатальный период у свиней породы мейшан, а Brunsch C. и соавторы (2002) предположили, что существуют влияние гена POU1F1 на рост, развитие, состав туш и качество мяса у свиней.
Тест-системы определения полиморфизма ESR1 на основе пиросеквенирования и ПЦР-ПДРФ анализа
Следующей задачей наших исследований явилась разработка тест-системы определения полиморфизма гена гипофизарного транскрипционного фактора 1 -POU1F1. Полиморфизм гена обусловлен точечной мутацией в третьем интроне гена, приводящей к образованию двух аллелей - С и D (Song C. et al., 2005).
Исходя из наличия и локализации мутации в последовательности POU1F1 (генный банк № AJ511270) нами были подобраны два специфических олигонуклеотидных праймера, амплифицирующие фрагмент гена длиной 295 п.о. c последующим гидролизом продуктов реакции с использованием эндонуклеазы MspI.
Реакции проводили в конечном объеме 15 мкл, используя стандартный состав реакционной смеси и 5 пмол каждого из праймеров (Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., 2002). Проводили 37 циклов ПЦР в стандартном температурно-временном режиме (температура отжига – 63 градуса).
Для объективной оценки результатов при постановке ПЦР нами были использованы два контроля - положительный, в качестве которого выступала ДНК свиней с известным генотипом по POU1F1, и отрицательный, в качестве которого выступала реакционная смесь с добавлением вместо ДНК бидистилированной воды.
По завершении ПЦР 5 мкл реакционной смеси наносили в агарозный гель с целью оценки качества амплификации, а также проверки контролей. В случае успешной амплификации проводили гидролиз оставшейся реакционной смеси (10 мкл) 1Ед эндонуклеазы Msp I с последовательностью узнавания - CCGG. Гидролиз проводили в течение 12 часов при рекомендуемой производителем температуре. По окончании инкубации проводили электрофоретическое разделение фрагментов в 2% агарозном геле при 100 В в буфере ТАЕ с добавлением бромистого димидия до конечной концентрации 30 нг/мл и визуализировали фрагменты под ультрафиолетовым светом.
После рестрикции в зависимости от генотипа животного образуются фрагменты длиной 295, 210 и 85 п.о., при этом фрагмент длиной 295 п.о. соответствует аллелю C, а фрагменты длиной 210 и 85 п.о. соответствуют аллелю D (рис. 21).
На рисунке 22 представлены результаты ПЦР-ПДРФ анализа вариантов гена POU1F1 свиней по предложенной нами методике.
В Отделе биотехнологии и молекулярной диагностики животных ВИЖ им. Л.К. Эрнста разработана и успешно используется тест-система определения полиморфизма гена RYR1 посредством ПЦР-ПДРФ анализа, которая послужила прототипом для создания симплексной тест-системы анализа полиморфизма гена RYR1 на основе пиросеквенирования. Дизайн праймеров для симплексной системы определения полиморфизма гена RYR1 представлен на рисунке 23.
Разработанная нами тест-система предусматривает амплификацию фрагмента длиной 153 п.о., содержащего область мутации, с использованием двух специфических праймеров Р-RYR F (5 – TCA CAC CTT GAC CTC TGA CCT TG - 3 ) и Р-RYR R bio (5 – TTG ATG AGG TTT GTC TGC AGC AG - 3 , биотинилирован на 3 -конце) с последующим пиросеквенированием с
Поскольку разработанная нами система предназначена для использования на пиросеквенаторе PSQ96MA, это позволяет успешно определять полиморфизм гена RYR1 значительно быстрее по сравнению с традиционными методами анализа. Также для пиросеквенирования используется фрагмент гена менее 300 п.о., что позволяет использовать менее дорогостоящие и трудоемкие способы выделения ДНК, а также существует возможность создания мультиплексных систем анализа (предоставляют возможность определять полиморфизм трех генов одновременно), основанных на разработанных ранее симплексных тест-системах.
В отделе биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ им. Л.К. Эрнста была ранее разработана тест-система по диагностике полиморфизма гена ECR F18/FUT1 посредством ПЦР-ПДРФ анализа. С целью расширения арсенала способов диагностики полиморфизма данного гена и возможности создания мультиплексных систем нами была использована технология пиросеквенирования. Дизайн системы для определения полиморфизма гена ECR F18/FUT1 представлен на рисунке 26.
Разработанная нами тест-система предусматривает амплификацию фрагмента длиной 139 п.о., содержащего область мутации, с использованием двух специфических праймеров P-ECR1 (5 -AAG CAT CCT GCC TCC CTT TCC 3 ) и P-ECR2 bio (5 - CGT GCA TGG CAG GCT GGA TG 3 , биотинилирован на 3 -конце) с последующим пиросеквенированием с использованием секвенирующего праймера Seq ECR (5 - GCT GGC CCT G 3 ). Теоретически ожидаемые пикограммы анализируемой последовательности гена ECR F18/FUT1 представлены на рисунке
Исследование аллелофонда свиней различных пород по ДНК маркерам
Частоты генотипов по гену ECR F18/FUT1 (табл.62 рис.59) распределились следующим образом: наиболее часто желательный генотип встречался у свиней породы дюрок канадской селекции (ДК4) – 38,6%, чуть реже отмечался этот генотип у свиней породы дюрок (Д2) – 35,71% и помесей КБХЛхД1 – 28%. В среднем по породе дюрок частота встречаемости генотипа АА составила 22,44±2,0. У свиней ландрас куменского типа, крупная белая французской селекции и йоркшир белорусский (ЙБ1) – гомозиготный генотип АА не был диагностирован, но гетерозиготный генотип AG встречался довольно часто, 70, 66,67 и 66,67%% соответственно. В таблице представлен анализ сохранения генетического равновесия в исследованных популяциях по локусу ECR F18/FUT1.
Как показано в таблице, практически во всех исследованных группах животных генетическое равновесие сохранялось, за исключением групп в которых не встречался аллель А – боди, дюрок французской селекции, йоркшир финский и популяции кабана. Также равновесие было сдвинуто в группе свиней крупной белой породы канадской селекции – в сторону генотипов GG и АА, в группе свиней крупной белой породы заволжского типа – также в сторону генотипов GG и АА, в группе свиней породы дюрок канадский (ДК4) – в сторону генотипа АА.
Затем нами был проведен анализ влияния групповой принадлежности на формирование генотипа и оценена сила и значимость влияния этого фактора.
Произведенные расчеты (табл.65) показали, что межпопуляционная изменчивость, обусловленная влиянием фактора принадлежности к группе, достоверно превосходит изменчивость по гену ECR F18/FUT1 внутри популяций. При этом сила влияния фактора групповой принадлежности составляла 12,07% и была значима при уровне p0,001. Таким образом, факт принадлежности животного к определенной группе не гарантирует у него наличия в генотипе желательного аллеля. Существенную роль (87,93%) играют другие факторы.
Доля изменчивости между группами в общей изменчивости по ECR F18/FUT1 (таблица 66) составила 7% (Fst=0,072), на долю внутригрупповой изменчивости (внутри индивидуумов) приходилось 87%. Значение Fis (0,060) указывает на незначительный дефицит гетерозигот внутри индивидуумов на уровне отдельных популяций, значение Fit (0,128, p=0,01) указывает на недостаток гетерозигот внутри индивидуумов на уровне всей выборки в целом.
Построенное дерево (рис. 59) образовано двумя ветвями, каждая из которых делится на подкластеры, однако породного аспекта в формировании ветвей не отмечено.
Изучение полиморфизма гена MUC4 проводили на 5 группах свиней различных пород и кабанах (всего 326 голов). На рисунке 61 показано распределение частот встречаемости аллелей гена MUC4 у исследованных групп свиней.
Аллель С обуславливает устойчивость свиней к диарее, вызываемой E. Coli F4 (возникает спустя 5-7 дней после рождения). Анализ полиморфизма гена MUC4 в изученных популяциях показал, что наибольшая частота встречаемости желательного аллеля С наблюдалась у кабанов, лишь 2,4% их являлись носителями нежелательного аллеля G.
Наиболее часто нежелательный аллель встречался у ландраса канадского происхождения (ЛК3) – 51,3%, у белорусской черно-пестрой (БЧП1) – 37,9% и ландраса канадской селекции (ЛК1) – 29,6%. Средняя частота встречаемости аллеля С у свиней породы ландрас составила 0,576 (от 0,487 до 0,704.
Генотипы гена MUC4 в исследованных популяциях распределились следующим образом: в популяции свиней породы ландрас канадской селекции (ЛК3) отмечалась самая высокая частота гомозиготного генотипа GG – 25,64%, также довольно часто этот генотип встречался и у другой популяции свиней породы ландрас канадской селекции (ЛК1) – 14,81%, в среднем по породе частота составила 36,36±4,0%.
Распределение частоты встречаемости генотипов MUC4 у свиней различных пород. Животные – гомозиготные по аллелю G встречались и в двух других популяциях – белорусской черно-пестрой (БЧП1) – 6,06% и дюрок канадский (ДК1) – 2,86%. В популяции кабана носителей генотипа GG зафиксировано не было. Таблица 69 - Сохранение генного равновесия (критерий ) по локусу MUC4 в исследованных популяциях свиней (df=1). № п/п Порода эмпирич Равновесие 1 Кабан 0,026 + 2 ДК1 4,382 3 БМ 1,376 + 4 ЛК1 2,262 + 5 БЧП1 8,187 6 ЛК3 0,027 + +имеется, -отсутствует Проведенный анализ сохранения генетического равновесия в исследованных популяциях показал, что во всех группах животных генное равновесие сохранялось.
В следующих таблицах показаны результаты проведенного анализа влияния фактора породы на вероятность обнаружения желательного генотипа, а также дана оценка силы влияния фактора породы и ее значимость.