Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Неменделевский фактор [psi*] дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Сох, 1965) передается через цитоплазму. Несмотря на интенсивные исследования, его не удалось связать ни с какими молекулами ДНК или РНК. Фактор [psi*] снижает точность трансляции, вызывая подавление проявления нонсенс-мутаций - нонсенс-супрессию (см. обзор Сох et al, 198Э). К такому же эффекту приводят мутации в гене SUP35 (Инге-Вечтомов, 1964 и 1965; Инге-Вечтомов и Андрианова, 1970)-, а также, как было показано нами, амплификация гена SUP35 дикого типа (Чернов и др., 1988; Chernoff et al, 1992). Белок Sup35 является консервативным эукариотическим фактором трансляции, гипотетически функционирующим на этапе терминации.
В данной работе впервые было показано, что увеличение дозы гена SUP3S индуцирует появление [psi*] фактора (Chernoff et al, 1993) . Эти результаты были использованы Р.. Викнером (Wickner, 1994) в его модели, постулирующей, что [psi*] является прионоподобной формой белка Sup35. Прионы - белки необычной конформации, вызывающие нейродегенеративные заболевания у животных и человека, например, скрейпи и спорадическую форму болезни Крейцфельдта-Якоба (см. обзоры Prusiner, 1994 и 1995) . Особенностью прионовых заболеваний является то, что в качестве инфекционного агента выступает белок РгР в прионовой конформации (PrPs=), который' при попадании в клетку изменяет конформацию клеточного белка РгР, превращая его в прион. Таким образом, передача заболеванит осуществляется по новому механизму, не требующему участия ДНК (или РНК-)-содержащего инфекционного агента. Вместе с тем, мутации в гене, кодирующем белок РгР, могут вызывать заболевания идентичные прионовым (как, например, в случае семейной формы болезни Крейцфельдта-Якоба).
Дальнейшие эксперименты, представленные в данной работе, подтверждают прионовую модель [psi*] и позволяют локализовать участок белка Sup35 необходимый для индукции [psi4]. Наши результаты демонстрируют перспективность использования модельного генетического объекта - дрожжей Saccharomyces cerevisiae - для изучения закономерностей появления и поддержания прионов, для понимания механизмов эпигенокного наследования и роли наследуемых модификаций белков в регуляции белкового синтеза.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью настоящей работы являлось изучение наследственных изменений, вызванных увеличением дозы гена SUP35. В ходе экспериментов с многокопийными плазмидами, содержащими ген SUP35, нами было обнаружено появление [psi*] факторов. Дальнейшими задачами работы'было:
- сравнить специфичность супрессии, вызванной многокопийным
геном SUP35, со специфичностью супрессии, вызванной (psi*) фактором
и мутациями в генах SUP35 и SUP45.
выяснить, чем вызвана индукция [psi*] - увеличением копийно-сти гена SUP35 или гиперпродукцией соответствующего белка;
охарактеризовать [psi*] факторы, возникающие при гиперпродукции Sup35;
выявить участок Sup35 ответственный за индукцию [psi*]»
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые обнаружено, что сверхпродукция всего белка Sup35 или его N-концевого фрагмента приводит к возникновению цитоплазматического прионоподобного фактора [psi*] . Показано, что при гиперпродукции Sup35 в одном и том же штамме дрожжей могут быть индуцированы [psi*] факторы различного проявления.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Полученные данные о возникновении прионоподобного фактора [psi*] при сверхэкспрессии гена SUP35 позволяют использовать модельный генетический объект Saccharomyces cerevisiae для изучения прионов - возбудителей болезней животных и человека. Созданная в ходе работы коллекция штаммов дрожжей исполь-зоЕоіїа в молекулярно-генетических исследованиях и в педагогическом процессе на кафедре генетики и селекции СПбГУ.
АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ. Результаты работы были представлены на XVII Международном Генетическом Конгрессе (Бирмингем, Великобритания, 1993), на XV Международной Конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Гаага, Нидерланды, 1990), на конференции "Синтез рибосом и функция ядрышка" (Колд Спринг Харбор, США, 1994), на семинарах лаборатории физиологической генетики (БиНИИ СПбГУ) кафедры генетики и селекции СПбГУ и лаборатории молекулярной биологии Университета Иллинойс (Чикаго, США).
ПУБЛИКАЦИИ. По результатам диссертационной работы опубликовано 4 статьи и 2 тезисных сообщения,
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.Диссертационная работа объемом (?& страниц состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", содержит IV рисунков, Jfj таблиц и список литературы, содержащий »у р/ наименований работ.