Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Регуляция зиготического эмбриогенеза у покрытосеменных растений 10
1.1.1. Установление апикально-базальной оси полярности 10
1.1.2. Радиальная дифференцировка тканей 17
1.1.3. Спецификация апикальных меристем 19
1.1.4. Формирование билатеральной оси симметрии. Закладка семядолей 21
1.1.5. Переход к стадии покоя. Прорастание 24
1.2. Регуляция соматического эмбриогенеза у покрытосеменных растений 26
1.2.1. Введение 26
1.2.2. Регуляторы СЭ 30
1.2.3. Гормональные регуляторы СЭ
1.2.3.1. Ауксин, ауксиновые транспортёры PIN и их роль в СЭ 30
1.2.3.2. Другие фитогормоны и их роль в СЭ 38
1.2.4. Транскрипционные факторы и эффекторные белки, регулирующие СЭ 40
1.2.4.1. ТФ WOX и их роль в СЭ 43
1.2.5. Эпигенетические регуляторы СЭ 52
1.3. Заключение 55
2. Материалы и методы 57
3. Результаты и обсуждение 78
3.1. Выявление генов WOX и PIN, экспрессирующихся в ходе соматического эмбриогенеза 78
3.1.1. Количественный анализ экспрессии генов PIN Medicago truncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезе 78
3.1.2. Количественный анализ экспрессии генов WOX Medicago truncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезе 84
3.2. Изучение функций исследуемых генов в СЭ 88
3.2.1. Визуализация экспрессии исследуемых генов WOX и PIN 88
3.2.2. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессии исследуемых генов WOX и PIN 95
3.2.2.1. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессии гена STF 95
3.2.2.2. Анализ способностей к СЭ у растений со сверхэкспрессией гена MtWOX9-1 107
3.2.2.3. Анализ способностей к СЭ у растений с потерей функции гена MtWOX11 -like 111
3.2.2.4. Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционными факторами STF и MtWOX9-1 и важных для СЭ 113
3.2.2.5. Анализ функций гена MtLEC1A в СЭ
4. Заключение 120
5. Выводы 123
6. Использованная литература 124
Благодарности 150
- Переход к стадии покоя. Прорастание
- Ауксин, ауксиновые транспортёры PIN и их роль в СЭ
- Количественный анализ экспрессии генов PIN Medicago truncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезе
- Анализ способностей к СЭ у растений со сверхэкспрессией гена MtWOX9-1
Введение к работе
Актуальность исследования.
Соматический эмбриогенез (СЭ) у растений – это процесс, при котором незиготические клетки формируют эмбрионы, которые проходят через характерные стадии эмбрионального развития, в конечном счёте формируя новое растение (Chen, 2009). Многие виды растений хранят в себе потенциальную способность к СЭ, однако у большинства из них для образования соматических эмбрионов необходимы специфические условия in vitro, которые обычно включают в себя обработку гормонами, и развитие эмбриогенного каллуса.
Явление СЭ широко используется для генетической трансформации растений, а также для получения искусственных семян. Поиск и изучение регуляторов этого процесса важны для улучшения методик получения соматических эмбрионов.
СЭ имеет множество черт, характерных для обычного, зиготического эмбриогенеза (ЗЭ). В частности, в ходе развития соматического эмбриона обычно можно различить морфологические стадии, характерные для ЗЭ. Кроме того, большинство исследованных генов, работающих в ходе ЗЭ, функционируют и при СЭ.
К числу регуляторов ЗЭ можно отнести транскрипционные факторы (ТФ) из семейства WUSCHEL-LIKE HOMEOBOX (WOX2, WOX8 и WOX9 и другие) Эти факторы определяют судьбу отдельных клеток эмбриона, которые в дальнейшем дают начало различным частям зародыша (Haecker et al., 2004).
Наряду с работой ТФ, крайне важным для развития эмбриона и закладки его полярности является градиент ауксина, в создании которого принимают участие мембранные транспортёры семейства PIN-FORMED (PIN). На ранних этапах развития зиготического эмбриона у Arabidopsis thaliana функционируют транспортёры ауксина PIN1, PIN4 и PIN7, локализованные на наружной мембране клеток. Они участвуют в формировании апикально-базальной оси и в закладке семядолей (Friml et al., 2003).
Для ряда генов WOX и PIN показано их участие в процессах СЭ. Например, ген WUSCHEL является стимулятором СЭ у Capsicum chinense (Sols-Ramos et al., 2009), а PIN1 участвует в процессах закладки и формирования соматических эмбрионов у A. thaliana (Su et al., 2009). Можно предположить, что и у других видов в СЭ участвуют разные ТФ WOX и транспортёры PIN, взаимодействуя друг с другом и выполняя разные функции. Изучение функций этих белков позволит глубже понять механизмы СЭ а также то, каким образом, через каких посредников влияют на него гормоны и другие факторы, для которых была показана их значимость для СЭ.
Целью данной работы является поиск и изучение новых регуляторов соматического эмбриогенеза среди генов семейств WOX и PIN Medicago truncatula
Для достижения цели были сформулированы следующие задачи исследования: 1.Выявление генов семейств WOX и PIN, экспрессирующихся в ходе СЭ 1.1. Количественный анализ экспрессии генов семейства PIN Medicago truncatula в ЗЭ и СЭ 1.2 Количественный анализ экспрессии генов семейства WOX Medicago truncatula в ЗЭ и СЭ 2. Изучение функций исследуемых генов в СЭ
-
Визуализация экспрессии исследуемых генов WOX и PIN
-
Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессии гена STF
-
Анализ способностей к СЭ у растений со сверхэкспрессией MtWOX9-1
-
Анализ способностей к СЭ у растений с потерей функции MtWOX11-like
-
Поиск белков, взаимодействующих с исследуемыми ТФ WOX в процессе СЭ
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Экспрессия генов MtWOX9-1, STENOFOLIA, MtWOX11-like, SMOOTH LEAF MARGIN1 и MtLEC1A ассоциирована с процессом СЭ.
-
Сверхэкспрессия STENOFOLIA и MtWOX9-1 в каллусах Medicago truncatula приводит к повышению эмбриогенности и сопровождается изменениями в уровнях экспрессии генов, предположительно участвующих в СЭ
-
MtWOX9-1 способен к взаимодействию с транскрипционным фактором MtLEC1A, участвующим в СЭ
Научная новизна диссертационной работы. Впервые было показано участие в процессах СЭ генов STENOFOLIA, MtWOX9-1 и SMOOTH LEAF MARGIN1, а также впервые были получены и описаны растения Medicago truncatula с потерей функции генов MtWOX11-like и MtLEC1A. Впервые показано, что сверхэкспрессия генов STENOFOLIA и MtWOX9-1 увеличивает способность к СЭ. Впервые выявлено взаимодействие белков MtWOX9-1 и MtLEC1A. В ходе работы впервые созданы векторные конструкции для анализа экспрессии генов MtWOX11-like и SMOOTH LEAF MARGIN1.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные в работе результаты позволили выявить два новых гена семейства WOX и один ген семейства PIN, участвующие в СЭ. Показано, что промоторы этих генов активны непосредственно в соматических эмбрионах, а также в ассоциированных с ними зонах, а также показано влияние изменения уровня экспрессии генов MtWOX9-1 и STENOFOLIA на интенсивность СЭ. Практическая значимость работы определяется тем, что СЭ широко используется в биотехнологии для трансформации и размножения растений. Выявленные механизмы регуляции позволят улучшить имеющиеся или разработать новые протоколы культивирования растений in vitro.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывали на следующих конференциях: на IV международной школе для молодых учёных «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Пермь, Россия, 2012 год), на международной конференции «International Symposium on Auxins and Cytokinins in Plant Development» (Прага, Чехия, 2014), и на годичном собрании общества физиологов растений России (Санкт-Петербург, Россия, 2016).
Структура и объем диссертации. Текст диссертации состоит из следующих разделов: “Введение”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты и обсуждение”, “Заключение”, “Выводы”и “Использованная литература”. Диссертация представлена на 150 страницах и содержит 21 рисунок и 6 таблиц. В “Списке цитируемой литературы” представлены 227 источников.
Переход к стадии покоя. Прорастание
Какие же функции выполняют гены WOX на этих этапах эмбриогенеза? Показано, что примерно у трети мутантов с потерей функции WOX2 неправильно ориентированы деления апикальной клетки. На более поздних стадиях, однако, нормальная морфология эмбрионов восстанавливается, и они образуют фертильные взрослые растения (Haecker et al., 2004), хотя в ряде случаев у мутантных эмбрионов нарушено формирование семядолей (Breuninger et al., 2008).
Низкая пенетрантность мутации wox2 обусловлена, по видимому, избыточностью выполнения его функций в эмбриогенезе. Потеря функции некоторых других генов WOX (WOX1, WOX3 и WOX5) приводит к значительному увеличению доли мутантных фенотипов. Однако, среди этих генов WOX2, по видимому, является ключевым регулятором делений апикальной клетки, поскольку мутации wox1, wox3 и wox5 приводят к нарушению развития апикальной части зародыша только на фоне мутации wox2 (Breuninger et al., 2008).
Двойные мутанты wox8wox9 демонстрируют нарушения развития как базальной, так и апикальной частей зародыша, несмотря на то, что WOX8 и WOX9 не экспрессируются в апикальной части. Помимо морфологических нарушений, у таких эмбрионов изменён характер экспрессии маркера апикальной части зародыша ZWILLE, а также маркера гипофизы WOX5. Интересно, что у таких мутантов отсутствует экспрессия гена WOX2, причём не только в апикальной части зародыша, но и в зиготе - таким образом, гены WOX8 и WOX9 начинают функционировать ещё до деления зиготы (Breuninger et al., 2008).
Помимо этого, у мутантов wox8wox9 обычно не наблюдается экспрессия гена PIN1 и, вероятно, вследствие этого не формируются нужные апикально-базальные градиенты ауксина. Предполагается, что WOX8, WOX9 и WOX2 вместе с фактором ауксинового ответа MONOPTEROS (MP) стимулируют экспрессию PIN1 в эмбрионе (Breuninger et al., 2008). Принимая во внимание, что MP необходим также для правильной экспрессии гена WOX9, можно сделать вывод о положительной обратной связи между ауксином и ТФ WOX в ходе ЗЭ.
Наиболее хорошо изученными регуляторами генов WOX являются пептиды группы CLE (C LV 3/ESR-related). Системы регуляции WOX-C L AVA T A (включающие гены WOX, а также их негативные регуляторы: пептиды CLE и их рецепторы – C L AVAT A -1-подобные киназы) обнаружены в ПАМ, КАМ и в латеральной меристеме, что позволило предположить наличие CLE-пептида, регулирующего экспрессию генов WOX в эмбрионе. Таким пептидом оказался СLE8. Ген CLE8 экспрессируется в эмбрионе (в основном в его наружных слоях) и в эндосперме. У мутантов по гену CLE8 в ходе развития эмбриона могут наблюдаться избыточные деления в базальной части, а развитие эмбрионов может прекращаться преждевременно. Таким образом, вероятно, CLE8 играет роль в развитии базальной части эмбриона и организации суспензора. Кроме того, он оказывает влияние на развитие эндосперма, по-видимому, предотвращая его раннее созревание и стимулируя рост. Показано, что CLE8 активирует экспрессию WOX8 в суспензоре и в эндосперме и, вероятно, именно WOX8 опосредует его влияние на развитие этих структур (Fiume, Fletcher, 2012).
Ауксиновый сигналинг и полярный транспорт ауксина также важны для создания апикально-базальной оси. В частности, на ранних этапах развития, когда эмбрион состоит из двух клеток, ауксин транспортируется в нём из базальной клетки в апикальную за счёт переносчика PIN7, локализованного на апикальной мембране базальной клетки. У большинства мутантов pin7 на этой стадии развития не формируется градиент концентрации ауксина, и они демонстрируют аберрантные деления апикальной клетки (первое деление является горизонтальным, а не вертикальным, как у эмбрионов дикого типа) (Friml et al., 2003).
Ауксин стимулирует необходимые деления апикальной клетки за счёт деградации IAA12 (INDOLE-3-ACETIC ACID 12), или BODENLOS (BDL), репрессирующего фактор ауксинового ответа ARF5 (AUXIN-RESPONSE FACTOR 5), или MONOPTEROS (MP). MP и BDL участвуют в ауксиновом ответе и на более поздних стадиях, при детерминации КАМ (Hamann et al., 2002).
На стадии глобулы происходит обращение ауксинового транспорта: синтез ауксина происходит уже не в базальной, а в апикальной клетке, и происходит его транспорт в базальный домен. В этом процессе участвует переносчик PIN1, локализованный на базальных мембранах клеток апикальной части, и PIN7, который перемещается на нижние мембраны клеток в базальной части. Также начинает экспрессироваться ген PIN4, поддерживая работу PIN1 и PIN7. В результате новый максимум концентрации ауксина формируется в верхней клетке суспензора — гипофизе, которая в дальнейшем даст начало КАМ (Friml et al., 2003) (Рисунок 2)
Ауксин, ауксиновые транспортёры PIN и их роль в СЭ
Цитокинины - другой класс фитогормонов, обычно необходимый для СЭ, являются важными факторами пролиферации клеток. Исследовано их участие в множестве процессов в жизни растения, таких как развитие побега, морфогенез сосудов, старение и прочее. Однако их влияние на СЭ также неоднозначно. У гороха и сои добавление цитокининов в среду на ранних этапах подавляет индукцию СЭ (Lakshmanan, Ta j i, 2000). Однако, у некоторых других видов цитокинины как раз способствуют этой индукции. (Asano et al., 1996, Castillo, Smith, 1997). Цитокинины являются хорошо известными стимуляторами побегообразования, и зачастую обработка каллусов экзогенными цитокининами приводит к регенерации, которая проходит не по пути СЭ, а по пути органогенеза - формирования побегов.
Однако, несмотря на очевидно ведущую роль ауксина в развитии соматических эмбрионов, существуют протоколы, в которых единственным регулятором роста, добавляемым в среду для культивирования, является цитокинин: например, такие протоколы разработаны для гвоздики Dianthus caryophyllus (Karami et al., 2007) и подсолнечника Helianthus annuus (Thomas et al., 2004). Роль экзогенного цитокинина в СЭ, по-видимому, связана с его способностью стимулировать клеточные деления, необходимые для формирования эмбриогенного каллуса (Karami et al., 2009). Эндогенные цитокинины в каллусе, вероятно, выполняют множество функций; в частности, было показано, что для формирования КАМ соматических эмбрионов необход и м цитокининовый сигналинг, и максимум цитокининового ответа ассоциирован с зоной экспрессии WOX5 - маркера покоящегося центра КАМ (Su et al., 2015).
Об участии этилена в процессах СЭ обычно говорят в связи со стрессовым ответом: перевод растения в культуру in vitro включает в себя множество различных стрессовых воздействий, о чём будет рассказано далее. Этилен является одним из важнейших растительных гормонов, ассоциированных со стрессовым ответом, поэтому его уровень в эксплантах и каллусах обычно повышен по сравнению с интактными тканями растения. Тем не менее, этилен характеризуется неоднозначным влиянием на эффективность СЭ. Так, было показано, что он может подавлять СЭ у моркови (Tisserat, Murashige, 1977). Сходные данные были получены и для кофе (Giridhar et al., 2004). С другой стороны, у M. truncatula был выявлен положительный эффект этилена на эмбриогенность: обнаружен этилен-чувствительный ТФ MtSERF (S O M AT I C EMBRYO RELATED FACTOR 1), важный для СЭ. Кроме того, подавление передачи этиленового сигнала у этого вида подавляет СЭ, а индукция синтеза, напротив, его стимулирует (Mantiri et al., 2008).
Согласно недавним данным, полученным на A. thaliana, синтез этилена в каллусе активно происходит на начальных этапах развития. Затем, после удаления экзогенного ауксина из среды, интенсивность как синтеза этилена, так и передачи его сигнала, снижается, что необходимо для формирования соматических эмбрионов. Стимуляция синтеза или сигналинга этилена на этих этапах подавляет СЭ. Показано, что избыток этилена на этом этапе подавляет транскрипцию генов YUCCA, отвечающих за синтез эндогенного ауксина и формирование его градиента - необходимое условие для развития соматических эмбрионов (Bai et al., 2013).
Абсцизовая кислота (АБК) в ЗЭ в основном регулирует переход в стадию покоя и дальнейшее прорастания. Несмотря на то, что соматические эмбрионы обычно развиваются без перехода в стадию покоя, АБК оказывает существенное влияние на СЭ. Как и этилен, АБК является гормоном, ассоциированным со стрессом, поэтому её синтез также может активироваться при переводе растения в культуру in vitro. Было показано увеличение количества эндогенной АБК в эмбриогенных каллусах по сравнению с неэмбриогенными у Cucumis melo (Nakagawa et al., 2001). У многих видов обработка экзогенной АБК оказывает стимулирующее воздействие на СЭ (Li, Qu, 2002, Fernando, Gamage, 2000), а для моркови описан протокол получения соматических эмбрионов, в котором в качестве экзогенного фитогормона используется только АБК (Nishiwaki et al., 2000).
Важным ТФ, необходимым для передачи сигнала АБК в ходе созревания семян, является ABI3. У моркови экспрессия гомолога ABI3, гена C-ABI3, а также генов, кодирующих так называемые белки, ассоциированные с эмбриогенными клетками (ECP, Embryogenic Cell Proteins), активируется перед формированием соматических эмбрионов, и было показано, что C-ABI3 индуцирует гены ECP (Karami, Saidi, 2010).
Гиббереллины в целом считаются негативными регуляторами СЭ: повышенный уровень эндогенных гиббереллинов связан со снижением эмбриогенности (Pullman et al., 2004), и экзогенные гиббереллины уменьшают интенсивность СЭ (Tokuji, Kuriyama, 2003). На сое показано, что некоторые гены, кодирующие ТФ с доменом DELLA, отвечающие за подавление гиббереллинового сигна ла, активи руют свою экспре ссию в ходе СЭ (Z he n g et al., 2013). В то же время, гиббереллины могут оказывать положительный эффект на более поздние стадии СЭ. В частности, у Cynodon dactylon гиббереллины стимулируют развитие соматических эмбрионов во взрослые растения (Li, Qu, 2002).
Таким образом, все исследованные в этом аспекте фитогормоны оказывают воздействие на интенсивность и особенности СЭ, однако характер этого воздействия может меняться в зависимости от типа гормона, условий культивирования и вида растений. Несмотря на это, были выявлены отдельные сигнальные пути, посредством которых различные гормоны, например, этилен, регулируют СЭ.
Важнейшими участниками СЭ являются ТФ группы LEAFY COTYLEDON (LEC): LEC1, LEC2 и FUSCA3 (FUS3). Как уже было сказано выше, эта группа объединяет два разных класса ТФ: LEC1 - субъединица HAP3 транскрипционного фактора, связывающего мотив CCAAT (Lotan et al., 1998), в то время как LEC2 и FUS3 – близкородственные ТФ с доменом B3 (Stone et al., 2001, Luerssen et al., 1998). Эктопическая экспрессия генов LEC придаёт вегетативным и репродуктивным тканям эмбриогенные свойства: например, сверхэкспрессия LEC1 подавляет прорастание, а сверхэкспрессия LEC2 (и, в редких случаях, LEC1) приводит к появлению соматических эмбрионов в вегетативных тканях (Lotan et al., 1998, Stone et al., 2001). Гены LEC участвуют в процессе созревания, регулируя действия абсцизовой кислоты и гиббереллинов, а также связаны с работой ауксина: в частности, LEC1 и LEC2 участвуют в метаболизме и сигналинге ауксина, стимулируя экспрессию генов синтеза ауксина группы YUCCA, а также регуляторов ауксинового ответа IAA (Braybrook et al., 2006). Экспрессия гена FUSCA3 стимулируется ауксином (Gazzarrini et al., 2004). Предполагается, что гены LEС способны придавать тканям эмбриональные свойства именно за счёт своей связи с действиями ауксина (Hand et al., 2016).
Интересно, что в геноме растения Kalancho daigremontiana, известного своей способностью к СЭ in vivo, гомолог гена LEC1 кодирует усечённую версию белка LEC1, которая не может восстановить мутацию lec1 у A. thaliana. В то же время, трансформация K. daigremontiana версией KdLEC1 с добавленными недостающими нуклеотидами приводит к получению растений, неспособных к СЭ in vivo. Эти данные позволяют предположить, что мутация в гене LEC1 и является причиной необычных эмбриогенных свойств вида K. daigremontiana (Garcs et al., 2014).
Количественный анализ экспрессии генов PIN Medicago truncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезе
Визуализация экспрессии генов. Детекцию активности репортерного гена GUS осуществляли c помощью субстрата X-Gluc (Thermo Scientific), инкубируя растительные ткани в буфере для GUS-окрашивания (100 mM Tris-Cl (pH 9.5); 100 mM NaCl; 0,5 мМ K3Fe(CN)6; 0,5 мМ K4Fe(CN)6; 0,5 мМ X-Gluc, предварительно растворённый в диметилсульфоксиде) при 37C в течение 1,5-12 часов. Далее каллусы обесцвечивали, погружая в 70% этанол, или фотографировали непосредственно после GUS-окрашивания. Фотографии каллусов получены с помощью стереомикроскопа SteREO Lumar V12 (Carl Zeiss, Германия), снабжённого цифровой камерой MRc5 (Carl Zeiss, Германия) или с помощью стереомикроскопа M205C (Leica, Германия), снабжённого цифровой камерой DFC420 (Leica, Германия).
Статистические методы и компьютерные программы, используемые в работе. Для работы с последовательностями ДНК использовали программы Vector NTI Advance 10 (Thermo Scientific) и ApE (M. Wayne Davis). Для оценки доли видимой поверхности каллуса, покрытой соматическими эмбрионами, использовали программу ImageJ (Schneider et al., 2012).
Достоверность различий в уровнях экспрессии оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Достоверность различий в процентах площади каллуса, покрытой соматическими эмбрионами, оценивали с помощью критерия Манна-Уитни. 3. Результаты и обсуждение
Мы решили начать поиск новых регуляторов СЭ среди генов PIN, участвующих в ранних этапах ЗЭ, а также в развитии тканей, окружающих эмбрион. Исходя из этого, первой поставленной задачей было выявление генов PIN, которые могут участвовать в развитии семязачатков и в ЗЭ у M. truncatula.
У M. truncatula выделено всего 10 генов PIN (MtPIN1-MtPIN10), семь из которых (MtPIN1-5, MtPIN7 и MtPIN10, или SMOOTH LEAF MARGIN 1(SLM1)) принадлежат к группе длинных PIN, т.е., по-видимому, кодируют транспортёры, которые локализованы на плазмалемме и обеспечивают межклеточный транспорт ауксина. Оставшиеся три белка (продукты генов MtPIN6, MtPIN8 и MtPIN9) предположительно локализуются на мембране ЭПС (Keek et al., 2009, Zhou et al., 2011b). С помощью ПЦР-РВ мы провели первичный анализ уровней экспрессии генов длинных PIN для того, чтобы выявить предполагаемых участников эмбриогенеза. Мы измерили уровни экспрессии этих генов в семязачатках M. truncatula (линия 2HA) возрастом от нуля до трёх дней после опыления (в это время эмбрион проходит самые ранние стадии развития, от зиготы до глобулярной стадии (Kurdyukov et al., 2014)). Измерение уровня экспрессии в семязачатках выявляет гены, транскрипция которых происходит не только в клетках эмбриона, но и в клетках окружающих его тканей. Мы предполагаем, что эти же гены могут работать в клетках, окружающих эмбриогенные клетки в каллусе в ходе развития соматических эмбрионов, поэтому их выявление также представляет интерес.
Для выявления тех генов PIN, которые специфично экспрессируются в семязачатках, мы сравнили уровень экспрессии генов PIN в семязачатках с их уровнем экспрессии во взрослом растении M. truncatula (линия 2HA) на вегетативной стадии развития (данную пробу использовали в качестве контроля), который мы приняли равным единице. Гены MtPIN2, 3, 5 и 7 продемонстрировали более низкий уровень экспрессии в семязачатках по сравнению с уровнем экспре ссии во взр о слом растени и. У д вух генов (M t PIN 1 и 4) различ ие межд у двумя пробами было выражено незначительно. У одного гена – MtPIN10 (SMOOTH LEAF MARGIN1) – уровень экспрессии в семязачатках был значительно выше (Таблица 4).
Известно, что у A. thaliana транспортёры PIN, регулирующие формирование эмбриона и прилежащих тканей, также функционируют и в вегетативных частях растения (Keek et al., 2009), поэтому можно предположить, что у M. truncatula в развитии семязачатка могут участвовать гены PIN, которые экспрессируются не только в этом органе. Поэтому, помимо сравнительного анализа экспрессии каждого гена PIN в разных органах растения, мы также сравнили уровни экспрессии разных генов PIN друг относительно друга. Для этого мы проанализировали данные, представленные в атласе экспрессии генов люцерны – Medicago truncatula Gene Expression Atlas (http://mtgea.noble.org/v3/). В этом атласе нет информации об уровнях экспрессии генов в семязачатках, но представлены данные об экспрессии в плодах M. truncatula. Согласно этим данным, максимальный уровень экспрессии в плодах M. truncatula демонстрируют гены MtPIN1, MtPIN4 и MtPIN10 (Таблица 4), при этом для MtPIN4 уровень экспрессии в плодах повышен по сравнению с уровнями в большинстве других исследованных органов (Benedito et al., 2008).
Анализ способностей к СЭ у растений со сверхэкспрессией гена MtWOX9-1
Анализ трансгенных растений с конструкцией pWOX9-1:GUS. Аналогичные ре зул ьт аты были получены и для промотора гена MtWOX9-1: на ранних этапах развития каллуса активность промотора была близка к нулевой (Рисунок 6, а). В развившемся каллусе, перед пересадкой на безгормональную среду, промотор MtWOX9-1 активировался на небольших участках на поверхности каллуса, при этом зоны активации были более размытыми, чем в случае промотора STF (Рисунок 6, б). При появлении соматических эмбрионов мы обнаружили активность промотора непосредственно в зародышах на стадии глобулы, сердца и семядолей, а также в расположенных рядом зонах. Как и в случае с геном STF, в некоторых соматических эмбрионах активность промотора MtWOX9-1 не наблюдалась (Рисунок 6, в-ж). Рисунок 6. Экспрессия конструкции MtWOX9-1:GUS в ходе развития эмбриогенных каллусов. Наличие сине-голубого окрашивания указывает на экспрессию репортерного гена GUS. (а) Каллус на ранней стадии развития (15 день культивации). (б) Развившийся каллус (34 день культивации) перед пересадкой на безгормональную среду. (в)-(ж) Каллусы с соматическими эмбрионами (60-81 день культивации). Чёрными стрелками указаны окрашенные соматические эмбрионы на стадиях глобулы, сердца и семядолей, в которых присутствует экспрессия репортерного гена. Белыми стрелками указаны неокрашенные соматические эмбрионы на стадиях глобулы и сердца, в которых экспрессия репортерного гена не была детектирована.
Анализ трансгенных растений с конструкцией pSLM1:GUS. Промотор гена SLM1 проявлял максимальную активность на этапе формирования каллуса, когда экспланты культивировали на среде с ауксином. В развившемся каллусе зоны экспрессии сужались до небольших участков на поверхности, и впоследствии была заметна активность промотора непосредственно в соматических эмбрионах, а также в ассоциированных с ними зонах (Рисунок 7).
Экспрессия конструкции pSLM1:GUS в ходе развития эмбриогенных каллусов. Наличие сине-голубого окрашивания указывает на экспрессию репортерного гена GUS. (а) Развившийся каллус (34 день культивации) перед пересадкой на безгормональную среду. (б) Каллус после 14 дней культивирования на безгормональной среде (44 день культивации). (в) Каллус с соматическими эмбрионами (59 день культивации). Чёрными стрелками указаны окрашенные соматические эмбрионы на стадиях глобулы, сердца и семядолей, в которых присутствует экспрессия репортерного гена.
Таким образом, результаты локального анализа активности промоторов трёх исследованных генов (STENOFOLIA, MtWOX9-1 и SLM1) согласуются с результатами анализа экспрессии с помощью ПЦР-РВ. Согласно локальному анализу, все три гена экспрессируются в соматических эмбрионах, т.е., как мы и предполагали, являются участниками СЭ. Интересно, что экспрессия всех этих генов не была абсолютно специфичной для соматических эмбрионов. Если эти данные не являются следствием неточности используемого метода (например, из-за неспецифичности GUS-окрашивания или недостаточной длины промотора) и отражают реальные зоны экспрессии исследуемых генов, то неспецифичность экспрессии может быть связана с наличием на поверхности каллуса соматических эмбрионов на более ранних стадиях развития, которые ещё нельзя детектировать с помощью бинокуляра, но в которых уже экспрессируются перечисленные выше гены. Возможно также, что гены экспрессируются в проэмбриональных клетках, которые в дальнейшем могут образовать или не образовать соматические эмбрионы.
Для более детального локального анализа мы создали конструкции, в которых под промоторами STF и MtWOX9-1 находится ген флуоресцентного белка Cherry с сигналом ядерной локализации, а также аналогичную конструкцию для промотора гена MtWOX11-like и флуоресцентного белка GFP.
Для изучения функций гена SLM1 важна не столько локализация зоны его экспрессии, сколько локализация самого белка на мембране. Поэтому нами была создана конструкция, включающая в себя промотор и терминатор SLM1, а также сам ген SLM1, в который встроен ген флуоресцентного белка цитрин.
Нам удалось получить трансгенные растения, содержащие только две из четырёх перечисленных выше конструкций: мы получили 4 растения с геном флуоресцентного белка Cherry под контролем промотора STF, и одно растение с тем же геном-репортером под промотором MtWOX9-1. Трансгенность растений была подтверждена с помощью ПЦР (Рисунок 8). К настоящему моменту получены семена этих растений, и в дальнейшем они будут использованы для локального анализа экспрессии.