Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературыГенетический контроль метаболизма азота и углерода у дрожжей 10
2.1. Метаболизм азота у дрожжей и механизмы его регуляции 10
2.2. Регуляция метаболизма углерода у дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris 19
2.3. Взаимодействие сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию азотного и углеродного метаболизма 40
2.4. Метаболизм фосфора у дрожжей S. cerevisiae и механизмы его регуляции 42
3. Материалы и методы 45
3.1. Среды и условия культивирования 45
3.2. Плазмиды 46
3.3. Штаммы дрожжей и бактерий 48
3.4. Олигонуклеотиды 49
3.4. Методы 52
4. Результаты и обсуждение 60
4.1 Изучение влияния разных типов источников азота и углерода на рост штамма GS115 P. pastoris 60
4.2 Влияние источников азота на экспрессию генов метаболизма метанола 63
4.3 Изучение регуляции промоторов генов АОХ1 и АОХ2 в зависимости от типа источника азота 65
4.4 Влияние ингибитора TOR-киназы рапамицина на уровень активности промотора гена АОХ1 72
4.5 Получение штаммов P. pastoris устойчивых к рапамицину 76
4.6 Влияние делеции в гене PpURE2 на регуляцию промотора гена AOX1 80
4.7 Пролин и глутамат как комплексные источники азота и углерода для P. pastoris 85
4.8 Делеционный анализ промотора гена AOX1 87
4.9 Изучение экспрессии гена АОХ1 в популяции клеток P. pastoris 95
4.10 Анализ активности промотора гена АОХ1 P. pastoris с использованием дрожжей S. сerevisiae 100
4.11 Влияние концентрации фосфата в среде на активность промоторов генов АОХ1 и АОХ2 103
4.12 Изучение влияния концентрации ортофосфата на экспрессию генов DAS, FLD, DAK, PpPEX5 105
4.13 Анализ влияния делеций в промоторе гена АОХ1 на его регуляцию фосфатом 107
4.14 Влияние ингибитора циклинзависимых киназ флавопиридола на уровень активности промотора гена АОХ1 109
4.15 Оптимизация условий культивирования штаммов P. pastoris 111
5. Заключение 117
6. Выводы 122
7. Список используемых сокращений 123
8. Список цитируемой литературы 124
- Регуляция метаболизма углерода у дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris
- Штаммы дрожжей и бактерий
- Влияние ингибитора TOR-киназы рапамицина на уровень активности промотора гена АОХ1
- Изучение влияния концентрации ортофосфата на экспрессию генов DAS, FLD, DAK, PpPEX5
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение генетических механизмов, лежащих в основе адаптации клетки к условиям окружающей среды, является фундаментальной проблемой биологии. В живой клетке множество рецепторов обеспечивают постоянный контроль состава среды. Передача сигнала о наличии питательных веществ осуществляется с помощью различных регуляторных путей. Для обеспечения специфичности ответа эти пути взаимодействуют между собой, формируя единую регуляторную сеть. Подобная интеграция обеспечивает согласованную регуляцию не просто отдельных генов, а целых генных комплексов, контролирующих различные метаболические пути и состояние органелл клетки.
Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris способны использовать метиловый спирт в качестве единственного источника углерода в среде. Промоторы генов метаболизма метанола, в частности промотор гена алкогольоксидазы I (AOX1), широко применяются для экспрессии чужеродных генов. Несмотря на огромную практическую значимость, до сих пор не существует цельного представления о молекулярных механизмах, обеспечивающих подобную регуляцию. Так же остаётся совершенно неизученным, как на экспрессию генов метаболизма метанола влияют качественные и количественные изменения других компонентов среды – источника азота и концентрации ортофосфата.
Начальные этапы утилизации метанола происходят в пероксисомах, которые играют основную роль в функционировании клеток P. pastoris. При этом влияние источника азота и концентрации ортофосфата на функционирование этих клеточных органелл у P. pastoris практически не изучено. В последнее время у ряда модельных объектов обнаружена зависимость состояния пероксисом от митохондрий. Однако изучение подобного взаимодействия у P. pastoris осложнено тем, что эти дрожжи являются облигатными аэробами и неспособны существовать при нарушении функций митохондрий. Исследование механизмов координированной регуляции углеродного и азотного метаболизма позволит предложить новые подходы к исследованию взаимодействия органелл у дрожжей P. pastoris, основанные на применении сочетаний различных источников азота и углерода, используемых при культивировании.
Целью данной работы является изучение влияния источников азота и углерода, а так же концентрации ортофосфата в среде на экспрессию генов метаболизма метанола и биогенеза пероксисом у дрожжей P. pastoris и поиск регуляторных генов, вовлеченных в эти процессы. Для достижения цели были сформулированы следующие задачи исследования:
1. Определить уровень экспрессии генов, кодирующих ферменты катаболизма метанола (AOX1, AOX2, CAT1, DAK, DAS, FLD, FGH) и биогенеза пероксисом (PpPEX1, PpPEX5, PpPEX8 и PpPEX14) в зависимости от источника азота и углерода в среде.
-
Определить уровень экспрессии генов метаболизма метанола и биогенеза пероксисом при различных концентрациях ортофосфата в средах с сульфатом аммония в качестве источника азота.
-
Установить области промотора гена АОХ1, ответственные за регуляцию его активности в зависимости от источника азота, а так же от концентрации ортофосфата.
4. Изучить влияние ингибиторов циклинзависимых и Tor-киназ на экспрессию гена АОХ1.
Основные положения, выносимые на защиту. 1. Гены метаболизма метанола и гены,
вовлеченные в функционирование и биогенез пероксисом, координированно отвечают на изменение источника азота и концентрации ортофосфата в среде и, таким образом, представляют собой регулон. 2. В регуляцию экспрессии гена алкогольоксидазы АОХ1 вовлечены TOR-киназы и киназы, ингибируемые флавопиридолом.
Научная новизна диссертационной работы. Впервые у дрожжей P. pastoris исследована регуляция экспрессии генов метаболизма метанола, а так же генов, вовлечённых в функционирование пероксисом, в ответ на изменение различных факторов среды – источника азота и концентрации ортофосфата. Впервые в составе промотора гена AOX1 выявлены участки, вовлечённые в его азотную и фосфатную регуляцию. Продемонстрировано, что ингибитор Тоr-киназного комплекса рапамицин и ингибитор циклин-зависимых киназ флавопиридол, влияют на уровень экспрессии гена АОХ1, кодирующего ключевой фермент метаболизма метанола. В ходе работы получены штаммы P. pastoris и оптимизированы условия культивирования метилотрофных дрожжей – продуцентов рекомбинантных белков.
Теоретическая и практическая значимость результатов работы. Полученные в работе результаты позволили выявить координированную регуляцию генов метаболизма метанола и генов, кодирующих белки пероксисом. Показано, что ключевыми участниками этих сигнальных путей, являются Тоr-киназа и циклин-зависимые киназы. Практическая значимость работы определяется тем, что метилотрофные дрожжи P. pastoris широко используются в биотехнологии для синтеза белков различного происхождения, поэтому выявленные механизмы регуляции позволят поддерживать оптимальный баланс между уровнем экспрессии гетерологичного гена, ростом и жизнеспособностью клеток дрожжей.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывали и обсуждали на следующих конференциях: на V съезде ВОГиС (Москва, Россия, 2009г.), на 14-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых “Биология – наука ХХI века” (Пущино, Россия, 2010 г.), на VI Всероссийской конференции молодых учёных “Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой” (Саратов, Россия, 2012 г.), на III и VI Всероссийских форумах студентов, аспирантов и молодых ученых “Наука и инновации в технических университетах” (Санкт-Петербург, 2009 и 2012 г.), на V Международной школе
молодых ученых по молекулярной генетике “Непостоянство генома” (Звенигород, Россия, 2012 г.), на III Международной научной интернет-конференции “Биотехнология. Взгляд в будущее” (2014 г.), на Международной научно-практической конференции “Актуальные вопросы современных математических и естественных наук” (Екатеринбург, Россия, 2015 г.), на Международном симпозиуме “VII Symposium on Applied Microbiology” (Сан-Паулу, Бразилия, 2015 г.). Работа выполнена при поддержке грантов ИАС 3.37.222.2015 и 0.37.235.2015.
Публикации. Основные результаты диссертационной работы представлены в виде четырёх статей, опубликованных в ведущих журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Текст диссертации состоит из следующих разделов: “Введение”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты и обсуждение”, “Заключение”, “Выводы”, “Список цитируемой литературы” и “Приложения”. Диссертация представлена на 141 странице и содержит 46 рисунков и 8 таблиц. В “Списке цитируемой литературы” представлены 176 источников.
Регуляция метаболизма углерода у дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris
Для пролина катаболические ферменты кодируются генами семейства PUT. Ген PUT4 кодирует специфическую пермеазу пролина, которая синтезируется только при отсутствии хороших источников азота в среде. PUT3 кодирует транскрипционный фактор, который конститутивно синтезируется в клетке, независимо от наличия пролина. Гены PUT1 и PUT2 кодируют пролиноксидазу и пирролин-5-карбоксилатдегидрогеназу, соответственно. Пролин не может быть усвоен дрожжевыми клетками в отсутствие кислорода, так как первый этап его деградации катализирует O2-зависимая пролиноксидаза Put1p. Так же дрожжи могут использовать в качестве источника азота аргинин, являющийся предшественником пролина в цепи катаболитных реакций (Magasanik & Kaiser, 2002). Катаболизм аргинина включает гидролиз аргиназой (CAR1) с образованием мочевины и орнитина, трансаминирование орнитина продуктом гена CAR2 с выходом глутамата и пирролин-5-карбоксилата (P5C), который восстанавливается до пролина НАДФH-зависимой P5C-редуктазой, продуктом гена PRO3. И только в аэробных условиях, в митохондриях белок Put2 превращает P5C в глутамат (Martin et al., 2003).
Специфические ферменты работают в катаболизме мочевины и аллантоина. Ген DUR3 кодирует мембранный переносчик мочевины. Деградация мочевины до диоксида углерода и аммиака катализируется амидолиазой мочевины, обладающей активностями карбоксилазы и аллофанатгидролазы (продукт гена DUR1,2 ). Транспорт аллантоина через мембрану осуществляется продуктом гена DAL4; ген DAL7 кодирует малатсинтазу аллантоинового катаболизма (Cooper et al., 1980).
Регуляция азотного метаболизма у дрожжей. Качество источника азота в среде влияет на состояние клетки в целом, и у дрожжей существует сложная сигнальная система, обеспечивающая координированную регуляцию многих метаболических путей в ответ на смену источника азота. Для лабораторных штаммов S. cerevisiae, которые в основном являются производными штамма S288C, наиболее предпочтительным источником азота является глутамин (Gln). Штаммы производные штамма 1278b, применяемые при изучении ассимиляции азота, наравне с глутамином используют и соли аммония (NH4+). Для дрожжей S. cerevisiae бедными источниками азота являются пролин (Pro), мочевина (Urea), орнитин и аллантоин. Промежуточное положение в этом ряду занимает глутамат (Glu) (Magasanik & Kaiser, 2002). Критерием для классификации источников азота на более и менее предпочтительные является продолжительность стадий клеточного цикла, а так же наличие азотной катаболитной репрессии (NCR – nitrogen catabolite repression), которая заключается в подавлении генов и остановке процессов утилизации бедных источников азота при наличии в среде глутамина или солей аммония (Magasanik, 1992).
В культурах дрожжей выращенных на бедном источнике азота наблюдаются процессы автофагии, а так же псевдомицелиальный и инвазивный рост. При переносе клеток в среду, содержащую глутамин наблюдается активация биогенеза рибосом и репрессия генов пермеаз различных аминокислот. При отсутствии источника азота в среде гаплоидные клетки дрожжей переходят в состояние покоя, а диплоидные клетки претерпевают мейоз и споруляцию (Beeser & Cooper, 2000). Перенос клеток со среды с бедным источником азота на среды с глутамином или солями аммония приводит к изменениям в транскрипции множества генов (Magasanik, 1992).
У дрожжей S. cerevisiae экспрессия более 90 генов азотного метаболизма регулируется системой, основу которой составляют четыре транскрипционных фактора относящихся к семейству факторов GATA-типа (Marzluf, 1997). Два из них - Gln3p и Gat1p являются активаторами, а другие два – Dal80p и Gzf3p репрессорами. Азотная катаболитная репрессия осуществляется в основном за счёт изменения внутриклеточной локализации активаторов транскрипции. При росте на среде с бедным источником азота Gln3p и Gat1p локализуются в ядре, где они связаны с GATA-последовательностями внутри промоторов регулируемых генов, тогда как при росте на среде с глутамином или солями аммония оба транскрипционных фактора остаются в цитоплазме. Gln3p является активатором транскрипции генов GАТ1 и DAL80, что обеспечивает положительную и отрицательную обратную связь при регуляции индукции генов азотного метаболизма (Coffman et al., 1997; Cunningham & Cooper, 1991). Белок Ure2p связывает Gln3p, чем определяет его локализацию в цитоплазме клетки. В клетках дрожжей, несущих мутацию ure2, белок Gln3p локализуется в ядре и азотная катаболитная репрессия полностью нарушена. Другой активатор Gat1p при этом остаётся в цитоплазме, что позволяет предположить, что его локализация в цитоплазме обеспечивается наличием другого белка подобного Ure2p (Stanbrough et al., 1995). Схема взаимной регуляции GATA-факторов представлена на рисунке 2.
Штаммы дрожжей и бактерий
Помимо обеспечения азотной катаболитной репрессии, Tor-киназы играют ключевую роль в координации углеродного и азотного метаболизма. TORC1 комплекс является ключевым звеном координированной регуляции экспрессии ядерных и митохондриальных генов – ретроградной регуляции (Cardenas et al., 1999). Для использования бедных источников азота клеткам дрожжей необходимы ферменты, катализирующе первые реакции цикла трикарбоновых кислот. При этом у S. cerevisiae гены, кодирующие данные ферменты, репрессируются при наличии глюкозы в среде. Таким образом, для обеспечения оптимального роста на средах с глюкозой и бедными источниками азота клеткам дрожжей необходима система, которая будет противодействовать глюкозной репрессии. Такую функцию выполняет сигнальный путь ретроградной регуляции, который стимулирует экспрессию генов, вовлечённых в цикл трикарбоновых кислот даже в присутствии глюкозы (Рис. 8).
Центральную роль в ретроградной регуляции играют транскрипционные активаторы Rtg1p и Rtg3p, функционирующие в составе гетеродимеров. При наличии в среде богатых источников азота Tor-киназа фосфорилирует негативный регулятор Mks1p, который затем взаимодействует с белками семейства 14-3-3 Bmh1 и Bmh2. Образующийся комплекс связывает гетеродимеры Rtg1/Rtg3 и удерживает их в цитоплазме. Помимо этого Tor-киназа может фосфорилировать сами белки-активаторы Rtg1 и Rtg3, что так же препятствует их транспорту в ядро. При истощении богатых источников азота Mks1р дефосфорилируется, а его комплексы с белками Bmh1 и Bmh2 диссоциируют. Гетеродимеры Rtg1p/Rtg3p направляются в ядро и стимулируют экспрессию генов, подверженных ретроградной регуляции (Loewith & Hall, 2011).
Механизмы ретроградной регуляции у S. cerevisiae при наличии в среде глюкозы как источника углерода (по Loewith & Hall, 2011). Если доступны богатые источники азота Tor-киназный комплекс фосфорилирует Mks1p, который затем связывается с белками Bmh1 и Bmh2. Образующийся комплекс препятствует транспорту ТФ Rtg1p и Rtg3p в ядро. При наличии только бедных источников азота в среде инактивация комплекса TORC1 и высвобождение Tap42p – фосфатазных комплексов приводит к дефосфорилированию Mks1p, его высвобождению из комплекса с Bmh1p и Bmh2p и связыванию с Rtg2. Белки Rtg1 и Rtg3 поступают в ядро и активируют транскрипцию генов, подверженных ретроградной регуляции (RTG – генов). 2.4. Метаболизм фосфора у дрожжей S. cerevisiae и механизмы его регуляции
В живой клетке ортофосфат является ключевым компонентом нуклеиновых кислот, молекул АТФ, входит в состав фосфолипидов и фосфопротеидов. Для дрожжей предпочтительным источником фосфора является неорганический ортофосфат. Его перенос из среды осуществляется особыми транспортными белками – пермеазами. У дрожжей S. cerevisiae выявлено несколько пермеаз, обладающих разным сродством к неорганическому фосфату (Bun-ya et al., 1991; Bergwitz et al., 2011; Ghillebert et al., 2011).
При полном отсутствии свободного неорганического фосфата в среде дрожжи способны утилизовать самые разнообразные фосфоорганические вещества. Для этого клетки дрожжей обладают целым набором специальных ферментов – фосфатаз, которые осуществляют гидролиз фосфоэфирных связей в составе подобных соединений (Vogel et al., 1990). В зависимости от условий, в которых работают эти ферменты, их относят к двум разным группам. Кислые фосфатазы выделяются клеткой в периплазматическое пространство, и в связи с этим, приспособлены к работе в кислой среде (pH 3.0-4.0). Щелочные фосфатазы функционируют внутри клетки в вакуолях и цитоплазме при оптимуме pH 8.0. У дрожжей S. сerevisiae кислые фосфатазы представлены целым семейством изозимов, кодируемых генами РНО3, РНО5, PHO10 и РНО11 (Самбук, Падкина, 2013). Синтез репрессибельных КФ - Pho5p, Pho10p и Pho11p, осуществляется только при дефиците фосфата. Ген РНО5, использованный в данной работе, кодирует основную форму репрессибельной КФ, обеспечивающую большую часть ей активности (Payne et al., 1995).
Синтез репрессибельной КФ Pho5 в норме происходит только при недостатке ортофосфата в культуральной среде (Lau et al., 1998). На рисунке 9 представлена схема регуляции экспрессии гена PHO5 в ответ на изменения концентрации ортофосфата.
Влияние ингибитора TOR-киназы рапамицина на уровень активности промотора гена АОХ1
Эффективность метаболических процессов определяет скорость роста и деления клеток. Чтобы охарактеризовать влияние типа источника азота на рост дрожжей P. pastoris культуры исходного штамма GS115 выращивали в жидких средах различного состава. В качестве источников углерода использовали глицерин и метанол. В качестве источников азота были выбраны сульфат аммония, глутамин, глутамат, мочевина и пролин. На рисунке 11 представлены кривые роста штамма GS115 P. pastoris в средах различного состава.
Как видно, при выращивании штамма GS115 в средах с глицерином (MG) тип источника азота практически не влияет на скорость роста и конечную плотность культуры. Совсем иная картина наблюдается при выращивании P. pastoris в средах MM с разными источниками азота и метанолом в качестве источника углерода. В средах, содержащих бедный источник азота пролин, оптическая плотность культуры примерно в полтора раза выше, чем при использовании глутамина, сульфата аммония или мочевины. Глутамат при этом занимает промежуточное положение.
Рост штамма GS115 P. pastoris в средах с глицерином и пролином в качестве источника азота не отличается от роста в средах метанолом и пролином. Когда же в качестве источников азота использовали сульфат аммония, глутамин или мочевина, то использование глицерина в качестве источника углерода приводит к почти двукратному увеличению оптической плотности культуры, по сравнению со средами с метанолом.
В биотехнологии применяются штаммы P. pastoris, характеризующиеся различными фенотипами, в зависимости от их способности к утилизации метанола. Исходный штамм GS115 (his4 AOX1 AOX2) относится к дикому типу -Mut+. Делеция гена алкогольоксидазы AOX1 приводит к замедленному росту на Рисунок 10. Кривые роста штаммов P. pastoris в средах с глицерином (MG) или метанолом (MM). В качестве источников азота использовали сульфат аммония (NH4+), глутамин (Gln), глутамат (Glu), мочевину (Urea) и пролин (Pro). А – рост штамма GS115 (his4 AOX1 AOX2) в средах с глицерином (MG) и различными источниками азота. B – рост штамма GS115 (his4 AOX1 AOX2) в средах с метанолом (MM) и различными источниками азота. C – рост штамма 5-GS115 (aox1::HIS4 AOX2) в средах с метанолом (MM) и различными источниками азота. средах с метанолом (фенотип MutS). Такие штаммы чаще всего используются в биотехнологии, поскольку они меньше окисляют метанол при индукции синтеза рекомбинантного белка. Активность алкогольоксидазы сохраняется за счет экспрессии гена АОХ2.
В связи с этим на следующем этапе работы исследовали рост штаммов P. pastoris с фенотипом MutS в средах с метанолом и различными источниками азота. Для этого был сконструирован штамм 5-GS115 (aox1::HIS4 АОХ2), несущий делецию гена AOX1 (MutS), у которого активность алкогольоксидазы проявляется только за счет экспрессии гена AOX2. Исходный штамм GS115 (his4 AOX1 AOX2) трансформировали фрагментом плазмиды pPIC9, полученным при её обработке рестриктазой BglII. При этом происходило замещение гена АОХ1 за счет гомологичной рекомбинации с его промотором и терминатором. В связи с тем, что плазмида pPIC9 содержит маркерный ген HIS4, трансформанты отбирали на селективной среде по восстановлению способности синтезировать гистидин. Наличие делеции гена АОХ1 подтверждали с помощью ПЦР и секвенирования (см. Приложения).
Рост штамма 5-GS115 (aox1::HIS4 АОХ2), характеризующегося фенотипом MutS, определяли в жидких средах ММ с метанолом и разными источниками азота (Рис. 10). Кривые роста полученного штамма характеризуются сниженными значениями клеточных плотностей в стационарной фазе роста по сравнению с исходным штаммом GS115 (his4 AOX1 AOX2), что связано с уменьшением активности алкогольоксидазы. При этом различия в конечных плотностях клеточных культур в средах с разными источниками азота сохраняются. В средах, содержащих пролин, конечная плотность культуры примерно в два раза выше, чем при использовании глутамина, сульфата аммония и мочевины. Глутамат, как и в случае исходного штамма GS115, занимает промежуточное положение.
Поскольку при делеции гена AOX1, который обеспечивает около 90% алкогольоксидазной активности в клетках P. pastoris, сохранялись различия в росте штаммов на средах с метанолом и разными источниками азота, можно предположить, что регуляция генов АОХ1 и АОХ2 зависит от качества источника азота.
Поскольку тип источника азота влиял на рост культур P. pastoris в средах с метанолом, следующим этапом работы стало изучение экспрессии MUT- и PEX-генов. В качестве мишеней были выбраны три группы генов: гены, кодирующие основные ферменты пути утилизации метанола (AOX1, AOX2, CAT1, DAK, DAS, FLD, и FGH), гены, отвечающие за биогенез и деградацию пероксисом (PpPEX5 и PpPEX14), а так же гены, кодирующие белки-регуляторы биогенеза пероксисом -PpPEX8 и PpPEX1. Уровни экспрессии исследуемых генов определяли с помощью ПЦР в режиме реального времени.
Штамм GS115 выращивали до ранней логарифмической фазы в средах, содержащих метанол, в качестве источника углерода. В качестве источников азота были выбраны сульфат аммония и пролин, поскольку они показали наиболее контрастные результаты в экспериментах по росту клеточных культур. На рисунке 12 представлены результаты количественного анализа уровня экспрессии исследуемых генов относительно уровня экспрессии референсных генов АСТ1 и ТВР1 в зависимости от типа источника азота в среде. Показано, что использование пролина в качестве источника азота существенно снижает уровень экспрессии исследуемых генов по сравнению с сульфатом аммония. Полученные результаты позволяют предположить, что данная регуляция осуществляется на уровне транскрипции.
Изучение влияния концентрации ортофосфата на экспрессию генов DAS, FLD, DAK, PpPEX5
Плазмида pJET1.2-Ppure2f\ZeoR была использована в качестве матрицы для амплификации фрагмента Ppure2ZeoR, представляющего из себя последовательность гена устойчивости к зеоцину, фланкированную фрагментами гена PpURE2. Данным ПЦР-продуктом был трансформирован штамм tr2-4-GS115 (phox his4::PAOXl-PH05 HIS4). Трансформантов отбирали по устойчивости к антибиотику зеоцину. Наличие делеции в гене PpURE2 у полученных клонов проверяли методами ПЦР и секвенирования (см. Приложения). Один из трансформантов tr7-4-GS115 (Ppure2AZeoR phox his4::PAOXl-PH05 HIS4) использовали в дальнейшей работе. Чтобы оценить влияние делеции в гене PpURE2 на регуляцию промотора гена AOX1 выращивали штаммы tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) и tr7-4-GS115 (Ppure2Shble phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) в средах с метанолом и сульфатом аммония или пролином. После 40 часов культивирования измеряли активность КФ (рис. 23).
В том случае, если бы Ure2p участвовал в выявленной регуляции, делеция в гене PpURE2 должна была привести к отсутствию репрессии промотора AOX1 пролином. Как видно из рисунка 24, наличие данной делеции не влияет на регуляцию промотора AOX1 пролином, следовательно Ure2p у P. pastoris не участвует в регуляции гена АОХ1. 4.7. Пролин и глутамат как комплексные источники азота и углерода для P. pastoris
Эксперименты по культивированию штамма GS115 в средах различного состава показали, что пролин и глутамат влияют на рост культур только в средах с метанолом, который является менее доступным для усвоения, чем глицерин. Причём использование этих двух источников азота у P. pastoris приводило к росту культуры до больших клеточных плотностей по сравнению с сульфатом аммония, глутамином и мочевиной. Тогда как для дрожжей S. cerevisiae показано, что использование бедных источников азота – пролина, мочевины и глутамата, наоборот, приводит к замедленному росту культуры (Magasanik& Kaiser, 2002).
Эти результаты позволили предположить, что в дрожжи P. pastoris способны использовать пролин и глутамат в качестве комплексных источников азота и углерода. Для проверки этого предположения культивировали штамм GS115 в средах, содержавших только сульфат аммония, глутамин, глутамат, мочевину или пролин (Рис. 24).
Кривые роста штамма GS115 P. pastoris в средах содержащих сульфат аммония, глутамин, глутамат, мочевину или пролин в качестве единственных источников азота и углерода. Как видно из рисунка 24 дрожжи P. pastoris способны расти на средах с пролином и глутаматом в качестве комплексных источников азота и углерода. При этом они не растут в средах содержавших только сульфат аммония, глутамин или мочевину.
Эксперименты со штаммом tr7-GS115 (Ppure2Shble his4::PAOX1-PHO5 HIS4) несущим делецию в гене PpURE2, позволяют предположить, что механизмы азотной катаболитной репрессии не участвуют в обнаруженной регуляции промотора АОХ1 пролином. Чтобы это подтвердить исследовали активность промотора АОХ1 в средах с метанолом, содержавших смесь пролина и сульфата аммония. Штамм tr2-1-GS115 культивировали в средах с метанолом в течение 40 часов. Результаты измерения удельной активности КФ представлены на рисунке 25.
Удельная активность КФ Pho5 (OD410/OD550), секретируемой штаммом tr2-1-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) P. pastoris. Использовали среду с метанолом и сульфатом аммония, а так же среду с метанолом и смесью пролина и сульфата аммония. Наблюдали достоверное различие удельной активности КФ (p-value 0,05). Показано, что у P. pastoris несмотря на присутствие сульфата аммония в среде, промотор АОХ1 репрессируется при добавлении пролина. Таким образом, регуляция гена АОХ1, а так же остальных MUT- и PEX-генов пролином и глутаматом отлична от азотной катаболитной репрессии и, возможно, связана с тем, что они используются дрожжами P. pastoris в качестве комплексных источников азота и углерода.
У дрожжей S. cerevisiae добавление богатого источника азота - сульфата аммония в среду приводит к активации азотной катаболитной репрессии и препятствует синтезу ферментов, обеспечивающих транспорт и утилизацию бедных источников азота, в частности пролина (Magasanik& Kaiser, 2002). Очевидно, что у дрожжей P. pastoris на средах с метанолом в качестве источника углерода, пролин транспортируется внутрь клетки и метаболизируется, даже несмотря на наличие в среде богатого источника азота – сульфата аммония. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют так же и о наличии кардинальных различий в механизмах азотной регуляции у дрожжей P. pastoris и S. cerevisiae.