Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов и установление генетического контроля процесса гомологичной рекомбинации представляет одну из фундаментальных задач современной генетики. Конкретизация представлений о механизме гомологичной рекомбинации связана с использованием микроорганизмов как модельных генетических объектов. Это позволило дока -зать правильность механизма кроссинговера, предложенного Хол-
ЛИДЄЄМ (Holliday, 1964), КОТОРЫЙ 88ТЄМ был уТОЧНвН (Mesel-аоп, Raddlng, 1975). Ой ОбЪЯСНЯвТ ТЭККв Образование рвКОМби-
нантов при различных способах обмена генетической информацией у бактерий.
Излюбленным объектом для изучения молекулярных механизмов многих генетических процессов являются клетки е. coll. у данной бактерии описаны разнообразные Rec" ыутанаы, которые подробно охарактеризованы с генетической и биохимической точек зрения. Многие из гее генов е. coli были клонированы, что помогло выделению и очистке кодируемых ими белков.
Клетки вес. eubtilie с этой точки зрения изучены менее подробно. Для Bsc. subtiiis описано несколько гее мутаций, но для большинства из них не известны кодируемые продукты.
В этой связи актуальным представлялось генетическое и биохимическое изучение процессов гомологичной рекомбинации у Вас, subtiiis, учитывая практическое значение бацилл как продуцентов ряда ферментов и белков, а такае перспективу использования клеток данного микроорганизма в качестве реципиентов «тонированных генов.
Цели и задачи исследования.Цельа данного исследования являюсь изучение генетического контроля процесса гомологичной ре-сомбинации бактерий на примере трансформации и транедукции у tea. eubtilie. взаимосвязи рекомбинации с процессами репара-ии и мутагенеза, выяснение роли отдельных ферментов в ука-анных процессах.
Конкретными задачами исследования явились следующие. ) Получение новых Ree" мутантов Вас* subtiiis и характерис-ика их рекомбинационной и репарационной способности, а такае зучеаие особенностей спонтанного и индуцированного мутагене-
- I -
за. 2) Проведение генетического картирования полученных гее мутаций и установление биохимической природы нарушений, вызываемых данными мутациями. 3) Получение и характеристика мутантов с измененной' активностью АТФ-зависиыой "ДНКазы и экзо -нуклеазы I для выяснения роли этих ферментов, в процессах репарации и рекомбинации и возмонности супрессии этих мутаций по аналогии с соответствующими мутантами е. ссіі. 4) Клони -рованив генов, кодирующих структуру АЇФ-зависимой ДНКазы, и проведение комплементационного анализа с описанными ранее мутациями Вас. subtilie гас Н342, гее Е5 и МуТЭЦИЯМИ гее ВС
е. coll. 5) Выяснение роли ДНК-гиразы в процессах рекомбинации путем получения и изучения мутантов вас. eubtiiie с нарушенной активностью данного фермзнта.
Научная новизна и практическая ценность работы. Проведен генетический и биохимический анализ 26 мутантов с нарушекноі способностью к рекомбинации, который позволил выявить 6 новы: генов Вес. eubtili» и в .некоторых случаях установить природу кодируемых ими продуктов.
Впервые для вес eubtiiie выявлен ген, получивший обозна чение гас и, мутации,в котором снижают активность новой эк зонуклеазы, специфичной к денатурированной ДНК и активируемо ионами Са++. Активность этой нуклеазы требуется для осуществ ления процессов репарации, рекомбинации и индуцированного щ тагенеза.
Обнаружен новый ген, получивший обозначение гее т. Мутащ в атом гене повышают чувствительность к митомицину, снижай частоту трансформации и транедукции.
Впервые для вас subtilis выявлены мутанты со сниженноі активностью экзонуклёазы I. Ген, кодирующий ее структуру, бі обозначен как вхо а. Мутации в гене ехо а вызывают резкі повышение чувствительности к УФ-облучению и митомицину,НЄЗНі чительное снижение частоты трансформации и транедукции.
Впервые получена большая коллекция мутантов вас. subtil со сниженной активностью АТФ-зависимой ДНКазы. Генетический комплементационный анализ позволил установить, что изученн мутации затрагивают два рядом расположенных гена, для котор предложено обозначение Гвс Q и гее R.
Гены гее Q и гее R, клонированные на плазмиде ркиї, пс
ностыо восстанавливали экзонуклеазную активность АТФ-зависи -мой ДНКазы в клетках гее вгі гее егг мутанта е. colt и частично суарессировали повышенную чувствительность этого мутанта к УФ-облучению и митомицину. Последующее субклонирование этих генов позволило установить, что ген гее q кодирует эк~ зонуклеазную субъединицу АТФ-зависимой ДНКазы Вас subtilia и функционально аналогичен гену гее о є» coll. Продукт гена rec R не идентифицирован, но именно он вызывает супрессию репарационной недостаточности гее в гее с цутанта . coll.
Получен инсерционный мутант по гену гее R. Показано, что нарушение процессов репарации и рекомбинации, гызыэаеыое мутацией rec R, супрессируется введением дополнительной мутации ехо а, снижающей активность экзонуклеазы I, аналогично супрессии мутаций е. coil гее в гас с нутацией вЬс в. Таким образом, для клеток вас subtilia впервые показано наличие множественных метаболических путей рекомбинации.
Обнаружен мутант со сниженной активностью АТФазы, стимулируемой одноцепочечной ДНК» Структурный ген данной АТФазы по-тучил обозначение rec s. Снижение активности АТФазы приводи-ю к возрастанию экзонуклеазной активности АТФ-зависимой ДНК-1зы. Мутации rec s увеличивают чувствительность к УФ-облуче-[ию и ыитомицину, резко снижают частоту хромосомной трансфор-іации и приблизительно в 3 раза - частоту транедукции.
Анализ мутантов с нарушенной активностью ДНК-гиразы пока-ал необходимость отрицательной суперспирализации для успеш-ого протекания процессов репарации и рекомбинации.
Впервые показано, что нарушение процессов рекомбинации у
jyr в мутантов полностью супрессируется повышением активнос-
и экзонуклеазы I. Клетки с повышенной активностью экзонукле-
зы I обнаруживают гипер- Rec фенотип.
Проведенный анализ позволил составить более полную картину
ЗНЄТИЧЄСКОГО КОНТРОЛЯ И ВЗаИМОДейСТВИЯ ПРОДУКТОВ раЗНЫХ гее
шов в процессе гомологичной рекомбинации вас subtilia. легченные результаты могут быть использованы при проведении шно-иняенерных и селекционных работ С Вас. »иЬм.іі8Лолучен-re Rec- мутанты можно испольэовать для определения мутаген-ій активности химических соединений. Получено авторское сви-тельство № 1032766 от 15 декабря 1981 г.
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре генетики Казанского университета в курсах "Молекулярная генетика", "Генетика микроорганизмов", "Избранные главы генетики", на большой практикуме, при выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы работы доложены на ХІУ Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978), на ІУ, У и УІ Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1979, 1983, 1987), на ІУ и У Всесоюзных съездах генетиков и селекционеров (Кишинев, 1982, Москва, 1987), на УІ рабочем совещании по программе "Плазмида" (Москва, 1981), на X теоретическом семинаре по молекулярной генетике (Пущино, 1981), на I и П Всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1984, 1986), на Всесоюзной итоговой конференции "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" (Рига, 1985), на годовых отчетных конференциях сотрудников Казанского университета (1978, 1981, 1982, 1984, 1985, 1986, 1987, 1988).
Публикации.. Основные положения работы опубликованы в 24 печатных статьях, монографии "Механизмы репарации, рекомбинации и мутагенеза бактерий" и учебном пособии "Молекулярная генетика".
Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены как лично автором, так и в соавторстве с сотрудниками кафедры генетики Казанского университета, работавшими по; руководством автора. Часть работы, связанная с клонированием генов, выполнена совместно с сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики АН СССР (Москва),
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 1 глав, заключения, выводов, раздела "Материалы и методы", приложения. Работа содержит 326 страниц машинописного текст; включая 66 таблиц, 27 рисунков. В списке литературы приведені 380 наименований.
В первой главе, являющейся обзором литературы, приводите; данные о механизмах генетической трансформации и роли Rec белка в гомологичной рекомбинации. Основные экспериментальны данные изложены во второй - четвертой главах диссертации.
-Л -