Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы. 40
1.1. Факторы риска мультифакторных (комплексных) заболеваний.
1.1.1. Наследственная составляющая мультифакторных заболеваний .
1.1.2. Генетический полиморфизм. 42
1.1.3. Однонуклеотидные замены. 42
1.1.4. Экзогенные факторы риска мультифакторных заболеваний и эпигенетическая регуляция экспрессии генов.
1.1.5. Заключение. 45
1.2. Методы картирования генов-кандидатов мультифакторных заболеваний.
1.2.1. Основные подходы. 45
1.2.2. Анализ функциональных ассоциаций. 47
1.2.3. Полногеномный анализ ассоциаций и сцепления. 49
1.2.4. Полногеномное секвенирование. 51
1.2.5. Анализ транскриптома. 52
1.2.6. Анализ эпигенома. 53
1.2.7. Генные сети и компьютерная геномика. 54
1.2.8. Системно-генетический подход. 56
1.2.9. Заключение. 57
1.3. Методы детекции мутаций. 57
1.3.1. ДНК-биочипы. 59
1.3.1.1. Типы биочипов. 59
1.3.1.2. Биочипы «низкой плотности». 60
1.3.1.3. Биочипы «высокой плотности». 63
1.3.1.4. Заключение. 63
1.3.2. Технология полногеномного секвенирования. 63
1.3.3. Заключение. 66
1.4. Методы и подходы для оценки риска наследственной предрасположенности к мультифакторным заболеваниям.
1.4.1. Межгенные взаимодействия. 66
1.4.2. Эффекты эпистаза. 68
1.4.3. Генетика количественных признаков и оценка риска мультифакторных заболеваний .
1.4.4. Биоинформатический подход. Анализ генных сетей. 71
1.4.5. Оценка индивидуального риска с помощью математической ст атистики.
1.4.6. Математическое моделирование признаков (заболеваний) человека на основе множественной информации.
1.4.6.1. Байесеновская модель. 75
1.4.6.2. Множественное снижение размерности. 76
1.4.6.3. Линейная модель. 77
1.4.6.4. Статистические интернет-ресурсы. 79
1.4.7. Предсказательная сила генетического тестирования.
1.4.7.1. ROC кривые. 80
1.4.7.2. Оценка эффективности генетических исследований как диагностических тестов.
1.4.7.3. Клиническая значимость результатов исследования.
1.4.8. Заключение. 84
1.5. Частые мультифакторные заболевания с гипертензивным синдромом.
1.5.1. Акушерская патология. Гестоз. Генетические факторы риска гестоза.
1.5.1.1. Гены «тромбофилии». 91
1.5.1.1.1. Ген фактора 5 свертывания крови. 93
1.5.1.1.2. Ген фактора 2 свертывания крови (протромбина). з
1.5.1.1.3. Ген -субъединицы фибриногена. 93
1.5.1.1.4. Ген гликопротеина 3a. 94
1.5.1.1.5. Ген ингибитора активатора плазминогена 1 типа. 94
1.5.1.1.6. Ген 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы. 95
1.5.1.2. Гены регуляции «артериального давления» и «эндотелиальной дисфункции».
1.5.1.2.1. Ангиотензиноген. 96
1.5.1.2.2. Ангиотензинпревращающий фермент. 97
1.5.1.2.3. Рецептор 1 к ангиотензину II. 98
1.5.1.2.4. Рецептор 2 к ангиотензину II. 99
1.5.1.2.5. Эндотелиальная NO синтаза. 99
1.5.1.3. Гены «метаболизма липидов». 100
1.5.1.3.1. Ген липопротеинлипазы. 100
1.5.1.3.2. Ген аполипопротеина E.
1 1.5.1.4. Гены гестоза, выявленные с помощью метода полногеномного скрининга ассоциаций.
1.5.1.5. Изменение уровня микроРНК. 103
1.5.1.6. Эпигенетические маркеры риска развития гестоза. 105
1.5.2. Артериальная гипертензия. Генетические факторы риска артериальной гипертензии.
1.5.2.1. Ренин-ангиотензиновая и кинин-брадикининовая системы. 109
1.5.2.1.1. Ренин. 111
1.5.2.1.2. Рецептор 2 к брадикинину. 112
1.5.2.1.3. Другие гены.
1 1.5.2.2. Метаболизм липидов. 112
1.5.2.3. Обмен гомоцистеина. 113
1.5.2.4. Бета-адренорецепторы. Ген 2 адренорецептора. 113
1.5.2.5. Гены артериальной гипертензии, установленные методом полногеномного скрининга ассоциаций.
1.5.2.6. Другие гены-кандидаты. 115
1.5.3. Метаболические болезни. Генетические факторы риска ожирения и метаболического синдрома.
1.5.4. Заключение. Общие гены-кандидаты, ассоциированные с риском развития гестоза, артериальной шипертензии и метаболического синдрома с ожирением.
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. 129
2.1. Создание коллекций образцов и формирование клинических групп.
2.2. Выделение геномной ДНК. 133
2.2.1. Экстракция ДНК из лимфоцитов периферической крови. 133
2.2.2. Экстракция ДНК из клеток буккального эпителия. 133
2.2.3. Экстракция ДНК из ворсин плаценты.
2.3. Обработка ДНК бисульфитом натрия. 133
2.4. Экстракция микроРНК. 134
2.5. Обратная транскрипция и получение кДНК. 134
2.6. ПЦР/ПДРФ анализ.
2.6.1. Выбор праймеров. 134
2.6.2. Амплификация фрагментов ДНК. 135
2.6.3. Обработка эндонуклеазами рестрикции. 136
2.6.4. Визуализация ПЦР-продуктов. 137
2.7. Анализ однонуклеотидных замен методом гибридизации на ДНК-биочипе.
2.7.1. Выбор праймеров и олигонуклеотидов. 139
2.7.2. Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов. 143
2.7.3. Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе.
2.7.4. Визуализация ПЦР-продуктов в агарозном геле. 145
2.7.5. Гибридизация меченого продукта на биочипе. 146
2.7.6. Регистрация изображения на биочипе и его обработка. 147
2.8. Анализ метилирования остатков цитозина в ДНК. 149
2.8.1. Метилчувствительная ПЦР. 150
2.8.2. Метилспецифичная ПЦР. 151
2.8.3. Комбинированный бисульфитно-рестрикционный анализ. 152
2.9. Массовое параллельное секвенирование ДНК/РНК. 152
2.9.1. NGS секвенирование на приборе «Ion Torrent». 152
2.9.1.1. Создание ДНК-библиотек протяженных фрагментов ДНК методом «удлиняющей» ПЦР.
2.9.1.2. Создание библиотек микроРНК. 157
2.9.1.3. Эмульсионная ПЦР. 160
2.9.1.4. «Обогащение» микросфер. 160
2.9.1.5. Секвенирование на микрочипах. 162
2.9.1.6. Анализ полученных данных. 165
2.9.2. NGS секвенирование на приборе «GS Junior». 165
2.9.2.1. Создание ДНК-библиотек. 165
2.9.2.2. Подготовка библиотек для секвенирования 165
2.9.2.3. Секвенирование на микрочипах. 166
2.9.2.4. Анализ полученных данных. 166
2.9.3. Обработка полученных данных. 166
2.10. Построение ассоциативных сетей. 167
2.11. Статистическая обработка данных. 170 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 172
3.1. Разработка биочип-тест-систем для анализа генетического 172
полиморфизма.
3.1.1. Система свертывания крови – «Фибр-биочип». 172
3.1.1.1. Выбор генов и полиморфных вариантов. 172
3.1.1.2. Схема микрочипа. 172
3.1.1.3. Анализ контрольных и диагностических образцов. 174
3.1.2. Заключение. 174
3.2. Исследование генов-кандидатов и поиск новых генетических маркеров гестоза, артериальной гипертензии и ожирения с метаболическим синдромом.
3.2.1. Наследственные маркеры гестоза. 175
3.2.1.1. Молекулярно-генетические маркеры гестоза. 175
3.2.1.1.1. Частоты аллелей и их комбинаций по 16 генам-кандидатам у 175
женщин с гестозом, в группе сравнения и у доноров.
3.2.1.1.2. Сравнительный анализ частот аллелей и их комбинаций 179
генов-регуляторов артериального давления, свертывания крови и
липидного обмена у женщин с гестозом, в контрольной группе
беременных и у доноров.
3.2.1.1.3. Анализ ассоциации изученных аллелей с показателями 187
артериального давления и концентрацией белка в моче у женщин с гестозом.
3.2.1.1.4. Математические модели риска гестоза. 191
3.2.1.1.4.1. «Бальный» подход. 191
3.2.1.1.4.2. Метод MDR. 193
3.2.1.1.4.3. GLM модель. 196
3.2.1.1.4.4. Эффективность предсказания фенотипа при совместном учете генетических и клинических показателей (ROC-анализ).
3.2.1.2. Поиск новых генетических маркеров. 201
3.2.1.2.1. Генная сеть гестоза. 201
3.2.1.2.1.1. Реконструкция первичной генной сети гестоза. Гестозосома.
3.2.1.2.1.2. Реконструкция первичных ассоциативных сетей молекулярных механизмов, общих для гестоза, сахарного диабета, ожирения и диабета беременных.
3.2.1.2.1.3. Реконструкция ассоциативных связей гестоза, сахарного диабета, ожирения и диабета беременных с помощью программ «ANDSystem» и «STRING».
3.2.1.2.1.4. Анализ сверхпредставленности биологических процессов. 212
3.2.1.2.1.5. Реконструкция ассоциативных сетей гестоза, сахарного диабета, ожирения и диабета беременных на основании данных сверхпредставленности биологических процессов.
3.2.1.2.2. Секвенирование гена ACVR2A у женщин с гестозом и у женщин с физиологической беременностью.
3.2.1.2.2.1. Поиск клинически значимых нуклеотидных замен в гене ACVR2A у женщин с гестозом.
3.2.1.2.2.2. Анализ корреляции комбинаций аллелей гена ACVR2A с показателями САД, ДАД, и концентрацией белка в моче беременных женщин с гестозом.
3.2.1.2.2.3. Анализ ассоциации комбинаций аллелей гена ACVR2A с наличием отеков, сопутствующих патологий и тяжестью манифестации заболевания у беременных женщин с гестозом
3.2.1.2.2.4. Сравнительный анализ результатов секвенирования гена 224 ACVR2A у женщин с гестозом и в контрольной группе.
3.2.1.2.3. Сравнительный анализ уровня микроРНК в плаценте у 228 больных гестозом и при нормальной беременности.
3.2.1.2.4. Исследование метилирования промоторных регионов гена 234 H19 в плаценте при гестозе и в контроле.
3.2.1.3. Заключение. 237
3.2.2. Наследственные маркеры артериальной гипертензии и метаболического синдрома с ожирением у детей.
3.2.2.1. Изучение молекулярно-генетических маркеров у детей с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
3.2.2.1.1. Исследование частот аллелей генов и их комбинаций с использованием «Кардио-биочипа» и методом ПЦР-ПДРФ.
3.2.2.1.2. Сравнительный анализ частот аллелей генов и их 241
комбинаций, вовлеченных в регуляцию артериального давления.
3.2.2.1.3. Анализ ассоциации показателей ИМТ, САД, ДАД и вариантов генов у детей с артериальной гипертензией.
3.2.2.1.4. Анализ ассоциации ИМТ, САД, ДАД и вариантов генов у детей с метаболическим синдромом и ожирением.
3.2.2.1.5. Создание математических моделей риска артериальной гипертензии и метаболического синдрома с ожирением.
3.2.2.1.5.1. «Бальная» оценка риска артериальной гипертензии. 262
3.2.2.1.5.2. «Бальная» оценка риска метаболического синдрома и ожирения.
3.2.2.1.5.3. MDR подход для оценки риска артериальной гипертензии. 263
3.2.2.1.5.4. MDR подход для оценки риска метаболического синдрома 273 и ожирения.
3.2.2.1.5.5. GLM модель для оценки риска артериальной гипертензии. 282
3.2.2.1.5.6. GLM модель для оценки риска метаболического синдрома и ожирения.
3.2.2.1.5.7. Эффективность предсказания фенотипа на основании генетических и клинических показателей (ROC-анализ).
3.2.2.2. Поиск новых генетических маркеров артериальной гипертензии и метаболического синдрома и ожирения.
3.2.2.2.1. Реконструкция первичной генной сети артериальной гипертензии и метаболического синдрома и ожирения.
3.2.2.2.2. Исследование аллельных вариантов генов CDH13 (rs11646213 A/T), MTHFR (rs17367504 A/G), CDKN2/BAS (rs4977574 A/G), а также маркера (rs11191548 T/C) в качестве кандидатов риска гипертонии.
3.2.2.3. Заключение. 303
ГЛАВА 4 Обсуждение 305
4.1. Оценка преимуществ метода гибридизации на биочипах для изучения генетического полиморфизма человека.
4.1.1. Сравнение метода гибридизации на биочипах с классическими методами анализа.
4.1.2. Перспективы использования «Фибр-биочипа». 307
4.1.3. Сравнение «биочиповых» технологий с методами полногеномного секвенирования.
4.1.4. Перспективы биочипов «низкой плотности». 309
4.2. Оценка роли генетических маркеров в развитии 310
мультифакторных заболеваний.
4.2.1. Вклад однонуклеотидных замен. 311
4.2.1.1. Оценка эффективности ассоциативных исследований геновкандидатов.
4.2.1.1.1. Риск гестоза. 311
4.2.1.1.2. Риск артериальной гипертензии и метаболического синдрома и ожирения.
4.2.1.2. Эффективность полногеномного скрининга для оценки риска артериальной гипертензии у детей.
4.2.1.3. Корреляционный анализ генетических и клинических показателей.
4.2.1.4. Оценка риска гестоза, артериальной гипертензии, а также метаболического синдрома с ожирением с помощью математических моделей.
4.2.1.4.1. Анализ «суммы баллов комбинации аллелей». 321
4.2.1.4.2. Метод множественного снижения размерности. 321
4.2.1.4.3. Линейная модель. 322
4.2.1.4.4. Заключение. 324
4.2.2. Поиск новых маркеров риска мультифакторных заболеваний . 326
4.2.2.1. Вклад генных сетей в идентификацию новых биомаркеров. 326
4.2.2.1.1. Анализ ассоциативной сети гестоза. 326
4.2.1.1.2. Анализ ассоциативной сети артериальной гипертензии, метаболического синдрома и ожирения.
4.2.1.1.3. Недостатки и преимущества биоинформатических исследований с помощью генных сетей для изучения наследственной предрасположенности к мультифакторным заболеваниям.
4.2.2.2. Вклад полногеномного секвенирования гена для оценки риска 10 гестоза.
4.2.2.3. Оценка уровня микроРНК для предсказания риска развития гестоза.
4.2.2.4. Использование эпигенетических маркеров для оценки риска развития гестоза.
Заключение. 348
Выводы. 356
Практические рекомендации. 358
Список литературы
- Наследственная составляющая мультифакторных заболеваний
- Генетика количественных признаков и оценка риска мультифакторных заболеваний
- Поиск клинически значимых нуклеотидных замен в гене ACVR2A у женщин с гестозом.
- Поиск новых маркеров риска мультифакторных заболеваний
Наследственная составляющая мультифакторных заболеваний
Генетический полиморфизм в 95% случаев связан с однонуклеотидными заменами – SNP (от англ. single nucleotide polymorphism). SNP-полиморфизм, как правило, биаллельный. Частота SNP в популяции определяется частотой минорной аллели. На сегодняшний день известно более 9 млн. SNPs (O Donnell, Nabel, 2011; Zeller et al., 2012). Наиболее важной особенностью этих замен является то, что некоторые из них ассоциированы с наследственной предрасположенностью человека к тому или иному заболеванию. Поэтому проблема генетического полиморфизма ДНК является одной из актуальных в современной медицинской генетике. Количество исследований, связанных с анализом генетической предрасположенности быстро увеличивается. Особенно большее число работ в данной области сосредоточено на изучении сердечно-42 сосудистых заболеваний (Пузырев, 2003, 2008; Глотов, 2007; Баранов и др., 2009).
В последние 5-7 лет в научном сообществе активно обсуждается проблема «недостающей наследуемости» (Баранов, 2010, 2011, Пузырев 2012). Она связана с несоответствием результатов генетического тестирования с реальным фенотипом количественных признаков или с конкретным МФЗ. Причины «недостающей наследуемости» могут быть следующие (по Баранов, Баранова, 2012): - незначительный вклад в величину риска отдельных аллелей генов кандидатов; - трудности с оценкой вклада в патогенез МФЗ ген-генных взаимодействий (эффект эпистаза), эпигенетических изменений генома; - непонятное функциональное значение SNP, расположенных вне генов или белоккодирующих частей генома, но достоверно сцепленных с МФЗ; - недооценка повреждающего эффекта экзогенных факторов. Провести границу между вкладом экзогенных и эндогенных факторов в патогенез МФЗ крайне сложно, так как экспрессия генов регулируется как наследственными факторами, так и факторами окружающей среды. Даже незначительные изменения в сайтах сплайсинга некодирующих РНК, а также «прямое» воздействие факторов транскрипции могут изменить экспрессию генов.
Анализ экспрессии генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний уже используют для прогноза риска ишемической болезни сердца ИБС при первых симптомах сердечной недостаточности. Также известно, что высокий уровень экспрессии генов «воспаления» позволяет прогнозировать высокий индекс массы тела (ИМТ) (Schnabel et al., 2012). Основным механизмом эпигенетической модификация ДНК является её метилирование, в результате которого происходит присоединение метильной группы к 5 положению остатков цитозина в динуклеотиде 5 -CpG 3 . Важнейшей функцией метилирования ДНК у позвоночных является подавление экспрессии генов – метилированный цитозин является маркером репрессированного хроматина. Метилирование может влиять на продолжительность клеточного цикла и дифференцировку эндотелиальных и гладкомышечных клеток сердца и сосудов (Schnabel et al., 2012). Важно отметить, что регуляция генетической активности посредством изменения структуры хроматина носит многоуровневый характер (Driel et al., 2003). Так, в зависимости от особенностей нуклеотидного состава, компактизации и набора эпигенетических маркеров, протяженные участки хроматина могут иметь статус, способствующий или, наоборот, «запрещающий» работу расположенных в них генов (Dillon, 2006). В то же время метилирование отдельных остатков цитозина или присоединение всего нескольких ацетильных групп к гистоновым белкам в промоторной области гена может соответственно, либо блокировать, либо активировать его экспрессию.
Метилирование ДНК напрямую коррелирует с концентрацией фолиевой кислоты. Ее недостаток в пренатальном периоде является фактором риска аномалий развития и раличной врожденной патологии, в том числе дефектор заращения нервной трубки (ДЗНТ) и даже раннего атеросклероза (Schnabel et al., 2012). Поэтому гены, контролирующие метаболизм фолиевой кислоты, и их варианты играют существенную роль в кардиопатологиях, обусловленных эпигенетическими нарушениями (Schnabel et al., 2012). К таким генам относят ген метелентетрагидрофолат редуктазы, метеонинсинтаз редуктазы и некоторые другие (Баранов, 2009).
Генетика количественных признаков и оценка риска мультифакторных заболеваний
Основной характеристикой любого организма является его геном, то есть наследственный аппарат клетки, её ДНК. Считается, что только около 2% ДНК кодирует гены, которые определяют структуру всех белков организма человека. Совокупнось этих генов составляет генотип (Инге-Вечтомов, 2010). Последний, взаимодействуя с внешней средой, формирует фенотип - совокупность всех признаков организма, как внешних, так и внутренних, включая особенности строения и функции клеток, тканей, органов, и различных систем (Инге-Вечтомов, 2010). Каждый ген проявляется в виде доминантного или рецессивного признака. Альтернативные выражения такого элементарного признака определяют различные аллели одного гена. Таким образом, именно аллели характеризуют реальное состояние гена (Инге-Вечтомов, 2010). Чаще всего аллели взаимодействуют по типу доминирования, где доминатным признаком, например, в случае ферментативной активности, является ее присутствие над ее отсутствием. Известны случаи отсутствия доминантно-рецессивных отношений, а именно, явление кодоминирования (когда обе аллели проявляются одинако). Кроме того, в ряде случаев встречается особый тип взаимодействия - по типу межаллельной комплементации, когда взаимодействие двух «дефектных» аллелей ведет к восстановлению ферментативной активности (Инге-Вечтомов, 2010).
Однако в большинстве случаях при изучении наследования многих признаков, особенно сложных, а также при МФЗ, фенотипические проявления зависят не столько от состояния аллелей, сколько от взаимодействия продуктов многих разных генов. Принято различать три типы межгенных взаимодействий: комплементарность, эпистаз и полимерия (Инге-Вечтомов, 2010). Комплементарным считают взаимодействие генов, которое обуславливает развитие нового признака. При этом доминантные аллели обоих генов сохраняют нормальный фенотип. При эпистатическом взаимодействии неаллельных генов наблюдаеся подавления проявления генов одной аллельной пары генами другой - генами супрессорами, которые могут быть как доминантными, так и рецессивными. Не редко при эпистатических взаимодействиях нарушения функции, связанные с мутациями одного гена как бы подменяются, компенсируются работой другого, неаллельного гена. Принимая во внимание особенно важную роль, которую отводят эпистазу в генезе МФЗ (Кучер, 2010, 2015), мы вернемся к его рассмотрению в следующем разделе (п. 1.4.2). В варианте полимерии разные аллели дублируют действие друг друга (Инге-Вечтомов, 2010). Приведенные варианты отнюдь не исчерпывают всего многообразия межгеных взаимодействий. Существуют взаимодействие с участием генов-модификаторов, когда наряду с «основным» геном, определяющим признак, существует ряд других генов, которые его модифицируют. Хорошо известно так же и явление плейотропии, когда один ген определяет развитие многих признаков (Инге-Вечтомов, 2010).
При изучении процессов реализации наследственной информации важно учитывать не только действие самих генов, их аллелей и межгенные взаимодействия, но и модифицирующее влияние среды, которое зачастую оказывает решающую роль на пенетрантность и экспрессивность количественно признака в рамках нормы реакции.
Принимая во внимание, что живой организм представляет собой сложную иерархию биологических уровней и систем (Bertalanfy, 1962), основу которой составляет геном, предсказание особенностей сложного фенотипа, в том числе риска МФЗ только по анализу аллельных вариантов генов едва ли возможно. Более объекивная информация о количественных признаках и МФЗ может быть получена только при системном походе, то есть при изучении особенностей реализации генетической информации в развитии. Именно такой принцип положен в основу системной генетики, а в отношении к МФЗ - патогенетики (Баранов, Баранова, 2012; Пузырев, 2014). Его реализация на практике требует широкого использования не только больших возможностей молекулярной генеики, но также биоинформатики, новых статистических методов и математического моделирования.
Понятие эпистаз впервые ввел в начале XX века В.Бейтсон для объяснения отклонения от менделеевского наследования (Bush, Moore, 2012). Другое понимание эпистаза было введено Фишером для обозначения отклонений от аддитивности в линейной модели, описывающей влияние генотипа на фенотип (Phillips, 2008). В настоящее время различают три вида эпистаза (Phillips, 2008). Функциональный эпистаз адресуется к физическим взаимодействиям, когда белки взаимодействуют друг с другом внутри одного метаболического пути. Композиционный эпистаз подразумевающий блокирование проявления аллеля одного локуса другим (см. выше). Статистический эпистаз используется в фишеровском смысле, в котором среднее отклонение комбинаций аллелей разных локусов оценивается по всем другим генотипам, представленным в популяции (Phillips, 2008).
Считается, что биологическую основу эпистаза составляет взаимодействие между белковыми продуктами нескольких генов одной генной сети. Как итог, фенотип зависит не от одного, а от многих функционально сопряженных генов (Moore, Williams, 2009). Предполагается, что феномен эпистаза составляет патогенетическую основу многих распростренных МФЗ (Кучер, 2010, 2015). Для объяснения эпистаза используют идею канализации морфогенетических процессов, предложенную еще Конрадом Уодингтоном в 1946г. и получившую дальнейшее развитие в эволюционной теории (Moore, Williams, 2009). Согласно данной теории, эпистаз является вариантом стабилизирующего отбора и позволяет системе оставаться на некотором постоянном уровне, несмотря на внешние воздействия и внутренние возмущения. Эволюция нацелена на сохранение баланса функций жизненно важных систем, таким как артериальное давление, уровень глюкозы, кислотность крови и многие другие.
Поиск клинически значимых нуклеотидных замен в гене ACVR2A у женщин с гестозом.
На сегодняшний день GWAS исследования несколько консорциумов выполнены исключительно на взросых больных с АГ (Wang et al., 2011; Johnson et al., 2011; International Consortium for Blood Pressure Genome-Wide Association Studies, 2011; Delles, Padmanabhan, 2012).
Одно из первых подобных крупных исследований было проведено в 2007 в Англии (WTCCC- Wellcome Trust Case Control Consortium, 2007). Его итогом явились обнаружение двух значимых SNP, один и которых (rs7591163 гена CCL20) ассоциирован с повышенным диастолическим давлением, а второй (rs3096277 гена кадхерина 13 (CDH13) - с повышенным систолическим артериальным давлением - САД (Levy, 2007, 2009). Значимость исследования полиморфизма по гену CDH13 была подтверждена и в других исследованиях (Org, 2009). Однако в них с повышением САД был сцеплен другой маркер этого гена - rs11646213.
Крупное GWAS исследование, выполненное в 2009 году, выявило ассоциацию SNP в генах NT5C2 и MTHFR с повышенным САД (Newton-Cheh, 2009). Позже значимость полиморфизма по гену MTHFR была подтверждена в других работах (Johnson et al., 2011; Delles, Padmanabhan, 2012).
Важно отметить, что при исследовании методом GWAS получают не только ложноположительные, но и ложноотрицательные результаты, когда ранее «установленные» маркеры, не подтверждаются повторным GWAS-анализом. Причину этого связывают с тем, что очень многие индивидуумы из различных популяционных групп (которых включают в одно исследование) принимают антигипертонические лекарства, которые изменяют реальные значения показателей АД, что затрудняет корректную выборку опытных и контрольных когорт обследуемых индивидов (Johnson et al., 2011; Delles, Padmanabhan, 2012).
Для поиска локусов, ответственных за повышенное артериальное давление, используют так же и другие методы, в частности, «целевое» секвенирование участков генома (см. раздел 1.3.3). Такой подход показал, что из 64 пациентов с АГ только три имели «функциональную мутацию» в одном из трех секвенированных генов: NCCT, NKCC2 или ROMK (O Donnell, Nabel, 2011).
В настоящее время ожирение относится к числу самых распространенных заболеваний в мире. По мере увеличения его частоты множатся и усугубляются связанные с ним тяжелые соматические патологии: СД 2 типа, АГ, ишемическая болезнь сердца (ИБС) и другие, приводящие к ухудшению качества жизни, ранней потере трудоспособности и к преждевременной смерти (Дедов, Мельниченко, 2004; Сорвачева и др., 2006; Ройтберг, 2007; Zimmet et al., 2007). По данным ВОЗ (2004), избыточная масса тела или ожирение зарегистрированы у 1,7 млрд. человек, т. е. приблизительно у 30% жителей планеты (Сорвачева и др., 2006).
В последние десятилетия ученые и клиницисты стали рассматривать различные метаболические нарушения и заболевания, ассоциированные с ожирением, в комплексе, который получил название «метаболический синдром» (МС) (Дедов, Мельниченко, 2004; Ройтберг, 2007; Болотова и др., 2007). В настоящее время МС понимают, как сочетание различных метаболических нарушений и/или заболеваний, являющихся факторами риска развития атеросклероза и его сердечно-сосудистых осложнений (Дедов, Мельниченко, 2004). Ранее считалось, что МС встречается только у людей среднего и пожилого возраста. Однако, проведенные под эгидой Американской ассоциации диабетологов исследования свидетельствуют о том, что это заболевание все чаще формируется в детском и подростковом возрасте. Так, по данным из Университета Дж. Вашингтона (Сиэттл), в период с 1994 по 2004 гг. частота МС среди подростков возросла с 4,2% до 6,4% (Болотова и др., 2007; Чазова и др., 2010). Установлено, что почти 30% подростков с избыточной массой тела в Соединённых Штатах Америки соответствуют критериям МС (Cook et al., 2003).
В настоящее время в России отмечается неуклонный рост заболеваемости ожирением и связанных с ним осложнений среди детей и подростков, с ежегодным приростом не менее 1–2% (Сорвачева и др., 2006; Болотова и др., 2007). Известно, что около 90% всех случаев избыточной жировой массы тела и формирования МС берут начало в детском возрасте, нередко в раннем его периоде (Балыкова и др., 2010).
Избыточное питание, большая скорость роста и прибавки массы тела на первом году жизни также являются факторами риска развития ожирения и, как следствие, МС в старшем возрасте. Исследование, проведенное в США, включавшее 28000 новорожденных детей, подтвердило, что высокая прибавка массы тела в первые 6 месяцев достоверно увеличивает риск ожирения у детей в возрасте 7 лет (Нетребко, 2006).
На сегодняшний день роль наследственности в генезе ожирения и метаболического синдрома (МС) не вызывает сомнений (Седлецкий, 2007). Известно, что риск ожирения у ребенка достигает 80%, если оно имеется у обоих родителей. Он составляет около 50%, если ожирением страдает только мать, около 40% - при ожирении у отца, и примерно, 7–9% - при отсутствии ожирения у родителей (Миняйлова, 2001). C помощью близнецовых исследований установлено, что величина индекса массы тел (ИМТ), который является наиболее объективным показателем ожирения, на 40–70% определяется генетическими особенностями человека (Willer et al., 2008).
Поиск новых маркеров риска мультифакторных заболеваний
Анализ нуклеотидных вариаций проведили путем выравнивания нуклеотидных последовательностей против референсного генома hg19 (Genome Reference Consortium GRCh37) (Lander et al., 2001), используя программное средство bwa (Li et al., 2010), в результате чего были получены файлы в формате BAM. Дублирующие чтения были удалены с помощью samtools (Li et al., 2009). Предварительную обработку результатов секвенирования проводили, используя программу для анализа нуклеотидных последовательностей (http://www.ugene.unipro.ru) - «UGENE» (Okonechnikov et al., 2012) и базу данных Ensembl (http://www.ensembl.org). Далее поиск вариантов проводили с помощью программного средства FreeBayes (Garrison et al., 2012), при этом поиск осуществлялся совместно по всем образцам, и был составлен единый «vcf» файл (Danecek et al., 2011), включающий информацию обо всех выявленных вариантах. Аннотирование и «фильтрацию» вариантов осуществляли с помощью ресурса wANNOVAR (Wang et al., 2010; Chang et al., 2012) и интернет-ресурса «Genealk» (http://www.genealk.de). Статистические рассчеты проводили, используя PLINK (Purcell et al., 2007) и SnpSift (Cingolani et al., 2012). Функциональную значимость выявленных замен проводили с помощью ресурсов Polyphen2 (Kumar et al., 2009) и SIFT (Adzhubei et al., 2010). Анализ уровня микроРНК проводили, используя алгоритм CAP-miRSeq (Sun et al., 2014). В соответствии с этим выполняли следующие шаги: «обрезка» нуклеотидов низкого качества с 3 конца; «обрезка» адаптеров с использованием программы «cutadapt» (Chen et al., 2014), удаление «чтений», длина которых после «обрезки» составляет менее 17 нуклеотидов. После риды картировали и соотносили с базой данных микроРНК (http://www.mirbase.org) - «miRBase» (Kozomara, Griffiths-Jones, 2011). Частоту встречаемости обнаруженных микроРНК оценивали с помощью протокола miRDeep2 (Friedlander et al., 2012). Анализ дифференциальной экспрессии между двумя группами образцов с различными фенотипами проводится с помощью пакета edgeR» (Robinson et al., 2010). Предварительно для каждого образца осуществляется нормализация значений экспрессии относительно суммарного значения уровня микроРНК в образце. Статистически значимые отличия в уровне микроРНК принимали при p меньше 0,01. Коррекцию p-значений при множественных сравнениях проводили с помощью алгоритма FDR по методу Беньямини-Хохберга (Benjamini, Hochberg, 1995). Поиск генов - мишеней для найденных микроРНК осуществляли по базе данных для мишеней и экспрессии генов (http://www.microrna.org/microrna/home.do) - «miRanda» (John et al., 2004). Для идентификации ассоциированных с микроРНК заболеваний использовали базу данных «miR2Disease» (http://www.mir2disease.org) (Jiang et al., 2009).
Для построения ассоциативных сетей использовали компьютерную систему «ANDSystem» (Demenkov et al, 2012) и «STRING» (Franceschini et al., 2013). Рассматривали следующие типы взаимоотношений: - физические взаимодействия между белками, белками и низкомолекулярными соединениями, белками и ДНК и др.; - биохимические процессы и реакции; - регуляция экспрессии генов, а также регуляция стабильности и активности белков; - ассоциативные связи между белками, генами, низкомолекулярными соединениями и заболеваниями.
Ассоциативные сети для рассматриваемых пар заболеваний представляли собой графы, вершинами которых являлись заболевания и белки/гены, а рёбрами - ассоциации между заболеваниями и белками. Всего в базе знаний «ANDCell» приведено 4075 заболеваний, из них 991 не ассоциированы ни с одним из белков человека. Такие заболевания были исключены из анализа. Визуализацию ассоциативных сетей осуществляли с помощью программы «ANDVisio».
Расчёт «связности» ассоциативных сетей для пары заболеваний проводили по следующим индексам: (1) 1АВ=\АглВ\, равный размеру пересечения множеств белков А и В, состоящему из белков, одновременно ассоциированных с заболеваниями DA и DB; (2) «Jaccard index» (Jaccard, 1912), расчитывался как отношение їм к объединению множеств А и В, включающему белки, ассоциированные хотя бы с одним из заболеваний DA и D B , JAB = ІАВ ; (3) «Meet/Min» (Goldberg, Roth, 2003) рассчитывался как \A B\ M.„= , где выражение в знаменателе означает размер min( А , В ) минимального из множеств А и В. Оценка статистической значимости степени связности анализируемых пар заболеваний в ассоциативных сетях проводилась путём сравнения этих сетей с ассоциативными сетями случайно выбранных заболеваний.