Содержание к диссертации
Введение
1. История, современное состояние и методы изучения медоносной пчелы 19
1.1. Внутривидовое таксономическое разнообразие медоносной пчелы 19
1.2. Микроэволюция медоносной пчелы и возникновение подвидов 32
1.3. Значение пчел для сельского хозяйства и окружающей среды 41
1.4. Внутривидовая гибридизации и идентификация подвидов A. mellifera
1.4.1. Полиморфизм морфологических параметров 51
1.4.2. Полиморфизм аллозимных локусов 55
1.4.3. Полиморфизм митохондриальной ДHK 59
1.4.4. Полиморфизм микросателлитных локусов 65
1.4.5. Однонуклеотидный полиморфизм ДHK 68
1.5. Сохранившиеся популяции подвидов медоносной пчелы и их охрана 72
2. Материалы и методы 82
2.1. Особенности биологии и структура генома медоносной пчелы 82
2.2. Объем выборки и локализация популяций 90
2.3. Полимеразная цепная реакция и ДHK маркеры 109
2.4. Статистический анализ полученных результатов 119
3. Результаты и обсуждение 121
3.1. Дифференциация представителей пчел эволюционной ветви М на основе анализа полиморфизма нуклеотидной последовательности локуса COI-COII мтДHK 121
3.2. Филогенетический анализ подвидов A. mellifera на основе полиморфизма нуклеотидной последовательности гена ND2 мтДHK 135
3.3. Филогенетический анализ подвидов A. mellifera на основе полиморфизма нуклеотидной последовательности гена вителлогенина VG яДHK 162
3.4. Анализ интрогрессии “южных” генов в популяции темной лесной пчелы Урала и Поволжья 3.5. Генетические характеристики популяции темной лесной пчелы Урала и Поволжья 181
3.6. Генетические характеристики и адаптированность семей темной лесной пчелы бурзянской популяции 196
Заключение 214
Выводы 218
Практические рекомендации 220
Список литературы 222
- Значение пчел для сельского хозяйства и окружающей среды
- Сохранившиеся популяции подвидов медоносной пчелы и их охрана
- Полимеразная цепная реакция и ДHK маркеры
- Филогенетический анализ подвидов A. mellifera на основе полиморфизма нуклеотидной последовательности гена вителлогенина VG яДHK
Введение к работе
Актуальность и степень разработанности темы. Семейство пчел Apidae подотряда Стебельчатобрюхие Apocrita отряда Перепончатокрылые Hymenoptera Linnaeus, 1758 включает около 30 триб, 170 родов и 5000 видов (Michener, 1990; 2000). Самыми известными представителями семейства Apidae являются такие виды, как медоносная пчела Apis mellifera, восковая пчела Apis cerana и земляной шмель Bombus terrestris (Радченко, Песенко, 1994; Michener, 2007).
Медоносные пчелы - самые активные опылители на планете. Результаты этой деятельности намного превосходят медовую продуктивность. В Европейских странах пчел разводят преимущественно для опыления сельскохозяйственных культур, а продукцию пчеловодства получают в нагрузку (Важов, Панков, 2009; Gallai et al., 2009). Так, в Великобритании некоторые экологи даже хотели бы избавиться от пчел, которые, по их мнению, оккупировали их острова и могут вытеснить аборигенных опылителей -шмелей. То есть британцы не рассматривают пчел как источник меда, а только как опылителей культур.
Пчелы играют важную роль в сохранении природных экосистем, поскольку опыляют 85% цветковых растений - около 300 тыс. видов во всем мире. От их деятельности зависит биоразнообразие природных экосистем (Кривцов, 2008; Neumann, Carreck, 2010). Особо сильно от опыления пчелами зависят природные экосистемы северных регионов Евразии, где естественное таксономическое разнообразие насекомых-опылителей в природе резко ограничено низкими температурами (Schafer et al., 2009; van Engelsdorp, 2009; Genersch, 2010). Большая часть России располагается в северных регионах Евразии с преобладанием зон рискованного пчеловодства. Сохранение численности семей пчел в северных регионах Евразии и в России необходимо для поддержания уровня биоразнообразия экосистем (Лебедев и др., 2015).
Как известно, из всех 30 подвидов пчел только A. m. mellifera, именуемый темной лесной пчелой, эволюционировал в Северной Европе и потому пригоден к разведению в данных регионах Евразии. Потеря чистопородности генофонда этого единственного северного подвида в связи с таким низким таксономическим разнообразием в северных регионах может стать критическим как для людей, так и всей экосистемы в целом (Радченко, Песенко, 1994).
В России прослеживается тенденция снижения численности семей пчел. С 1965 г. общая численность пчел в стране сократилась вдвое и в 2015 г. составляла 3.5 млн. семей, сосредоточенных, преимущественно, в частных хозяйствах 77 регионов. Разброс количества семей пчел в регионах очень высок: в Мурманской области - 18 семей, а в Республике Башкортостан - 365 тыс. (Кривцов, 2011; Лебедев и др., 2015).
В России закрепилась другая тенденция хозяйствования - пчел в основном разводят для получения продуктов, а опылительную деятельность не учитывают и не оценивают. Потому численность семей пчел здесь в постоянной зависимости от рыночной стоимости продуктов отрасли. Так,
снижение цен на 30% на продукцию пчеловодства в 2012-2013гг. обернулась не только снижением рентабельности пасек, но в ряде случаев они стали убыточными (Кривцов, 2011; Лебедев и др., 2013).
Имеется и другая тенденция повышения продуктивности семей пчел за счет улучшения качества их содержания. Так, с 1995 г. по 2015 г. средняя продуктивность одной семьи пчел в России возросла вдвое. В настоящее время медовая продуктивность в стране составляет около 5 млн. т. Следовательно, рост продуктивности пчеловодства в России еще не является показателем увеличения числа семей пчел (Лебедев и др., 2014).
Первая причина сокращения численности семей пчел в России - снижение рентабельности отрасли в результате социально-экономического положения страны; вторая - повышенный уровень смертности под влиянием болезней и загрязнения окружающей среды; третья - потеря чистопородности аборигенного генофонда вследствие гибридизации с интродуцированными “южными” подвидами (Ильясов и др., 2015а; Лебедев и др., 2015).
В результате массовых экспериментов по повышению продуктивности семей пчел и создания искусственных высокопродуктивных гибридных пчел в Европейских странах и России, за минувший век произошло резкое сокращение местного чистопородного генофонда A. m. mellifera (Ильясов и др., 2007б). Как выяснилось, пчела никогда не являлась полностью одомашненным видом, потому контролировать ее генофонд человеком было практически невозможно (Jensen et al., 2005). “Южные” гены интродуцированных подвидов пчел быстро и беспрепятственно получали широкое распространение и закрепление в популяциях местных пчел (Maul, Hhnle, 1994).
Аборигенный чистопородный генофонд темной лесной пчелы имеет шансы на сохранение в редких изолированных регионах, таких как острова, горные ущелья и местности без развитой транспортной инфраструктуры. Такие территории были обнаружены в Европе (острова Британии, Франции, Голландии, Дании, Норвегии) и в России (Алтай, Урал и Поволжье) (Ivanova et al., 2007; Ильясов и др., 2007а).
Первоначальные исследования полиморфизма морфологических
параметров, аллозимных локусов и локусов мтДНК не позволили получить
однозначных выводов о структуре и ареале генофонда сохранившихся изолятов
темной лесной пчелы. Оказалось, что в условиях интенсивной гибридизации
морфологический полиморфизм не позволяет дифференцировать подвиды пчел.
Аллозимный полиморфизм в популяциях пчел показал очень низкую
вариабельность, а также оказался непригодным для дифференциации подвидов.
Кроме того, аллозимные локусы и морфологические параметры не являлись
селективно нейтральными маркерами, были подвержены действию
естественного отбора и клинальной изменчивости. Митохондриальные же локусы оказались более информативными, но показывали только материнскую наследственность, не позволяя получить достоверные данные о структуре генофонда (Ильясов и др., 2007б; Muoz et al., 2009).
Корректную оценку структуры генофонда и ареала сохранившихся изолятов темной лесной пчелы позволяют провести микросателлитные локусы
яДНК в случае использования в анализе достаточного числа локусов. Анализ популяций пчел на основе полиморфизма ядерных и митохондриальных локусов способствует получению более полных данных о структуре генофонда и филогенетическом положении, поскольку охватывает как материнский, так и отцовский типы наследственности (Ильясов, 2006; Зиновьева и др., 2011).
Таким образом, пчелы играют исключительную роль в поддержании биологического и таксономического разнообразия природных и антропогенных экосистем в результате опылительной деятельности, а также в обеспечении человека пищей и биологически активными и лекарственными веществами (Pinto et al., 2012).
Экосистемы северных регионов России, а также Урала и Поволжья особенно сильно зависят от опылительной деятельности пчел. Пчела подвида A. m. mellifera является аборигенной для этого региона, максимально приспособленной к местным условиям и экономически выгодной для разведения в этих условиях.
Угроза потери генофонда A. m. mellifera, в первую очередь, обусловлена гибридизацией с подвидами из южных регионов России в результате их массовой интродукции. Сохранение генофонда местных пчел становится возможным только при наличии методов, дифференцирующих подвиды (Oleksa et al., 2011; Nedi et al., 2014). Отсюда идентификация сохранившихся популяций и селекция семей темной лесной пчелы в условиях массовой гибридизации становятся актуальными (Форнара, 2012; Ильясов и др., 2015б).
Большой интерес для пчеловодства представляет ареал подвида
A. m. mellifera на территории Урала и Поволжья, который частично изучен
морфометрическими и практически не изучен молекулярно-генетическими
методами. Морфометрические методы исследования предполагают
возможность сохранения популяций темной лесной пчелы в этом регионе. Для точной оценки современного состояния темной лесной пчелы Урала и Поволжья необходимо провести молекулярно-генетические исследования с использованием маркеров ядерной и митохондриальной ДНК. Исходя из этого, нами была поставлена следующая цель исследования.
Цель исследования - комплексный анализ генетической структуры популяции и филогенетического положения темной лесной пчелы Урала и Поволжья с использованием маркеров ядерной и митохондриальной ДНК.
Задачи исследования:
1. Провести анализ генетической дифференциации представителей пчел
эволюционной ветви М на основе полиморфизма нуклеотидной
последовательности локуса COI-COII мтДНК.
-
Определить информативность генов ядерной и митохондриальной ДНК медоносной пчелы A. mellifera для оценки возможности их использования в филогенетических реконструкциях на основе сравнения генов пчел 4 эволюционных ветвей А, М, С, О.
-
Провести поиск информативных SNPs ядерного и митохондриального геномов медоносной пчелы A. mellifera, позволяющих дифференцировать темную лесную пчелу A. m. mellifera от пчел “южных” подвидов A. m. carpatica
и A. m. caucasica.
4. Установить генетическое родство темной лесной пчелы A. m. mellifera
уральской и европейской популяций на основе сравнительного анализа
нуклеотидной последовательности гена VG яДНК, гена ND2 мтДНК и локуса
COI-COII мтДНК.
5. Провести поиск сохранившихся популяций темной лесной пчелы
A. m. mellifera на Урале и в Поволжье и локализовать их ареал на основе
анализа полиморфизма 9 микросателлитных локусов и локуса COI-COII
мтДНК.
-
Рассчитать генетические стандарты для семьи и популяции темной лесной пчелы A. m. mellifera Урала и Поволжья на основе анализа полиморфизма 9 микросателлитных локусов.
-
Определить уровень интрогрессии “южных” генов по ядерному и митохондриальному геномам в популяции темной лесной пчелы A. m. mellifera Урала и Поволжья на основе анализа полиморфизма 9 микросателлитных локусов яДНК и локуса COI-COII мтДНК.
8. Разработать методику селекции семей темной лесной пчелы
A. m. mellifera по генетическим показателям, рассчитанным на основе
полиморфизма 9 микросателлитных локусов яДНК.
Научная новизна. На основе сравнительного анализа нуклеотидной
последовательности локуса COI-COII мтДНК впервые предлагается
дифференциация митотипов темной лесной пчелы A. m. mellifera эволюционной ветви М. Путем сравнительного анализа нуклеотидной последовательности 7 генов (ND2, ND4, ND4L, ND5, ND6, COI, COIII) мтДНК и гена VG яДНК показана возможность дифференциации подвидов пчел. Впервые выявлены SNPs в генах ND2 мтДНК и VG яДНК, позволяющие дифференцировать темную лесную пчелу A. m. mellifera от пчел “южных” подвидов A. m. carpatica и A. m. caucasica. Подтверждено тесное генетическое родство уральской и европейских популяций темной лесной пчелы A. m. mellifera, объединяющихся в одну группу эволюционной ветви М. На территории Урала и Поволжья обнаружено пять сохранившихся популяций темной лесной пчелы A. m. mellifera: бурзянская, татышлинская, южно-прикамская, вишерская и камбарская. Определен ареал популяции темной лесной пчелы Урала и Поволжья, куда входят север Республики Башкортостан, юг Республики Удмуртия и вся территория Пермского края. Для семьи и популяции темной лесной пчелы A. m. mellifera Урала и Поволжья впервые были получены генетические стандарты. В популяции темной лесной пчелы A. m. mellifera Урала и Поволжья определен уровень интрогрессии “южных” генов по ядерному и митохондриальному геномам, а также предложена методика селекции семей темной лесной пчелы путем анализа полиморфизма 9 микросателлитных локусов яДНК.
Научно-практическая значимость. Результаты сравнительного анализа нуклеотидной последовательности локуса COI-COII мтДНК способствуют упрощению и исправлению существующей классификации митотипов темной лесной пчелы A. m. mellifera эволюционной ветви М. Выявленная высокая
информативность семи генов (ND2, ND4, ND4L, ND5, ND6, COI, COIII) мтДНК и гена VG яДНК позволит быстро и достоверно дифференцировать подвиды пчел Apis mellifera и провести филогенетический анализ. На основе обнаруженных информативных SNPs в гене ND2 мтДНК и VG яДНК появляется возможность разработать мультиплексную тест-систему для дифференциации темной лесной пчелы A. m. mellifera от пчел “южных” подвидов A. m. carpatica и A. m. caucasica.
Данные о тесном генетическом родстве уральской и европейской популяций темной лесной пчелы A. m. mellifera позволят целенаправленно подойти к решению проблемы сохранения генетического разнообразия местных пчел за счет обогащения генофонда генетическим материалом из других популяций. Выявление сохранившихся популяций темной лесной пчелы A. m. mellifera и определение их ареала дают возможность разработать мероприятия по сохранению их генофонда в пределах аборигенного распространения.
На уровне семьи и популяции генетические стандарты темной лесной пчелы Урала помогут селектировать семьи пчел в пределах данных генетических показателей и будут способствовать стабилизации генетической структуры популяции. Методика выявления интрогрессии “южных” генов по ядерному и митохондриальному геномам в семье и популяции темной лесной пчелы A. m. mellifera Урала и Поволжья позволит провести мониторинг состояния генофонда и селекцию по разработанной методике, направленную на сохранение аборигенного генофонда.
Результаты исследования могут быть использованы в популяционно-
генетических, геногеографических, филогенетических, филогеографических
исследованиях, а также в селекции семей пчел и разработке рекомендаций для
пчеловодства, направленных на повышение их продуктивности и
адаптированности.
Методы и разработки данных исследований успешно применены в природоохранной деятельности для поддержания биологического разнообразия экосистем. Разработанный метод анализа уровня интрогрессии “южных” генов в популяции темной лесной пчелы A. m. mellifera был успешно применен в заповеднике “Шульган-Таш” при мониторинге семей пчел на чистопородность местного генофонда. Данная работа может служить началом проекта по сохранению генетического разнообразия генофонда подвида A. m. mellifera в масштабе всей Евразии (Ильясов и др., 2016в).
На базе генетических исследований с использованием микросателлитных локусов яДНК и локуса COI-COII мтДНК проведен мониторинг популяций темной лесной пчелы Пермского края и основана племенная пасека “Парасоль” (Симанков и др., 2012), Республики Удмуртия - основана племенная пасека “Камбарская” (Ильясов и др., 2007в), Кировской области - племенная пасека “РАСАМ” (Брандорф и др., 2012), Республики Башкортостан - племенная пасека “Куликовская дача” (Николенко и др., 2013). Была определена таксономическая принадлежность и уровень интрогрессии “южных” генов семей пчел A. m. mellifera на племенной пасеке “Azmoos” в Швейцарии
(Ильясов и др., 2015б; 2016а).
Методология и методы исследования. Экстракцию ДНК из мышц торакса рабочих особей пчел, фиксированных в 96% этаноле, проводили набором ДНК-ЭКСТРАН-2 по протоколу СИНТОЛ (Москва) (www. syntol.ru). Качество и количество выделенной тотальной ДНК (около 500 нг) анализировали на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo, США).
Полимеразная цепная реакция выполнялась в термоциклере BIO-RAD T100 (США) в 15 мкл общего объема смеси по протоколу СИЛЕКС (Москва) (www. sileks.com/ru) с 10 нг тотальной ДНК при оптимальной температуре отжига для каждого набора праймеров. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени ПЦР-РВ проводилась с красителем SYBR Green в термоциклере Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) с набором по протоколу СИНТОЛ (Москва) (www. syntol.ru).
В исследованиях проводился анализ полиморфизма локуса COI-COII мтДНК, гена ND2 мтДНК, гена вителлогенина VG яДНК, гена дефенсина 1 DEF1 яДНК, гена абецина ABAE яДНК, гена MGST1 яДНК, микросателлитных локусов AP243, 4A110, A24, A8, A43, A113, A88, AP049, A28 яДНК.
Продукты амплификации при силе тока 40мА разделяли по размерам в 8% ПААГ, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в гель-документирующей системе DocPrint Vilber Lourmat (Франция).
Фрагментарный анализ и определение нуклеотидной последовательности продуктов ПЦР выполняли на автоматическом секвенаторе Applied Biosystem sequencer (США) по протоколу СИНТОЛ (Москва).
Анализ нуклеотидных последовательностей и их выравнивание проводилось в программе MEGA 6.0 (Kumar et al., 2004) и DNASTAR 5.05 с использованием метода Clustal W 1.6 при пороге открытия разрывов 15, пороге размера разрывов 5, значимости транзиций 0.5 и задержке разрывов расхождения 30.
Дендрограммы на основе транзиций и трансверсий выровненных нуклеотидных последовательностей строились в программах MEGA 6.0 и DNASTAR 5.05 методом ближайшего соседа с применением бутстреп анализа.
Дендрограммы на основе частот аллелей микросателлитных локусов строились с применением кластерного анализа в компьютерных программах STATISTICA 8.0 и STATGRAFICS Plus 3.0 по полученным генетическим дистанциям M. Nei (1978) и попарным значениям Fst, которые рассчитывались в программах FSTAT 2.9.3.2 (JBrYme Goudet) и POPULATIONS 1.2.28 (CNRS UPR9034).
Значения уровня интрогрессии “южных” генов эволюционной ветви C (A. m. caucasica) в семьях пчел эволюционной ветви M (A. m. mellifera) по ядерному геному, необходимые для построения гистограммы (plot), были рассчитаны на основе полиморфизма микросателлитных локусов с использованием программы STRUCTURE 2.3.4 с применением Баейсовского анализа (Bayesian analysis) и метода кластеризации Монте-Карло с цепями Маркова (Monte Carlo Markov Chain) (MCMC) при заданном числе кластеров K=2 с использованием модели смешивания (Admixture model) и параметров
MCMC (iteration) 5000 (Pritchard, 2000).
Уровень интрогрессии “южных” генов по митохондриальному геному рассчитывался на основе наблюдаемых частот фрагментов межгенного локуса COI-COII мтДНК PQQQ, PQQ (A. m. mellifera, эволюционная ветвь М) и Q (A. m. carpatica и A. m. caucasica, эволюционная ветвь С) (Garnery et al., 1993).
Статистический анализ полученных результатов полиморфизма ДНК проводился с использованием программ CHROMAS 1.45, MEGA 6.0, DNASTAR 5.05, FSTAT 2.9.3.2, GENEPOP 4.2.2, POPULATIONS 1.2.28, STRUCTURE 2.3.4, STATISTICA 8.0, STATGRAFICS Plus 3.0, MICROSOFT EXCEL 2010.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Анализ локусов ядерной и митохондриальной ДНК (9
микросателлитных локусов яДНК, локус COI-COII мтДНК) показал, что на
Урале и в Поволжье сохранился крупнейший в мире резерват темной лесной
пчелы A. m. mellifera, подразделенный на 5 популяций – бурзянскую,
татышлинскую, южно-прикамскую, вишерскую и камбарскую.
2. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности локусов
ядерной и митохондриальной ДНК (VG яДНК, ND2 мтДНК, COI-COII мтДНК)
подтвердил тесное генетическое родство европейских и российских популяций
темной лесной пчелы.
3. На основе анализа полиморфизма локусов ядерной и
митохондриальной ДНК (9 микросателлитных локусов яДНК, локус COI-COII
мтДНК) определен уровень интрогрессии “южных” генов в популяциях темной
лесной пчелы A. m. mellifera Урала и Поволжья.
4. Анализ полиморфизма 9 микросателлитных локусов ядерной ДНК
позволил получить генетические стандарты для популяций и семей темной
лесной пчелы Урала и Поволжья и разработать стратегию их селекции.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 71 научной конференции, из которых 13 за последние 5 лет: Международная научная конференция по пчеловодству “XLVIII Naukowa konferencja pszczelarska” (Pszczyana, Poland, 2011); Международная научно-практическая конференция “Современные проблемы биологии и экологии” (Махачкала, Дагестан, 2011); Всероссийская научно-практическая конференция “Мир пчел” (Ижевск, 2011); Международная научно-практическая конференция SICAMM (Landquart, Switzerland, 2012); III Международный форум пчеловодов “Медовый мир” (Ярославль, 2012); Всероссийская научная конференция “Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии” (Уфа, 2012); Всероссийская научная конференция “Современные проблемы биохимии и биотехнологии” (Уфа, 2013); Международная научно-практическая конференция “SICAMM 13th biennial and BIBBA 50th anniversary” (Llangollen, North Wales, United Kingdom, 2014); Международная 6 европейская конференция по пчеловодству “EURBEE 6” (Murcia, Spain, 2014); I Международная научно-практическая конференция, посвященная 145-летию М.А.Дернова “Проблемы и перспективы сохранения генофонда медоносных пчел в современных условиях” (Киров, 2014);
Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием
“Актуальные направления инновационного развития животноводства и
ветеринарной медицины” (Уфа, 2014); II Международная научно-практическая
конференция “Биотехнологические аспекты развития современного
пчеловодства” (Киров, 2015); Всероссийская научно-практическая конференция
с международным участием “Инновационные технологии в пчеловодстве и
проблемы сохранения генофонда медоносных пчел” (Уфа, 2015);
Международная научно-практическая конференция “Современные проблемы пчеловодства и пути их решения” (Москва, 2016).
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны
грантом РФФИ 07-04-08274-з 2007 года “Участие в международном конгрессе
International Congress of Insect Biotechnology, Industry (ICIBI)”(руководитель),
грантами правительства Республики Башкортостан молодым ученым и
молодежным коллективам 2008 года “Популяции медоносных пчел на Урале”
(руководитель) и 2011 года “Молекулярно-генетическая структура северной
популяции башкирской медоносной пчелы A. m. mellifera” (руководитель),
грантом РФФИ 16-14-00001 Д. 2016 года “Издание научного труда “Темная
лесная пчела Apis mellifera mellifera L. Республики Башкортостан” ”
(руководитель).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 137 работ. Основные научные результаты диссертации отражены в 76 статьях рецензируемых научных журналов, в том числе 44 из списка ВАК РФ. В международную базу данных Генбанка депонировано 179 нуклеотидных последовательностей:
43 последовательности гена ND2 мтДНК Apis mellifera: DQ181611-DQ181622 (2005), DQ361088-DQ361090 (2006), HQ318729-HQ318730 (2010), KM242606-KM242631 (2014).
92 последовательности гена VG яДНК Apis mellifera: KJ532124-KJ532147, KJ572285-KJ572320, KJ645883-KJ645894 (2014), KU146538-KU146557 (2016).
23 последовательности локуса COI-COII мтДНК Apis mellifera: EF676102-EF676104 (2007), KF970918-KF970925, KM242632-KM242643 (2014).
3 последовательности интрона гена EF1-alpha яДHK Apis mellifera:
KM242603-KM242605 (2014).
4 последовательности гена 5.8S рРНК яДНК Ascosphaera apis: KM242589-
KM242592 (2014).
10 последовательностей гена COI мтДHK Apis cerana: KM242593-KM242602 (2014).
4 последовательности гена 16S рРНК яДНК Nosema apis: KM242585-KM242588 (2014).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и обсуждений, заключения и выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 326 страницах с 28 таблицами и 37 рисунками. Список литературы содержит 415 источников, в том числе 295 зарубежных.
Значение пчел для сельского хозяйства и окружающей среды
Самая древняя из известных ископаемых видов пчел - безжальная пчела Trigona prisca, окаменелости которой были найдены в отложениях верхнего мелового периода в США в Нью-Джерси возрастом от 96 до 74 млн. лет. Следы предшественников пчел рода Apis впервые были обнаружены на территории Западной Германии в отложениях Нижнего Миоцена возрастом от 22 до 25 млн. лет. В отложениях Верхнего Миоцена в Азии были обнаружены окаменевшие фрагменты гигантских пчел Apis dorsata возрастом 12 млн. лет. Виды пчел A. florea, A. dorsata, A. cerana и Apis mellifera дивергировали в отдельные виды уже в период олигоцена около 33 млн. лет назад (Koeniger et al., 1996; Michener, 2000; Oldroyd, Wongsiri, 2006).
Пчелы рода Apis, в отличие от пчел других родов, имели естественное распространение только на территории Старого Света, которая включает Азию, Африку и Европу. Это является доказательством того, что род Apis возник позже других родов и содержит 4 вида: A. florea - малые, A. dorsata - гигантские, A. cerana -восточные, A. mellifera - западные медоносные пчелы. Часто выделяют пчел Apis laboriosa и Apis andreniformis как отдельные виды, но, возможно, они являются экотипами A. dorsata и A. florea на последней стадии видообразования (Schwarz, 1948; Winston, 1991; Радченко, Песенко, 1994). Не определен также статус пчел из Юго-Восточной Азии Apis koschevnikovi и Apis nulensis (Koeniger et al, 1988; Tingek et al., 1988; 1996).
Виды пчел A. cerana и A. mellifera были географически изолированы во время плейстоценового ледникового периода около 1 тыс. лет назад, и до вмешательства человека они не контактировали. Ареалы A. cerana и A. mellifera сближены в единственном месте - на территории Афганистана, где их разделяет друг от друга 600 км (Tan, 2007; Radloff et al., 2010).
Виды пчел A. cerana и A. mellifera имели сходную эволюцию и дивергировали на несколько десятков подвидов, приспособленных к жизни в разных климатических условиях: от жарких тропических до холодных континентальных 47о с. ш. Это стало возможным благодаря обретению гнезд в полостях, где создавалась постоянная температура путем образования клуба в холодные и испарения воды в жаркие времена года. Другое преимущество им дала способность к коммуникации особей друг с другом, благодаря чему более эффективно стали использоваться пищевые ресурсы (Seeley, 2009).
Биология A. cerana и A. mellifera сходна - оба вида могут содержаться в современных перемещаемых ульях. Оба устраивают свои гнезда в полостях в виде вертикальных двухсторонних сот с шестиугольными ячейками из воска, вырабатываемого рабочими особями. Соты обычно многофункциональны и используются как для хранения меда и пыльцы, так и для выращивания расплода.
Человек больше предпочитает разводить A. mellifera, чем A. cerana, поскольку по численности семей и продуктивности A. cerana обычно уступает A. mellifera. Это привело к быстрому вытеснению и замене восточных пчел западными (Nanork et al., 2007). Так, по результатам наших популяционно-генетических исследований на основе анализа нуклеотидной последовательности гена COI мтДHK, на Дальнем Востоке России A. cerana является вымирающим видом, и популяция сохранилась в заповеднике “Кедровая Падь” в количестве менее 100 семей (Ильясов и др., 2013а). Известно, что по сравнению с видами рода Apis виды рода Melipona имеют большую численность и продуктивность семей. Племена индейцев Центральной и Южной Америки разводят безжальных пчел рода Melipona в своеобразных ульях уже 1000 лет. Но не следует полагать, что безжальные пчелы спокойны и удобны в разведении. В случае опасности они массово нападают на человека, нанося болезненные укусы мощными челюстями. Некоторые виды даже выделяют едкий яд, который вызывает сильные ожоги кожи. К сожалению, в наши дни разведение безжальных пчел рода Melipona не рассматривается (Michener, 2000; Oldroyd, Wongsiri, 2006).
Современные исследователи полагают, что вид A. mellifera подразделяется на 30 подвидов, распространенных естественным путем по всей территории Старого Света (Pntek-Zakar et al., 2015). Возникновение подвидов медоносной пчелы в Европе произошло в результате последнего Ледникового периода 10 тыс. лет назад, когда Альпы, Пиренейские и Балканские горные цепи играли роль естественного изолирующего географического барьера (Ruttner, 1988b).
После завершения Ледникового периода 4 тыс. лет назад на территории Иберийского полуострова сформировался подвид A. m. mellifera, называемый темной лесной пчелой. На Аппенинском полуострове возник подвид A. m. ligustica, а на Балканском A. m. cecropia. С Балканского и Аппенинского полуостровов подвиды пчел распространились по всей Центральной и Восточной Европе, эволюционировав в современные подвиды. Образование новых подвидов и рост внутривидового таксономического разнообразия в условиях широкого ареала медоносной пчелы в различных климатических условиях - процесс непрерывный и глобальный (Jensen et al., 2005). Так, подвид A. m. mellifera на юге Иберийского полуострова в результате скрещивания с африканским подвидом A. m. intermissa эволюционировал в подвид A. m. iberiensis. Одновременно A. m. mellifera проник на север через Францию в Северную и Западную Европу до Уральских гор (Ruttner, 1992; Carreck, 2008). Современные молекулярно-генетические исследования на основе митотипов локуса COI-COII и ND2 мтДHK и микросателлитных локусов ядерной ДHK показали, что все северные европейские медоносные пчелы эволюционной ветви М произошли из предковой популяции пчел Иберийского полуострова, которая стала ценным генетическим резервом разнообразия митотипов группы М (Miguel et al., 2007).
Сохранившиеся популяции подвидов медоносной пчелы и их охрана
Генетическая оценка пчел стала более эффективной после открытия микросателлитных локусов, разбросанных по всему геному. Микросателлитные локусы - неограниченный источник полиморфных генетических маркеров, и в наши дни в геноме медоносной пчелы обнаружено и описано их около 500 (Solignac et al., 2003).
Эти локусы представляют собой короткие от 2 до 6 п. н. фрагменты ДHK, тандемно повторяющиеся более 100 раз, и известны как STR и SSR. Полиморфизм микросателлитных локусов обычно изучается на основе ПЦР со специфичными для каждого локуса праймерами (Tautz, 1990).
Медоносная пчела и шмель земляной, являются первыми видами общественных насекомых, у которых изучено большинство микросателлитных локусов (Estoup et al., 1993; Solignac et al., 2007). К сожалению, стандартные лестницы размеров аллелей микросателлитных локусов для медоносной пчелы еще не разработаны, что затрудняет сравнительный анализ данных полиморфизма по разным популяциям (O Reilly et al., 1996; Schnabel et al., 2000). Микросателлитные локусы имеют преимущества перед другими маркерами - они высокоинформативны, многочисленны, гипервариабельны и встречаются по всему геному. Разные популяции и подвиды пчел различаются по частотам аллельных вариантов и уровням гетерозиготности микросателлитных локусов. Микросателлитные локусы удобны для анализа генетической структуры популяций пчел, оценки степени инбридинга, уровня гетерозиготности, генетических расстояний между популяциями и подвидами пчел, а также для рассчета коэффициента их генетического родства и уровня интрогрессии чужеродных генов в популяции. Анализ полиморфизма микросателлитных локусов - чрезвычайно важный и популярный инструмент в популяционно-генетических исследованиях медоносной пчелы во всем мире. Анализ полиморфизма микросателлитных локусов с использованием F-статистики и кластерного анализа позволил описать эволюцию аллелей и дифференцировать африканские и европейские популяции медоносной пчелы (Estoup et al., 1995a). Для статистически значимой оценки структуры популяции медоносной пчелы достаточно провести изучение по одной рабочей особи из 40 семей по 10 микросателлитным локусам (Cornuet et al., 1999). Так, на основе анализа полиморфизма 11 микросателлитных локусов были дифференцированы популяции пчел, относящиеся к эволюционным ветвям М и С на территории Греции, а также показан высокий уровень интрогрессии в популяции во Франции (Garnery et al., 1998a).
На основе полиморфизма 7 микросателлитных локусов определена зона интрогрессии между пчелами подвидов A. m. mellifera и A. m. ligustica на Альпах на границе между Францией и Италией (Solignac et al., 2003), в Швейцарии, Норвегии, Франции (Soland-Reckeweg et al., 2009), в Польше (Oleksa et al., 2011), а также в популяции африканизированных пчел между пчелами подвидов A. m. intermissa и A. m. ligustica на полуострове Юкатан (Clarke et al., 2002).
Анализ полиморфизма микросателлитных локусов позволил выяснить относительную чистоту линий иберийской популяции пчел подвида A. m. iberiensis в Испании и доказать генетическую изоляцию от популяции пчел подвида A. m. intermissa из Северной Африки (De la Ra et al., 2004) и Португалии (De la Ra et al., 2006). С использованием полиморфизма 8 микросателлитных локусов удалось установить дифференциацию подвидов пчел на 4 эволюционные ветви А, М, С, О (Franck et al., 2000b). Микросателлитные локусы активно используются при изучении генетической структуры локальных популяций медоносной пчелы разных регионов России: гибридных популяций пчел Томской (Островерхова и др., 2015) и Новосибирской областей (Форнара, 2012), популяций A. m. mellifera Пермского края, Республики Башкортостан (Каскинова и др., 2015; Ильясов и др., 2015в), Красноярского края, Республики Татарстан, Архангельской и Владимирской областей (Зиновьева и др., 2011); популяций A. m. carpatica Республики Адыгея и Закарпатской области Украины (Калашников и др., 2011; Зиновьева и др., 2011); популяций A. m. caucasica Краснодарского края и Орловской области (Калашников, 2013).
Несмотря на столь высокую популярность, у микросателлитных маркеров есть некоторые недостатки. Так, частота мутаций микросателлитных локусов очень высока и часто приводит к явлению гомоплазии. Это тот случай, когда ПЦР амплификация аллелей с разным количеством тандемных повторов проявляется в виде фрагментов одинакового размера, что может привести к ошибочной оценке аллельного богатства (Estoup et al., 1995b; Viard et al., 1998).
Явление нулевого аллеля микросателлитных локусов, когда в связи с мутациями в сайтах связывания праймеров ПЦР амплификация не дает видимого продукта, также часто встречается в популяциях медоносной пчелы и дает ошибочные результаты об уровне гетерозиготности (Chapuis, Estoup, 2007). Эти скрытые различия может выявить только секвенирование микросателлитных локусов.
Полимеразная цепная реакция и ДHK маркеры
Ядерный и митохондриальный геномы A. mellifera отличаются от Drosophila melanogaster высоким содержанием А+Т. Так ядерный геном у A. mellifera содержит 67% A+T и 33% G+C, у D. melanogaster - 58% A+T и 42% G+C. Митохондриальный геном у A. mellifera содержит 85% A+T и 15% G+C, у D. melanogaster - 79% A+T и 21% G+C (Jukes, Bhushan, 1986).
Ядерный и митохондриальный геномы A. mellifera характеризуются большей пространственной гетерогенностью A+T богатых участков, более высоким содержанием CpG островков и отсутствием транспозонов наиболее распространенных семейств по сравнению с D. melanogaster. Гены ядерного генома A. mellifera обладают высоким содержанием G+C, но имеют тенденцию располагаться в A+T богатых доменах. В белок кодирующих генах митохондриального генома A. mellifera А+Т приходятся в основном на второй и третьей позиции кодона (Meixner et al., 2014).
Структура и расположение большинства сходных генов ядерного и митохондриального геномов A. mellifera отличаются от D. melanogaster. По сравнению с D. melanogaster в митохондриальном геноме A. mellifera 11 генов тРНК имеют смещенное положение. Генетический код митохондриальной ДHK A. mellifera сходен с D. melanogaster, но антикодоны двух тРНК отличаются (Whitfield et al., 2006).
Уровень интрогрессии “южных” генов по митохондриальному геному рассчитывался на основе частот фрагментов межгенного локуса
COI-COII мтДHK, где фрагменты PQQQ и PQQ характерны пчелам, происходящим по материнской линии от A. m. mellifera (эволюционная ветвь М), а фрагмент Q свойственен пчелам, происходящим по материнской линии от A. m. caucasica, A. m. carnica, A. m. carpatica, A. m. ligustica (эволюционная ветвь С) (рис. 18) (Garnery et al., 1993).
Рисунок 18. Расположение генов в кольцевой митохондриальной ДHK медоносной пчелы A. mellifera (досуп в генбанке NC_001566). Звездочками обозначены гены тРНК. Гены ядерного генома A. mellifera, отвечающие за циркадные ритмы, интерференцию РНК (иРНК) и метилирование ДHK имеют больше сходства с генами позвоночных, чем с D. melanogaster. Это объясняется параллельной эволюцией некоторых генов в ходе адаптации к условиям среды обитания. Геном A. mellifera по сравнению с D. melanogaster содержит меньше генов естественного иммунитета, ферментов детоксикации, белков кутикулы и вкусовых рецепторов. Однако A. mellifera содержит новые гены, связанные с обонятельными рецепторами, переработкой пыльцы и нектара, не встречающиеся у D. melanogaster. Видимо, это связано с экологией пчел и их социальной организацией (Wallberg et al., 2014).
В генах митохондриального генома A. mellifera трансверсии наблюдаются в два раза чаще транзиций, тогда как у D. melanogaster наоборот. Транзиции в генах митохондриального генома A. mellifera отмечаются в основном в третьей позиции кодона. Некоторые гены A. mellifera возникли в результате эволюционных преобразований генов общих предков с D. melanogaster. Так, ген A. mellifera, кодирующий основной протеин маточного молочка произошел от древнего гена yellow, встречающегося у D. melanogaster. Следует отметить, что скорость эволюционных преобразований ядерного и митохондриального генома A. mellifera меньше по сравнению с D. melanogaster. Однако по сравнению с D. melanogaster геном A. mellifera значительно больше дивергировал от общего предка, (Crozier et al., 1989; Crozier, Crozier, 1992). Возможно, что это связано малой эффективной численностью популяции A. mellifera и низкой скоростью обратного мутирования по сравнению с D. melanogaster (Crozier, 1980).
В ядерном геноме A. mellifera микро РНК (miRNA) играют важную роль в регуляции социальной организации и кастовой дифференциации. Так, в ядерном геноме A. mellifera обнаружены новые микро-РНК (мкРНК), характеризующиеся кастово-специфичной экспрессией: miRNA C5599F больше всего экпрессируется в матках, C689F - в куколках, C5560 - в куколках рабочих особей (Whitfield et al., 2006).
На основе применения концепции молекулярных часов было рассчитано время дивергенции A. mellifera и D. melanogaster от общего предка, которое по ядерному геному равнялось 300 млн. лет и по митохондриальному - 280 млн. лет. Считается, что все различия, которые наблюдаются между A. mellifera и D. melanogaster, произошли после их дивергенции. Эту гипотезу подтверждают различия, наблюдающиеся на ранних стадиях развития между A. mellifera и D. melanogaster (Weinstock et al., 2006).
Таким образом, несмотря на выполнение полного секвенирования ядерного и митохондриального геномов медоносной пчелы A. mellifera, функции многих генов и локусов еще до конца не раскрыты. Сравнительный анализ геномов разных видов насекомых с применением методов биоинформатики позволит познать особенности структуры и функции генома медоносной пчелы A. mellifera.
Филогенетический анализ подвидов A. mellifera на основе полиморфизма нуклеотидной последовательности гена вителлогенина VG яДHK
Вителлогенин - основной белок-предшественник яичного желтка медоносной пчелы A. mellifera, который является мономерным фосфолипогликопротеином высокой плотности с молекулярной массой 180 кДа (Chen et al., 1997; Sappington, Raikhel, 1998). У пчел вителлогенин синтезируется в жировом теле, секретируется в гемолимфу и накапливается в ооцитах, обеспечивая в дальнейшем питание эмбриона (Ильясов и др., 2015е).
Показано плейотропное действие вителлогенина у матки пчел и рабочих особей медоносной пчелы, приводящее к различным фенотипическим проявлениям (Amdam et al., 2003). Известно, что титр вителлогенина в гемолимфе медоносной пчелы положительно коррелирует с величиной яйценоскости матки (Engels, 1974). Также показано, что вителлогенин играет важную роль в развитии кастовой дифференциации медоносной пчелы (Seehuus et al., 2006; Nelson et al., 2007; Ильясов и др., 2015е).
В геноме медоносной пчелы содержится только одна копия гена вителлогенина (VG), тогда как у некоторых видов насекомых -несколько (Kent et al., 2011). У медоносной пчелы в гене VG содержится 6 экзонов, нуклеотидные последовательности которых опубликованы в Генбанке (www. ncbi.nlm.nih.gov). В Генбанке VG секвенирован по 6 экзонам у 19 пчел из Африки (эволюционная ветвь А), 10 - из Восточной Европы (эволюционная ветвь С), 12 - из Западной Европы и 12 - из уральской популяции (эволюционная ветвь М) (Kent et al., 2011).
Генетическая идентификация подвидов очень актуальна в наши дни. В результате генетических исследований в современной систематике пересматриваются составы таксономических групп и возникают новые реконструкции их филогенеза. Особенно востребована во всем мире генетическая дифференциация подвидов медоносной пчелы, которых, по современным данным, различают во всем мире около 30. Наша работа на основе секвенционного сравнительного анализа VG медоносной пчелы из уральской популяции была выполнена с целью обнаружения в экзонах уникальных полиморфных сайтов. Они в дальнейшем могут быть использованы в качестве генетических маркеров, дифференцирующих пчел эволюционных ветвей A, М и С (Ильясов и др., 2015е).
В исследовании были отобраны 12 образцов пчел подвида A. m. mellifera уральской популяции, относящиеся к эволюционной ветви М (табл. 9) и полученные нуклеотидные последовательности 6 экзонов гена вителлогенина были загружены в базу данных Генбанка. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена вителлогенина VG провели с выборкой из 28 образцов пчел 4 подвидов из Генбанка (табл. 10).
На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена VG уральской популяции с референсной последовательностью A. mellifera (NC_007073.3) (4020743-4026919); AADG06005159.1 (56573-62749) обнаружены SNPs в виде транзиций (замена пуринового нуклеотида на пуриновый или пиримидинового - на пиримидиновый) и трансверсий (замена пуринового нуклеотида на пиримидиновый и наоборот) (табл. 18). Транзиции и трансверсии в экзонах VG встречались следующим образом: во 2-м экзоне - 2 транзиции, в 3-м экзоне - 3 транзиции, в 4-м экзоне - 2 транзиции, в 5-м экзоне - 4 транзиции и 2 трансверсии, в 6-м экзоне - 1 транзиция (единственная несинонимичная), в 7-м экзоне - 6 транзиций.
В сравниваемых последовательностях наблюдалось всего 20 SNPs, из которых 18 замен - транзиции (90%), а 2 - трансверсии (10%). Обе трансверсии являлись несинонимичными и приводили к заменам в позициях 4528 (Ley/Ile) и 4533 (Arg/Ser) аминокислотной последовательности 5 экзона VG. Из 18 транзиций только 1 являлась несинонимичной (6%) и приводила к замене в позиции 5229 (Ala/Thr) аминокислотной последовательности 6 экзона VG.
В образце пчелы из д. Уядыбаш Татышлинского района Республики Башкортостан была обнаружена делеция в 9 нуклеотидов в позиции 794-802 в экзоне 2 VG, не приводящая к сдвигу рамки считывания и замене аминокислот. Сходная делеция встречалась в нуклеотидной последовательности экзона 2 VG медоносной пчелы в образцах из Генбанка под номерами: JN557265 (изолят L2371 из Египта), JN557266 (изолят L2372 из Египта), JN557273 (изолят L2411 из Египта), JN557274 (изолят L2412 из Египта), JN557275 (изолят L2421 из Египта), JN557276 (изолят L2422 из Египта).
При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей VG пчел из уральской популяции с пчелами эволюционных ветвей М и С из Генбанка (табл. 11) обнаружены 24 уникальных SNPs, которые четко дифференцировали представителей этих двух эволюционных ветвей (табл. 19). Эти SNPs могут быть использованы в качестве генетических ядерных маркеров для поиска сохранившихся изолятов A. m. mellifera в России в условиях гибридизации с пчелами с Ближнего Востока, Средней Азии и Восточной Европы.
Уникальные SNPs в экзонах VG, дифференцирующие пчел эволюционных ветвей M и C, встречались следующим образом: во 2-м экзоне - 3 замены, в 3-м экзоне - 5, в 4-м экзоне - 4, в 5-м экзоне - 6, в 6-м экзоне - 6, в 7-м экзоне - нет. Таким образом, 5-й и 6-й экзоны VG максимально информативны, 2-й, 3-й и 4-й экзоны средне информативны, а 7-й экзон при дифференциации пчел эволюционных ветвей M и C не информативен. Высокой дифференцирующей способностью и информативностью обладают двойные SNPs. Обнаруженные нами двойные SNPs в экзоне 4 VG 287 AA TC и в экзоне 5 VG 4508 GG AA являются основными ядерными SNPs маркерами для дифференциации подвидов эволюционной ветви М и С. На основе сравнительного кластерного анализа методом ближайшего соседа просеквенированных нуклеотидных последовательностей VG пчел 12 образцов уральской популяции, а также 10 семей пчел эволюционной ветви М (изоляты I2331, I2332, I2341, I2342, I2481, I2482, I2561, I2562 из Испании и M2271 M2272 из Польши), 10 семей пчел эволюционной ветви A (изоляты S2851, S2852, S2901, S2902, S2981, S2982, S2991, S2992, S3001, S3002 из Южной Африки) и 8 семей пчел эволюционной ветви С (изоляты C1811, C1812 из Германии, C2001, C2002 из Хорватии, C2731, C2732 из Словении, L2321, L2322 из Египта), просеквенированных C. Kent et al. (2011) составлена дендрограмма, отображающая генетические взаимоотношения пчел разных эволюционных ветвей (рис. 30). Образцы семей пчел для анализа отбирались на основе максимальной доли принадлежности к какой-либо эволюционной ветви (более 0.9), рассчитанных C. Kent et al. (2011) для нуклеотидных последовательностей VG депонированных в Генбанк (Kent et al., 2011).