Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы - 11 -
1.1. Систематика, филогения и географическая изменчивость "настоящих" или речных уток - 11 -
1.1.1. Систематика и филогения . - 11 -
1.1.2. Географическая изменчивость и натальная филопатрия - 13 -
1.2. Надвидовой комплекс обыкновенной кряквы Anas platyrhynchos - 16 -
1.2.1. Распространение и численность , - 16 -
1.2.2. Таксономическое положение - 19 -
1.3. Межвидовая гибридизация - 23 -
1.3.1. Межвидовая гибридизация животных - общие представления - 23 -
1.3.2. Межвидовая гибридизация Гусеобразных - 25 -
1.3.3. Межвидовая гибридизация крякв и ее последствия - 28 -
1.3.4. Применение генетических маркеров для исследования гибридизации и реконструкции филогении группы крякв - 30 -
1.4. Значение и применение отдельных молекулярных маркеров ДНК в популяционных и эволюционных исследованиях - 34 -
1.4.1. RAPD-PCR - 34 -
1.4.2. Митохондриальная ДІIK - 36 -
1.4.3. Интроны ядерных генов - 38 -
ГЛАВА 2. Материалы и методы - 40 -
2.1. Материал - 40-
2.2. RAPD-PCR анализ - 41 -
2.2.1. Выделение ДНК -41 -
2.2.2. Электрофорез ДНК - 42 -
2.2.3. Амплификация с произвольными праймерами - 42 -
2.3. Секвенирование ДИК - 43 -
2.3.1. Выделение ДНК - 43 -
2.3.2. Амплификация и секвенирование митохондриалыюй ДНК - 44 -
2.3.3, Амплификация и секвенирование шестого интрона орнитиндекарбоксилазы -45 -
2.4. Статистический анализ данных - 47 -
2.4.1. Анализ данных RAPD-PCR - 47 -
2.4.2. Анализ нуклеотидных последовательностей мтДНК и яДПК - 49 -
ГЛАВА 3. Результаты - 58 -
3.1. Особенности генетического разнообразия и филогенетических связей в двух группах видов уток: данные RAPD-PCR анализа - 58 -
3.1.1. RAPD-спектры -58-
3.1.2. Генетическая изменчивость и дифференциация - 60 -
3.1.3. Фено- и филогенетические реконструкции - 66 -
3.2. Гибрид обыкновенной и пестроносой крякв {Anasplatyrhynchos х A.zonorhyncha) в Приморском крае - 68 -
3.2.1 Общая характеристика - 68 -
3.2.2. Описание окраски гибридного самца - 68 -
3.2.3. Сравнение окраски гибрида и родительских видов - 72 -
3.2.4. Сравнение RAPD-PCR паттернов гибрида и родительских видов - 72 -
3.3. Асимметричная гибридизация между обыкновенной и пестроносой кряквами -73 -
3.3.1. Данные частичного секвенирования контрольного региона мтДНК - 73 -
3.3.2. Данные секвенирования шестого интрона орнитиндекарбоксилазы - 80 -
3.3.3. Соотношение групп гаплотипов мтДНК и типов аллелей шестого интрона орнитиндекарбоксилазы у обыкновенной и пестроносой крякв - 81 -
3.3.4. Эффективная численность гибридизующих таксонов и скорость миграции - 83 -
3.4. Филогеографический анализ обыкновенной кряквы на основании частичного секвенирования контрольного региона мтДНК - 85 -
3.4.1. Изменчивость нуклеотидных последовательностей контрольного региона мтДНК обыкновенной кряквы - 85 -
3.4.2. Генеалогия гаплотипов мтДНК обыкновенной кряквы и демографическая история - 86
3.4.3. Генетическая дифференциация популяций - 91 -
ГЛАВА 4. Обсуждение - 94 -
4.1. Гибридизация между обыкновенной и пестроносой кряквами - 94 -
4.1.1. Данные RAPD-PCR анализа - 98 -
4.1.2. Данные секвенирования ДНК - 101 -
4.2. Филогеография обыкновенной кряквы Anasplatyrhynchos - ПО -
4.2.1, Филогеографическая структура - 111 -
4.2.2, Популяционная дифференциация - 114 -
Заключение -117-
Выводы - 120-
Литература
- Систематика, филогения и географическая изменчивость "настоящих" или речных уток
- Амплификация с произвольными праймерами
- Особенности генетического разнообразия и филогенетических связей в двух группах видов уток: данные RAPD-PCR анализа
- Гибридизация между обыкновенной и пестроносой кряквами
Введение к работе
В последнее время значительно увеличилось число исследований, посвященных филогеографии и популяционной динамике различных видов животных. Это обусловлено в первую очередь широким применением методов анализа нуклеотидных последовательностей митохондриальнои и, реже, ядерной ДНК в эволюционных и популяционных исследованиях (Avise, 2000). Работы по филогеографии птиц проведены в основном на видах Европы и Северной Америки, и лишь некоторые из изученных видов имели палеарктический или голарктический ареал (Крюков, Сузуки, 2000; Zink et el., 2002 a,b; Zink et el., 2003; Pavlova et al., 2003). К тому же, исследования проводились главным образом на оседлых видах или видах, совершающих миграции на небольшие расстояния. Представители семейства утиных Anatidae сравнительно редко становились объектом филогеографических исследований (Cronin et al., 1996; Lanctot et al., 1999; Scribner et al., 2001; Pearce et al., 2004). Зачастую a priori принимается положение об отсутствии корреляции между генетической изменчивостью и географической локализацией популяций ввиду склонности уток к сезонным перелетам, расселению и полигамности. В то же время утки отличаются от большинства других птиц натальной филопатрией самок и значительной натальной дисперсией самцов. Таким образом, филогеографический анализ разных видов семейства утиных представляет несомненный теоретический интерес.
Межвидовая гибридизация - явление широко распространенное в семействе Anatidae. В пределах этого таксона известно около 115 вариантов межвидовых скрещиваний, из них примерно треть дает плодовитое потомство (Johnsgard, 1960; Greig, 1980). В ряде случаев гибридизация принимает интрогрессивный характер и может угрожать существованию одного из принимающих в процессе гибридизации таксонов (Панов, 1989). Частоту гибридизации между различными видами уток порой невозможно оценить, так как большинство особей F2 или беккроссов практически неотличимы фенотипически от одного из родительских видов (Johnsgard, 1967). К тому же многие виды уток имеют огромный потенциал для расселения ввиду их способности к перелетам на значительные расстояния и регулярных миграций (Anderson et al., 1992). Это, безусловно, должно приводить к расширению зоны гибридизации на большие расстояния без определенной географической направленности. В то же время натальная филопатрия самок может в значительной степени ограничить генный поток и гибридизацию между изолированными видами и популяциями (Rohwer, Anderson, 1988; Avise et al., 1992). Таким образом, применение молекулярно-генетических методов для исследования частных случаев гибридизации в семействе утиных необходимо. Молекулярные маркеры способны дать не только количественную оценку гибридизации, но и показать преимущественное направление генного потока, а также с учетом популяционно-генетической структуры и эффективной численности гибридизующих таксонов спрогнозировать и их будущее.
Кряква обыкновенная Anas platyrhynchos - это самый известный и многочисленный вид уток, имеющий голарктическое распространение. Ежегодно значительная часть всего вида совершает сезонные перелеты, дистанция которых составляет тысячу и более километров. Есть небольшое число оседлых популяций, однако это, скорее, исключение из общего правила. В мировой фауне кряква обыкновенная представлена подвидами А, p. conboschas и А. p. platyrhynchos (Степанян, 2003). Ареал первого подвида ограничен юго-восточным и юго-западным побережьями Гренландии. Второй занимает огромные пространства в Евразии и в северной части Северной Америки, что, по-видимому, является результатом дальних перемещений и обмена особями между удаленными друг от друга территориями. Несмотря на большое число исследований, посвященных крякве, ее филогеография и популяционно-генетическая структура не изучены до сих пор. Помимо фундаментального значения подобного исследования, знание распределения и структуры популяций необходимо для разработки мер по сохранению поголовья и увеличения численности обыкновенной кряквы, которая является ценным охотничьим видом и занимает первое место по добыче среди водоплавающих видов птиц.
Кряква обыкновенная часто упоминается в литературе в связи с гибридизацией с другими представителями рода Anas - речных уток. В ряде случаев гибридизация принимает интрогрессивный характер и может привести к постепенному поглощению гибридизующего с обыкновенной кряквой вида. Ярким примером быстрого перемешивания генных пулов является скрещивание обыкновенной кряквы с американской A. rubripes и австралийской A. superciliosa черными утками. Последствия такой гибридизации могут быть весьма впечатляющими: 50% смешанных популяций уток Новой Зеландии (куда обыкновенная кряква была интродуцирована в начале XX века) составляют гибриды и менее 5% - фенотипические черные утки (Gillespie, 1985). Хотя известно, что на территории нашей и сопредельных стран обыкновенная кряква гибридизует с китайской пестроносой кряквой A. zonorhyncha в местах их контакта, количественные оценки данного явления не приводились.
Использование современных молекул ярно-генети чес ких методов для исследования филогеографической структуры обыкновенной кряквы и гибридизации с пестроносой кряквой на Дальнем Востоке России позволит выявить внутривидовую генетическую подразделенность обыкновенной кряквы, которая является результатом как исторических, так и современных событий, и дать как можно более полную оценку ее гибридизации с пестроносой кряквой, истории и возможных последствий для гибридизующих видов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение гибридизации обыкновенной кряквы с пестроносой на юге Российского Дальнего Востока и анализ филогеографической структуры обыкновенной кряквы. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить особенности генетического разнообразия и дифференциации обыкновенной и пестроносой крякв и их фенотипического гибрида с помощью RAPD-PCR анализа.
2. Реконструировать филогенетические взаимоотношения гаплотипов мтДНК и аллелей шестого интрона гена орнитиндекарбоксилазы (ODC-6) у обыкновенной и пестроносой крякв.
3. Дать оценку генетической дифференциации обыкновенной и пестроносой крякв по данным изменчивости мтДНК и ODC-6.
4. Провести анализ филогеографической и популяционно-генетической структуры обыкновенной кряквы с использованием мтДНК.
5. Выявить влияние гибридизации обыкновенной кряквы с близкородственными видами и сортировки линий (lineage sorting) мтДНК на генетическую структуру обыкновенной кряквы в разных регионах.
Научная новизна. Впервые проведено исследование межвидовой гибридизации обыкновенной кряквы A. platyrhynchos и пестроносой кряквы А. zonorhyncha на юге Дальнего Востока России. Дано детальное морфологическое описание фенотипического гибрида A. platyrhynchos х A. zonorhyncha. Для исследования гибридизации применен комплекс молекул яр но-генетических методов, который позволил оценить генетическую изменчивость и дифференциацию гибридизующих видов на уровне тотальной клеточной ДИК (RAPD-PCR анализ), митохондриальной ДИК и ядерной ДНК. У обоих видов выявлены идентичные монофилетические митохондриальные линии и группы аллелей шестого интрона гена орнитинде карбоксил азы. Определены направление генного потока и характер гибридизации между A, platyrhynchos и A. zonorhyncha. Реконструированы филогенетические отношения гибридизующих видов с близкородственными видами североамериканских уток A, fulvigula, A. rubripes, А. diazi.
Впервые исследована филогеографическая структура обыкновенной кряквы с использованием мтДНК. Выявлена роль места зимовки в формировании популяционно-генетической структуры вида. Показано, что распределение двух основных линий мтДНК у обыкновенной кряквы в Голарктике может быть обусловлено гибридизацией A. platyrhynchos с A. zonorhyncha на юге Российского Дальнего Востока, тогда как на североамериканском континенте незавершенной сортировкой линий (incomplete lineage sorting, Avise et al., 1990) гаплотипов мтДНК A. platyrhynchos. Выявлено преобладание одностороннего направления генного потока через Берингию.
Теоретическое и практическое значение. Результаты данного исследования позволяют оценить недоступный для морфологического анализа эффект межвидовой гибридизации на генетическую целостность гибридизующих таксонов - обыкновенной и пестроносой крякв. Проведенное исследование вносит изменения в общепринятые представления о филогении и путях видообразования в надвидовом комплексе крякв, включающего 14 видов. Оно демонстрирует важность использования больших выборок для реконструкции филогении близкородственных видов в связи с возможной пара- или полифилиеЙ исследуемых таксонов.
Выявленная низкая генетическая дифференциация вместе с данными о миграциях и расселении обыкновенной кряквы свидетельствуют об обмене генами между достаточно удаленными друг от друга географическими популяциями. В то же время обнаружено и ограничение генного потока через Берингию в направлении Северная Америка-Азия. Достаточно дифференцированной генетически оказалась частично оседлая популяция обыкновенной кряквы Алеутских островов. Полученные данные о популяционно-генетической структуре обыкновенной кряквы и генном потоке могут быть экстраполированы на другие виды перелетных водоплавающих птиц. Помимо большого значения для промысла и спортивной охоты утки известны как переносчики возбудителей многих инфекционных заболеваний, среди которых в последнее время наиболее часто упоминается вирус птичьего гриппа. Очагом этой инфекции считают Юго-Восточную Азию, где зимует большинство видов уток из Дальневосточного региона. Таким образом, знание популяционно-генетической структуры уток в целом и, в частности, обыкновенной кряквы как вида, доминирующего по численности, необходимо не только для выделения популяционных единиц для хозяйственного управления, но и для изучения возможных путей переноса различных вирусных инфекций в ходе миграций утиных.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на совещании UNESCO-МАВ группы по биосферным заповедникам Восточной Азии (Владивосток, 2001), ежегодной конференции молодых ученых БПИ ДВО РАН (Владивосток, 2001), на И Международной орнитологической конференции (Улан-Уде, 2003), на 7ой Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука ХХГ века" (Пушино, 2003) и на Международной конфсренции "Научные мосты между Северной Америкой и Российским Дальним Востоком" (Владивосток, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано восемь работ.
Объем и структура диссертации. Основная часть диссертации состоит из введения; четырех глав - обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения; заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах, и содержит 11 таблиц и 24 рисунка. Список литературы насчитывает 244 наименования, из которых 220 на иностранных языках.
Благодарности. Я выражаю искреннюю благодарность научному руководителю академику РАН Ю.Н. Журавлеву и проф. К.Г. МакКрекену (University of Alaska Fairbanks, U.S.A.) за помощь и всестороннюю поддержку в работе. Выражаю глубокую признательность д.б.н. Г.Н. Челоминой за оказание методической помощи и ценные советы. Я благодарна заведующему А.П. Крюкову и всем сотрудникам лаборатории эволюционной зоологии и генетики БПИ ДВО РАН за поддержку, постоянное внимание, консультации и создание творческой атмосферы. Я очень признательна А.А. Назаренко, М.В. Павленко, В.А. Брыкову и А.И. Пудовкину за ценные замечания и рекомендации при написании текста диссертации.
Систематика, филогения и географическая изменчивость "настоящих" или речных уток
Систематике и филогении группы речных уток посвящено много публикаций. Основополагающей является работа Делакура и Майра (Dclacour, Mayr, 1945). На основании внешнего сходства и поведения уток авторы выделили 13 групп, включивших 36 видов рода Anas. Основными группами были: кряквы, синекрылые чирки, зеленокрылые чирки, тропические чирки и свиязи. Группу крякв, в которую было включено 13 видов, по мнению авторов, можно рассматривать как один надвид. Последующие исследования сопоставляли морфологические и этологические особенности речных уток и подтвердили классификацию, предложенную Делакуром и Майром (Johnsgard, 1961а, 19656, 1978, 1979). Также известны работы по биохимической генетике речных уток (Sibley, Ahlquist, 1972; Brush, 1976; Numachi et al., 1983; Patton, Avise, 1985) и молекулярной генетике с применением методов ПДРФ митохондриальной (мт) ДНК (Kessler, Avise 1984; Avise et al., 1990) и гибридизации ДПК (Madsen et al., 1988). Но в этих работах остались неохваченными более 14 видов рода Anas и более 19 видов подсемейства Anatini, к тому же было исследовано малое количество локусов.
Исследования изменчивости 157 морфологических признаков у 59 таксонов подсемейства Anatini легли в основу классификации, предложенной Ливзеем (Livezey, 1991). Он выделил 6 групп видов внутри p. Anas, которые отчасти совпали с группировкой Дслакура и Майра. С помощью сравнения последовательностей генов цитохрома b и субъединицы 2 NADH-дегидрогеназы мтДИК 44 видов p. Anas была реконструирована молекулярная филогения рода (Johnson, Sorenson, 1998). Была подтверждена монофилия рода и примерно вычислено время его адаптивной радиации - 1.3 млн. лет. Путем объединения молекулярной филогении с таковой, построенной по морфологическим и этологическим признакам, были выделены следующие группы видов в пределах рода: шилохвости, зеленокрылые чирки, кряквы, серые чирки, бурые чирки, свиязи, серебристые чирки, синекрылые чирки и байкальский чирок или клоктун (Johnson, Sorenson, 1999). Большинство из перечисленных групп являются монофилетичными и имеют высокую бутстреп-поддсржку (рис. 1). Взаимоотношения близкородственных видов внутри ряда групп противоречивы вследствие парафилии и гибридизации (Omland, 1997; Johnson, Sorenson, 1999; Donne-Gousse et al„ 2002; Peters et al., 2005). Ряд авторов придерживается мнения, что любые молекулярные исследования эволюции таксонов p. Anas должны проводиться на популяционном уровне, т.к. одной особи недостаточно для идентификации парафилии, являющей частым следствием перипатрического видообразования (Avise et al.f 1990; Peterson, 1992; Hoelzer, Melnik, 1994; Patton, Smith, 1994; Cooper et al., 1996).
Таким образом, филогенетичесісие взаимоотношения некоторых видов внутри рода до сих пор остаются невыясненными окончательно и нуждаются в доработке с помощью современных молекулярно-генетических методов и на популяционном уровне. условиям дают основания предполагать, что географическая изменчивость представляет собой всеобщее явление. Однако во всех группах животных встречаются виды, которые не обнаруживают географической изменчивости (Майр, 1968). Такие сравнительно немногочисленные случаи ее отсутствия можно объяснить несколькими причинами: маленьким ареалом вида (скворец Ротшильда Leucopsar rothschildi, американская славка Dendroica kirtlandi, некоторые виды пресноводных рыб, обитающие только в одном водоеме), стабильностью фенотипа (например, виды-двойники), большими возможностями для расселения вида (очень мелкие космополитические пресноводные организмы, такие как простейшие, коловратки, тихоходки и т.д.). Последняя причина является весьма актуальной и для перелетных видов уток, возможности расселения которых велики, что подтверждают данные кольцевания (Миграции птиц, 1997) и, следовательно, виды могут быть панмиктичны независимо от географической протяженности их ареалов,
В то же время, у многих видов уток в разной степени отчетливо выражена натальная филопатрия. Натальная филопатрия - это "склонность сохранять постоянную связь с местом рождения, характерная для видов или групп особей, обладающих либо низким потенциалом расселения, либо стремящихся остаться или вернуться в родные местообитания" (Lincoln et al.s 1982). Степень филопатрии имеет большое влияние на популяционную структуру. В случае отсутствия обмена особями между популяциями может возникнуть значительная генетическая дифференциация (Chesser, 1991). Следовательно, филопатрия может способствовать изоляции популяций, их дивергенции, либо вымиранию (Gadgil, 1971). В отличие от большинства птиц, у которых натальная филопатрия присуща главным образом самцам (Greenwood, 1980; Greenwood, Harvey, 1982), считается, что у уток более выражена натальная филопатрия самок, а для самцов более характерна натальная дисперсия (Rohwer, Anderson, 1988; Avise et al., 1992), При этом часто формирование пар у уток происходит на зимовках, где могут встретиться птицы из разных популяций. Образовавшаяся пара весной возвращается в места гнездования (или рождения) самки (Weller, 1965; Anderson et al., 1992). В то же время весенние стаи мигрантов часто бывают представлены птицами только одного пола, из чего следует, что в этом случае образование пар происходит или в ходе миграции, или в местах гнездования (ЮЛ Ї.Журавлев, личн. набл.)- Таким образом, вклад филопатрии в дифференциацию популяций следует оценивать, исходя из конкретных данных, а не общих установок.
В настоящее время предложены две группы гипотез эволюции филопатрии (Weatherhead, Forbes, 1994). Экологическая или соматическая подразумевает, что особи возвращаются на места рождения для размножения, поскольку им легче ориентироваться в знакомых местах. Поступая таким образом, они имеют точное представление о локализации в местообитании пищевых ресурсов, хищников и пр. Генетическая группа гипотез рассматривает филопатрию как возможность для оптимального инбридинга, т.е. спаривания особей с одинаковыми комбинациями генов, обеспечивающими генетическую адаптацию к данной местности. К уткам наиболее применимо первое объяснение (Robertson, Cooke, 1999). Оптимального инбридинга утки достичь не могут (Shields, 1983), поскольку во многих случаях место рождения и гнездования самки находится далеко от места рождения самца. Следовательно, натальная дисперсия самцов должна приводить к значительному генному потоку между популяциями. В то же время существуют исключения из общего правила. Так, исследование Дохерти с соавт. (Doherty et al., 2002), посвященное обыкновенной крякве Anas ptatyrhynchos, показало, что только молодые самки обнаруживают филопатрию в большей степени по сравнению с самцами, тогда как различия между взрослыми кряквами нивелируются. В подтверждение последнего также показано, что возвращение постоянной пары крякв в одно и то же место гнездования является большой редкостью (Blohm, Mackenzie, 1994).
Амплификация с произвольными праймерами
ДНК выделяли стандартным методом фенольной депротеинизации (Маниатис и др., 1984). Ткани гомогенизировали в ТЕ-буфере, рП 7,5 (0,001М EDTA, 0,01 М Tris, 0,1 MNaCb). В гомогенизированный материал добавляли 10 % SDS до конечной концентраций 0,5%. Удаление белков проводили гидролизом с помощью протеиназы К при ее концентрации 50-100 мкг/мл. Смесь инкубировали при температуре 37С в течение 2 часов и при 65 С в течение часа. Затем в смесь добавляли равный объем депротенизирующей смеси фенол:хлороформ (1:1), тщательно перемешивали и центрифугировали на центрифуге К-23 в течение 15 минут при 2500 об/мин. К надосадочной жидкости добавляли равный объем хлороформа, перемешивали и центрифугировали в течение 15 минут при 2500 об/мин. Водную фракцию отбирали при помощи пипетки, добавляли к ней 1/10 объема 3 М CHCOONa и 1 объем изопропилового спирта (для осаждения ДНК). Осажденную ДНК переносили в 80 % этанол для хранения или растворяли в ТЕ буфере для дальнейшей работы до конечной концентрации ДНК 30 мкг/мл. Концентрацию и качество ДНК каждого образца оценивали путем сравнения со стандартными образцами ДНК фага лямбда при электрофорезе в 1,5%-ном агарозном геле.
Фиксированный материал промывали три раза 70%-ным этиловым спиртом, рН 8,0, затем дважды в растворе 0,15 м NaCl, 0,015 м цитрата Na, 0,1 м EDTA, рН=8,0 . Отмытый материал суспензировали в свежей порции этого же раствора, после чего добавляли 10 % SDS до конечной концентрации 0,5% и протеиназу К до конечной концентрации 50-100 мг/мл. Смесь инкубировали при температуре 37С в течение 18 часов и при 65 С в течение двух часов. Затем к смеси добавляли 10 % SDS до конечной концентрации 1% и равный объем депротенизирующей смеси фенол:хлороформа (1:1). Далее выделение ДНК проводили как для свежих тканей,
Электрофорез нативной ДНК и продуктов амплификации проводили в 1 и 2% агарозном геле, соответственно. Для приготовления геля к 1 или 2 г агарозы добавляли 100 мл ТВВ-буфера и нагревали в термостойкой колбе на плите, до полного растворения агарозы. Затем охлаждали раствор до комнатной температуры и добавляли в него бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Готовый раствор выливали в камеру для электрофореза и давали гелю застыть, затем помещали гель в электрофорезную кювету. Кювету заливали ТВЕ-буфером, так чтобы гель был закрыт слоем буфера. Пробы смешивали с красителем (0,025% бромфеноловым синим на 50% глицерине) и вносили в лунки под электрофорезный буфер. Электрофорез проводили в горизонтальной камере при напряжении 4,5 В/см. По окончании электрофореза гель фотографировали в проходящем УФ-свете через оранжевый светофильтр на фотопленку Микрат-300.
Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей около 30 нг геномной ДНК, 1х буфер для PCR (СибЭнзим, Новосибирск), 0,125 мМ каждого из dNTP, 1,5-3 мМ MgCl2 (количество MgCl2 для каждого праймера определяли экспериментально), 1 ед. Taq-полимеразы (СибЭнзим, Новосибирск), 0,5 мкМ праймера (Орегон, США). Список и нуклеотидные последовательности праймеров, использованных для RAPD-PCR, приведены в таблице 1. При приготовлении реакционной смеси соблюдали стандартные меры предосторожности, необходимые для предотвращения контаминации. Контрольная проба содержала все реакционные компоненты за исключением ДНК, Амплификацию проводили в термоциклере UNO II компании Biometra (Германия).
Использовали режим, состоящий из 40 циклов: 45 сек при 92С, 30 сек при 37С, 15 сек при 45С, 2 мин при 72С. Режиму амплификации предшествовала 2-минутная денатурация при 94С. Завершалась реакция дополнительным 10-минутным синтезом при 72С. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза (см. 2.2.2).
В качестве маркера молекулярной массы использовали Pstl-гидролизат ДНК фага лямбда.
Для выделения индивидуальных препаратов тотальной ДНК из тканей печени и грудной мышцы уток использовали стандартный набор DNAeasy Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA). Выделение ДНК из оснований перьев уток из музейных коллекций проводили также с помощью DNAeasy Tissue Kit, но на этапе инкубирования с протеиназой К добавляли в реакционную смесь меркаптоэтанол до конечной концентрации 100 мкг/мл.
Особенности генетического разнообразия и филогенетических связей в двух группах видов уток: данные RAPD-PCR анализа
Для изучения генетического разнообразия и филогенетических отношений шести видов пластинчатоклювых были использованы произвольные олигонуклеотидные праймеры (табл. 2): один шестнадцатичленный (НМ-13) и десять десятичленных (ОРА-12, ОРС-02, ОРС-05, ОРС-08, OPC-I2, ОРС-16, OPD-05, OPF-12, OPF-16, OPZ-01) праймеров для крякв (обыкновенная кряква Anas platyrhynchos, пестро носая кряква A. zonorhynchd) и серой утки A. strepera; два шестнадцатичленных (ИМ-13, RM-13) и восемь десятичленных (ОРА-12, ОРС-02, ОРС-05, ОРС-08, ОРС-16, OPD-05, OPF-12, OPZ-01) праймеров для чирков (чирок-свистунок А. сгесса, клоктун A. formosa, чирок-трескунок A. querqueduld). В зависимости от праймера число амллифицированных фрагментов ДНК варьировало от 8 до 28. Каждый праймер генерировал специфическую картину PCR-продуктов с молекулярной массой от 0.2 до 2.4 т.п.н.
Почти все праймеры показали достаточно высокую степень таксоноспецифичности, Из 11 использованных праймеров только два (ОРС-08, OPF-16) не инициировали синтез маркерных фрагментов, отличающих серую утку от обоих видов крякв. Наиболее четкие отличия были получены с помощью праймеров ОРА-12 и ОРС-02 (рис. 5). Праймер ОРА-12 (рис. 5,а) амплифицировал маркерные фрагменты размером около 1600 и 460 пн у всех особей A. platyrhynchos и A. zonorhyncha, отсутствующие в геноме A.strepera. Праймер ОРС-02 (рис. 5,6) амплифицировал фрагмент размером около 1610 и 440 пн у A. platyrhynchos и А. zonorhyncha, и фрагменты размером 1320 и 1110 п.н. у A. strepera. В то же время ни один из использованных праймеров не позволял дискриминировать обыкновенную крякву от пестроносой кряквы. RAPD-спектры этих видов характеризовала высокая изменчивость на фоне полного отсутствия каких-либо фиксированных межвидовых различий. RAPD-спектры трех видов чирков заметно различались между собой, хотя так же как и у крякв с серой уткой, эти различия при визуальном анализе маскировала значительная индивидуальная изменчивость (рис. 6). Практически все праймеры амплифицировали маркерные видоспецифичные фрагменты различного молекулярного веса. Так, в продуктах амплификации ДНК чирков с праймерами ОРС-08, OPF-12 и OPZ-01 выделены следующие маркерные фрагменты: для А. formosa - OPF-1280o и для А. сгесса - ОРС-081440, ОРС-088зо, OPF-12680. Для сравнения трех видов чирков удобно также использовать фрагменты, отсутствующие в амплификатах одного из видов. Например, присутствие OPF-1246o
На основании данных RAPD-спектров, полученных в результате амплификации с произвольными праймерами, были построены бинарные матрицы присутствия-отсутствия признаков, содержавшие информацию о 270 RAPD-локусах у крякв и серой утки и 311 RAPD-локусах у трех видов чирков. Все использованные параметры генетической изменчивости и дифференциации были рассчитаны на основе бинарных матриц.
Значения параметров генетической изменчивости для обыкновенной кряквы Anas platyrhynchos, пестроносой кряквы A. zonorhyncha, клоктуна А. formosa и чирка-свистунка А. сгесса представлены в таблице 3. Маленькие выборки серой утки A. strepera (п 3) и чирка-трескунка A. quequedula (п=1) не позволили оценить генетическую изменчивость этих видов.
Самые высокие значения параметров генетического разнообразия отмечены у обыкновенной кряквы A. platyrhynchos (Р=68.89%, Не=0,1338, 1=0.2155±0.2267). Однако, в целом, различия между исследованными видами по всем параметрам, за исключением полиморфизма (Р), невелики и находились в пределах ошибки. Можно также отметить прямо пропорциональную зависимость между величиной выборки и значениями параметров генетической изменчивости.
Средние значения внутривидовых генетических дистанций для обыкновенной кряквы A, platyrhynchos D=0.356 (0.159-0.526) и пестроносой кряквы A. zonorhyncha D=0.377 (0.220-0.605) были очень близки, а среднее значение межвидовых дистанций этих двух видов лишь незначительно превышало их внутривидовые значения D=0.401 (0.258-0.663) (табл. 4).
Средние значения внутривидовых дистанций клоктуна и чирка-свистунка были несколько выше, чем таковые крякв D=0.408 (A .formosa) и D=0.456 (А. сгесса) (табл. 5). Межвидовые генетические дистанции всех пар видов (табл. 4-5) кроме пары обыкновенная кряква / пестроносая кряква превышали внутривидовые в полтора и более раза, находясь в диапазоне от 0.668 (A. strepera (A. platyrhynchos) до 0.971 {A. formosa і A. quequedula).
На основе матрицы генетических дистанций были построены гистограммы распределения генетических дистанций (D) для двух пар сравниваемых видов: обыкновенной A, platyrhynchos и пестроносой крякв A. zonorhyncha; чирка-свистунка А. сгесса и клоктуна A. formosa (рис. 7). Распределение внутривидовых генетических различий близко к нормальному распределению у всех представленных видов (W 0.975, р 0.05; As 0.17, Ех 0.45, а=5%) за исключением пестроносой кряквы A. zonorhyncha (W=0.90, р—0.1; As=0.495, Ех=-1.12, ос=5%). Распределение межвидовых генетических дистанций крякв смещено в область более низких значений D по отношению к таковым чирков. Распределение суммарных генетических дистанций чирков представляет собой два хорошо дифференцированных пика соответствующих внутривидовым и межвидовым значениям. В то же время, у пары черная и обыкновенная кряква второй пик, соответствующий межвидовым генетическим дистанциям, отсутствует.
Значения параметров генетической дифференциации видов в группах I) крякв и серой утки и 2) чирков представлены в таблицах 6 и 7, соответственно. Низкую генетическую дифференциацию обыкновенной A. platyrhynchos и пестроносой A. zonorhyncha крякв подтверждают все показатели. Генное разнообразие сосредоточено главным образом внутри этих видов, а не между ними - Dst = 0.0148, тогда как при сравнении обоих видов с серой уткой Dst значительно повышается (Dst 0.06). Коэффициент генетической дифференциации крякв также имеет низкое значение Gst = 0.1053. Существенный генный поток (Nm = 4.25) был обнаружен только между A. platyrhynchos и A. zonorhyncha, У пар обыкновенная кряква / серая утка и пестроносая кряква / серая утка Gst находился в диапазоне значений 0.372-0.437, a Nm варьировал от 0.64 до 0.85. Точный тест на дифференциацию достоверно различает крякву и пестроносую крякву от серой утки, х1 = 687.3, df = 540, р= 0.00 и %2 = 526.9, df = 540, р = 0.003, соответственно, и показывает отсутствие генетической дифференциации обыкновенной и пестроносой крякв у? = 288.3, df = 540, р= 1.00.
Гибридизация между обыкновенной и пестроносой кряквами
Кряква обыкновенная Anas platyrhynchos - это единственный вид из группы крякв, который характеризуется ярко выраженным половым диморфизмом и имеет голарктическое распространение. Остальные 13 видов являются частично или полностью мономорфными и имеют более ограниченные ареалы (Omland, 1997; McCracken et al., 2001). К тому же, обыкновенная кряква хорошо известна своей склонностью к гибридизации с остальными видами группы, например, с черной австралийской уткой A. supercilhsa в Австралии (Braithwaite, Miller, 1975) и Новой Зеландии (Gillespie, 1985; Rhymer et al., 1994), с крапчатой уткой A. fulvigula, черной американской уткой A. rubripes, и мексиканской уткой A. diazi в Северной Америке (Johnsgard, 1967; Mazourek, Gray, 1994), с гавайской уткой A. wyvilliana на Гавайях (Brown et al., 1993). Гибридизация происходит в случае наложения гнездовых ареалов близкородственных видов, обусловленного симпатрией, интродукцией обыкновенной кряквы, в частности, в Австралию и Новую Зеландию, или естественным изменением границ ареала одного из видов.
Китайская пестроносая кряква Anas zonorhyncha — один из 13 мономорфных видов группы крякв. В настоящее время гнездовой ареал пестроносой кряквы простирается от западного берега оз. Байкал до южного Сахалина и включает большую часть Японии, Кореи и северо-восточного Китая (рис. 22). По мнению Скрябина (1963) в течение последних 60-70 лет граница ареала пестроносой кряквы продвинулась приблизительно на 500 км в северо-западном направлении, что и привело, в частности, к гнездованию A, zonorhyncha в Восточной Сибири. Предполагается, что причиной расширения ареала пестроносой кряквы послужило потепление климата в приполярных областях северного полушария (Скрябин, 1963), но нельзя исключать также и антропогенный фактор. В то же время Тачановский (Taczanowski, 1893) обнаружил пестроносую крякву в юго-восточном Забайкалье еще в 1865-1870 гг. В Приморском крае пестроносая кряква ранее была обычна только в заливе Посьет (Шульпин, 1936), однако позднее A. zonorhyncha стала одной из многочисленных уток гнездящихся в районе озера Ханка (ПолИванова, 1971). В настоящий момент гнездовой ареал китайской пестроносои кряквы A.zonorhyncha накладывается на ареал обыкновенной кряквы А, platyrhynchos в юго-восточной Сибири, на юге Российского Дальнего Востока, северной Японии и северо-восточном Китае (рис. 22).
Из литературных источников известно о нескольких фенотипических гибридах A. platyrhynchos х A, zonorhyncha, встреченных на юге Дальнего Востока, в Китае и Японии. Так, были встречены и описаны четыре гибрида в окрестностях Гонконга (Melville, 1997), два рядом с Токио (Brazil, 1991; Kanouchi et ai., 1998), и три на юге Приморского края, два из которых в окрестностях озера Ханка (Глущенко, Шибнев, 1993; Шибнев, Глущенко, 2001; Zhuravlev et al. 2002). Т.Мориока (Т. Morioka, личн. сообщ., цит. по Melville, 1997) также утверждает, что гибриды достаточно регулярно, хотя и нечасто, встречаются в Японии. Зимой 2003 г. Ю.Н.Журавлев наблюдал несколько гибридов в районе Нагой, Япония (личн. сообщ.).
Все известные гибриды, включая и гибрида, описанного нами, отличались друг от друга морфологически (Brazil, 1991; Глущенко, Шибнев, 1993; Melville, 1997; Kanouchi et al., 1998; Шибнев, Глущенко, 2001; Zhuravlev et al. 2002). Хотя ряд признаков обоих родительских видов был обнаружен практически у всех гибридных особей. К наиболее часто встречаемым признакам, имеющим унаследованным от обыкновенной кряквы, можно отнести: блестяще-металлическую зеленую окраску перьев на боках, верхушке головы или на затылке, "завиток" на рулевых перьях, коричневую окраску нижней части шеи и зоба. Реже встречались следующие признаки обыкновенной кряквы: широкая белые полоса, окаймляющие сверху "зеркальце", светло-коричневая окраска боков тела. От пестроносои кряквы гибридам всегда передавались; "бровь", черные полосы на боках головы, желтовато-оранжевая вершинная часть клюва. Таким образом, окраской тела гибриды чаще бывают похожи на крякву, а окраской головы и клюва (за исключением затылка с блестящими зелеными перьями) на пестроносую крякву. Некоторые признаки отсутствовали у родительских видов, т.е. были новыми: черные пятна на зобе и груди, разноцветный клюв и т.д. Также были описаны промежуточные признаки, например бледное серое кольцо вокруг шеи (у обыкновенной кряквы оно белое, у пестроносои кряквы его нет). Но многие обнаруженные новые и промежуточные признаки у описанных гибридных особей не совпадали.
Наследование морфологических признаков в случае гибридизации обыкновенной кряквы с американской черной уткой A, rubripes, другим близкородственным видом из группы крякв, напоминает гибридизацию обыкновенной с пестроносои кряквой тем, что у гибридов обязательно присутствуют такие признаки обыкновенной кряквы как зеленая окраска перьев головы, "завиток" на рулевых перьях, коричневая окраска нижней части шеи и зоба. И так же как от пестроносои, от американской черной утки гибридам передается окраска клюва (Bigelow, 1907). При гибридизации обыкновенной кряквы с шилохвостью A. acuta и со свиязью A. penelope окраска клюва также передавалась не от обыкновенной кряквы, а от гибридизующего с ней вида, т.е. шилохвости и свиязи, а зелень на голове, коричневая окраска нижней части шеи и зоба, завиток" на рулевых перьях были как у обыкновенной кряквы (Beyer, 1900; Bigelow, 1907; Кошелев, Лобков, 1998). Таким образом, можно сделать вывод об определенной схеме наследования таких признаков как окраска клюва, головы, нижней части шеи и зоба и "завитков" на рулевых перьях, при гибридизации обыкновенной кряквы с другими видами уток.
Необходимо отметить, что все встреченные или добытые гибриды оказывались самцами. Это характерно для большинства гибридов утиных (Серебровский, 1935; Дементьев, 1939; Kolbe, 1981) и обусловлено скорее трудностью идентификации гибридных самок, подавляющее большинство которых практически неотличимо от одного из родительских видов, чем нежизнеспособностью самок как гетерогаметного пола согласно правилу Холдеина (Johnsgard, 1967).